地桿菌α-L-巖藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-巖藻糖基乳糖中的應(yīng)用

史 然，張登婭，谷懿寰，江正強(qiáng)，楊紹青*

（中國輕工食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

人乳寡糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是人乳中一系列結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不可消化的碳水化合物總稱，在嬰幼兒生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。HMOs在人乳中質(zhì)量濃度約為5～24 g/L，是僅次于脂肪和乳糖的第3大類固形物[2]，其中2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）（圖1）是HMOs中的最主要成分之一[3]。研究表明，2’-FL具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、抗病原菌黏附、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和修復(fù)等多種功能活性[3]。目前，2’-FL已經(jīng)在美國和歐盟獲得批準(zhǔn)可作為食品原料添加到嬰幼兒奶粉、膳食補(bǔ)充劑和醫(yī)療食品中[4]。

圖1 2’-FL的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of 2’-FL

2’-FL的制備主要有化學(xué)合成、全細(xì)胞合成和酶催化合成法[4-5]，其中酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、產(chǎn)物易于純化等優(yōu)點(diǎn)，具有較好的發(fā)展前景[6-8]。α-L-巖藻糖苷酶（EC 3.2.1.51）能夠催化巖藻糖苷鍵的水解，在特定條件下也能夠催化轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)合成巖藻糖苷鍵[8]，因而在酶法合成巖藻糖基寡糖中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8-10]。α-L-巖藻糖苷酶來源廣泛，特性各異，其中適用于2’-FL合成的α-L-巖藻糖苷酶主要以微生物來源為主，且主要集中于細(xì)菌種屬，如地桿菌（Pedobactersp.）[11]、芽孢桿菌（Paenibacillussp.）[12]和熱袍菌（Thermotogasp.）等[13]，真菌來源相對較少，如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）等[14]。雖然目前已有一些α-L-巖藻糖苷酶合成2’-FL的研究報(bào)道，但是受限于α-L-巖藻糖苷酶的催化特性，反應(yīng)產(chǎn)物成分復(fù)雜、轉(zhuǎn)化率低等問題仍然亟待解決[9-10]。蛋白質(zhì)工程是提高酶學(xué)性質(zhì)的有效手段，近年來已成功用于不同類型酶的分子改造中[15]。目前關(guān)于α-L-巖藻糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性和區(qū)域選擇性等方面的分子改造多采用理性或半理性設(shè)計(jì)的方法[16-17]，采用定向進(jìn)化技術(shù)用于提高α-L-巖藻糖苷酶合成2’-FL轉(zhuǎn)化率的研究報(bào)道相對較少，僅見Osanjo等[18]采用定向進(jìn)化技術(shù)對海棲熱袍菌（T.maritima）α-L-巖藻糖苷酶進(jìn)行突變和篩選，得到突變酶的轉(zhuǎn)糖苷活性從7%提高至60%。

地桿菌CAU209是由本實(shí)驗(yàn)室研究人員從土壤中自行分離并保藏的1 株細(xì)菌。本團(tuán)隊(duì)前期從該菌株基因組中發(fā)掘出一個(gè)地桿菌α-L-巖藻糖苷酶（PbFuc29A1）（GenBank登錄號：MN902190），并應(yīng)用于2’-FL和3’-FL的合成，轉(zhuǎn)化率分別為14.5%和70.5%。由于其合成2’-FL的轉(zhuǎn)化率較低[11]，本研究擬采用定向進(jìn)化技術(shù)進(jìn)一步對PbFuc29A1進(jìn)行分子改造，以提高其合成2’-FL的效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶 New England Biolabs公司；Escherichia coliDH5α 上海唯地生物技術(shù)有限公司；引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母膏、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）美國Inalco公司；β-半乳糖苷酶（7 500 LAU/g）美國Novozymes公司；2-氯-4-硝基苯基-α-L-巖藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）愛爾蘭Megazyme公司；薄層層析色譜（thin layer chromatography，TLC）硅膠板Silica gel 60 F254、β-D-乳糖美國Sigma公司；2’-FL、3-FL 法國Elicityl公司；3’-FL采用之前的方法自制[11]。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler Thermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、Power Pac BasicTM型電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-II超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝科器研究所；3K15臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；1260高效液相色譜儀（配套示差折光檢測器） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1α-L-巖藻糖苷酶隨機(jī)突變體文庫的構(gòu)建

采用不同濃度的Mg2+（3、5 mmol/L）和Mn2+（0.1、0.2、0.4 mmol/L）對α-L-巖藻糖苷酶基因（PbFuc29A1）進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增[19]。根據(jù)PbFuc29A1的基因序列設(shè)計(jì)引物為F：5’-TGCCGCGCGGCAGCC ATATGGCTAGCATGAAGAAACTCATCCTAATAGGC CT-3’；R：5’-TGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTC CTATCCAATCTCCAAAACAATCACC-3’。PCR體系為50 μL：1×FastPfuDNA聚合酶緩沖液、0.2 mmol/L dATP和dGTP、1 mmol/L dCTP和dTTP、引物0.2 μmol/L、模板DNA 20 ng、FastPfuDNA聚合酶2.5 U。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，變性-退火-延伸共35 個(gè)循環(huán)；終延伸5 min。

使用膠回收試劑盒切膠回收易錯(cuò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶NheI和SacI分別對載體pET-28a和基因的膠回收產(chǎn)物進(jìn)行消化（37 ℃消化5 h），用DNA清潔回收試劑盒回收酶切后的載體和基因，利用T4 DNA連接酶連接回收的基因與線性化載體，16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，涂布于LB固體平板（含50 μg/mL卡納霉素）上構(gòu)建突變體文庫。

1.3.2α-L-巖藻糖苷酶隨機(jī)突變體文庫的篩選

1.3.2.1 初篩

初篩參照邵澤香等[20]的方法并略有修改。在96 孔板中加入100 μL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納霉素），用牙簽逐個(gè)挑取突變菌接種至96 孔板（每板接種野生型菌株為對照），于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 h。每孔取20 μL種子液轉(zhuǎn)接至新96 孔板（每孔含180 μL LB培養(yǎng)基，50 μg/mL卡納霉素），37 ℃、180 r/min培養(yǎng)3 h后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min誘導(dǎo)16 h。在4 ℃、3 000 r/min離心20 min獲得菌體，將菌體于-80 ℃冷凍2 h后于室溫下復(fù)融，加入100 μL 10 mg/mL溶菌酶，pH 8.0、37 ℃處理30 min，再于4 ℃、3 000 r/min離心20 min，獲得上清液即為粗酶液。

粗酶活力測定：96 孔板中依次加入10 μL酶液和100 μL 2.0 mmol/LpNP-FUC溶液，在pH 5.0、35 ℃反應(yīng)30 min，每孔加入100 μL 1 mmol/L Na2CO3溶液滅活顯色，在405 nm波長處讀取OD值。篩選可檢測到酶活力（OD405nm＞0.3）的粗酶液，進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷活性測定：反應(yīng)體系中依次加入250 μL 20 mmol/LpNP-FUC、250 μL 100 mmol/L乳糖和10 μL酶液，在pH 7.0、35 ℃反應(yīng)3 h。沸水浴滅活10 min終止反應(yīng)，取適量產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，篩選出有轉(zhuǎn)糖苷活性的粗酶液。隨后在反應(yīng)產(chǎn)物中加入β-半乳糖苷酶，于37 ℃、pH 7.0反應(yīng)3 h水解剩余乳糖，沸水浴滅活10 min終止反應(yīng)，取適量產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，監(jiān)測乳糖的水解程度。調(diào)整反應(yīng)體系pH值為4.6，加入重組α-L-巖藻糖苷酶FgFCO1水解合成產(chǎn)物中的2’-FL，于40 ℃、pH 4.6反應(yīng)3 h，由于FgFCO1可特異性水解2’-FL，而不能水解3’-FL，轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物中2’-FL比例越高，水解生成的乳糖和L-巖藻糖含量越高，挑選水解程度高的突變酶為陽性克隆。

1.3.2.2 復(fù)篩

將陽性克隆以1%接種量接入10 mL LB培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡納霉素）進(jìn)行種子液培養(yǎng)，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。將種子液以1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至菌體OD600nm至0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，20 ℃、180 r/min誘導(dǎo)16 h。4 ℃、10 000 r/min離心10 min收集菌體，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，菌液于冰水浴中超聲破碎（200 W，超聲3 s，間歇4 s，120 次），4 ℃、10 000 r/min離心20 min，獲得上清液即為粗酶液。

轉(zhuǎn)糖苷活性復(fù)篩：以10 mmol/L pNP-FUC作為巖藻糖基供體、50 mmol/L乳糖為受體，加入上述α-L-巖藻糖苷酶粗酶液（0.5 U/mL），在pH 7.0、35 ℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)產(chǎn)物煮沸10 min滅活，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。挑選轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物中2’-FL轉(zhuǎn)化率升高的突變體進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3α-L-巖藻糖苷酶突變體（mPbFuc29A1）表達(dá)和純化

菌體的培養(yǎng)、誘導(dǎo)產(chǎn)酶、酶液的提取與純化參照Shi Ran等[11]的方法進(jìn)行。

1.3.4 mPbFuc29A1酶活力和蛋白濃度測定

α-L-巖藻糖苷酶活力測定[21]：反應(yīng)體系加入100 μL 10 mmol/LpNP-FUC、100 μL 0.05 mol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液（pH 5.0）和10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在35 ℃反應(yīng)20 min，加入200 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)并振蕩均勻。取200 μL加入96 孔板，測定405 nm波長處OD值。以對硝基苯酚（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP）為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力定義：在40 ℃、pH 5.0每分鐘催化pNP-FUC水解生成1 μmolpNP所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

使用Lowry法測定蛋白濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[22]。

1.3.5 mPbFuc29A1的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 mPbFuc29A1的最適pH值和pH值穩(wěn)定性

將mPbFuc29A1分別用50 mmol/L不同pH值的緩沖液（檸檬酸-檸檬酸三鈉，pH 3.0～5.5；磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉，pH 6.0～8.0；Gly-NaOH，pH 8.5～10.5）稀釋，然后在40 ℃測定α-L-巖藻糖苷酶活力，以酶活力最高點(diǎn)作為100%作圖。

pH值穩(wěn)定性測定：使用以上不同pH值的緩沖液和磷酸氫二鈉-氫氧化鈉（pH 11.0～12.0）稀釋mPbFuc29A1，將稀釋好的酶液在30 ℃處理1～8 h，每隔1 h取樣并迅速置于冰水浴中孵育30 min，在pH 5.0、40 ℃測定mPbFuc29A1的殘余酶活力，以未處理酶液的酶活力作為100%作圖。

1.3.5.2 mPbFuc29A1的最適溫度和溫度穩(wěn)定性

用50 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液將mPbFuc29A1稀釋適當(dāng)倍數(shù)，然后分別在20～50 ℃和pH 5.0條件下測定α-L-巖藻糖苷酶活力，以酶活力最高點(diǎn)為100%作圖。

溫度穩(wěn)定性測定：用50 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液將純酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，分別在30～50 ℃處理0～8 h，定時(shí)取樣并迅速置于冰水浴中冷卻30 min，在pH 5.0、40 ℃條件下測定mPbFuc29A1的殘余酶活力，以未處理酶的酶活力為100%作圖。

1.3.5.3 mPbFuc29A1的底物特異性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)

分別以5 mmol/LpNP-FUC、2’-FL、3-FL和3’-FL為底物，測定mPbFuc29A1酶活力，計(jì)算mPbFuc29A1對各種底物的比活力和相對酶活力。反應(yīng)體系中加入100 μL含10 mmol/L巖藻糖的pNP-FUC或其他底物、100 μL 50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸緩沖液和10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在40 ℃、pH 5.0反應(yīng)20 min，最后加熱煮沸終止反應(yīng)。采用HPLC測定體系中L-巖藻糖的濃度。酶活力定義：在40 ℃、pH 5.0每分鐘催化底物水解生成1 μmolL-巖藻糖所需要的酶量，以pNP-FUC為底物時(shí)測定的酶活力作為100%。比活力（U/mg）為在40 ℃、pH 5.0每毫克純酶的活力單位數(shù)。

用50 mmol/L pH 5.0的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液配制0.25～0.75 mmol/L的pNP-FUC溶液，反應(yīng)體系中加入200 μL上述不同濃度的pNP-FUC、10 μL適當(dāng)稀釋的酶液，在40 ℃、pH 5.0反應(yīng)5 min，測定酶的初始酶活力。采用GraphPad Prism7.0軟件計(jì)算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

1.3.6 2 ’-FL和3’-FL的酶法合成

1.3.6.1 合成條件優(yōu)化

以合成產(chǎn)物中2’-FL含量為優(yōu)化目標(biāo)，對mPbFuc29A1合成2’-FL的反應(yīng)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，包括反應(yīng)溫度（20～50 ℃）、pH值（5.0～9.0）、加酶量（0.25～2.0 U/mL）、反應(yīng)時(shí)間（0～5 h）和乳糖濃度（0.1～1.0 mol/L）。所有樣品煮沸10 min終止反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后采用HPLC分析。

1.3.6.2 2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖的定量

采用HPLC法定量分析。色譜條件：Waters XBridge氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（72∶28，V/V），流速為0.5 mL/min，柱溫45 ℃，示差折光檢測器溫度為35 ℃。

產(chǎn)物的定量：以2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)品，建立2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖含量與相應(yīng)HPLC信號峰面積之間的關(guān)系曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)物中2’-FL、3’-FL和L-巖藻糖的含量。2’-FL和3’-FL轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

1.3.7 mPbFuc29A1的序列分析、定點(diǎn)突變和三維結(jié)構(gòu)模擬

將篩選到的陽性突變體α-L-巖藻糖苷酶基因（mPbFuc29A1）測序后，與野生型基因（PbFuc29A1）進(jìn)行序列比對分析，確定陽性克隆突變位點(diǎn)。根據(jù)突變位點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)兩個(gè)單點(diǎn)突變體，Glu266Lys和Asp21Val。對突變體轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物組成進(jìn)行HPLC分析，確定關(guān)鍵氨基酸。

以擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）α-L-巖藻糖苷酶（PDB登錄號：2wvs）為模板（同源性29.9%），在SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）上進(jìn)行建模，生成PbFuc29A1模擬結(jié)構(gòu)圖，根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)信息對突變位點(diǎn)進(jìn)行分析。利用PyMOL軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用和突變位點(diǎn)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism7.0軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-L-巖藻糖苷酶突變文庫的高通量篩選

通過調(diào)整PCR體系中Mg2+或者M(jìn)n2+濃度獲得具有合適突變率的文庫是常規(guī)手段[9]。采用不同濃度的Mg2+（3、5 mmol/L）和Mn2+（0.1、0.2、0.4 mmol/L）對α-L-巖藻糖苷酶基因（PbFuc29A1）進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，每組突變庫隨機(jī)挑選12株菌落測序計(jì)算突變率，發(fā)現(xiàn)采用5 mmol/L Mg2+和0.2 mmol/L Mn2+構(gòu)建文庫的突變率為0.295%，在合理突變率范圍內(nèi)[20]。初篩得到524 個(gè)突變體可檢測到α-L-巖藻糖苷酶活力，水解物經(jīng)TLC分析，發(fā)現(xiàn)有129 個(gè)突變體具有轉(zhuǎn)糖苷活性。進(jìn)一步篩選出6 株轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物能夠明顯被α-L-巖藻糖苷酶FgFCO1水解的突變體。最終得到1 個(gè)轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物中2’-FL含量明顯升高的正向突變體酶（圖2），命名為mPbFuc29A1。

圖2 地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1及突變體mPbFuc29A1轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物HPLC分析圖Fig.2 HPLC analysis of the transglycosylation reaction products from PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

2.2 mPbFuc29A1的表達(dá)及純化

經(jīng)過Ni-IDA親和層析柱一步純化，得到mPbFuc29A1的電泳級純酶（圖3），該酶的純化倍數(shù)為3.41，回收率為47.7%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）顯示該酶的分子質(zhì)量約為50 kDa，與野生型PbFuc29A1分子質(zhì)量一致[11]。

圖3 α-L-巖藻糖苷酶突變體mPbFuc29A1純化SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the proteins during the purification process of mPbFuc29A1

2.3 mPbFuc29A1的酶學(xué)性質(zhì)

mPbFuc29A1的最適pH值為5.0（圖4A），與PbFuc29A1一致。mPbFuc29A1在pH 6.0～9.0范圍內(nèi)于30 ℃保溫8 h可保持80%以上的酶活力（圖4B）。mPbFuc29A1在pH 5.0的穩(wěn)定性較差，在pH 5.0保溫2 h，殘余酶活力降至50%；在pH 11.0保溫3 h，mPbFuc29A1完全失活，而未突變酶PbFuc29A1在pH 11.0保溫3 h的殘余酶活力仍為30%左右。因此，突變后α-L-巖藻糖苷酶的pH值穩(wěn)定性有所下降。mPbFuc29A1的最適溫度為40 ℃（圖4C），在30 ℃和35 ℃保溫8 h、在40 ℃保溫4 h可保持80%以上的酶活力，在40 ℃保溫8 h可保持60%以上的酶活力，在45 ℃保溫0.5 h可保持75%左右的酶活力，超過0.5 h酶活力迅速下降（圖4D）。而未突變酶PbFuc29A1在30、35 ℃和40 ℃保溫8 h可保持80%以上的酶活力，在45 ℃保溫2 h可保持60%左右的酶活力。因此，突變后的α-L-巖藻糖苷酶的溫度穩(wěn)定性也有所下降。

圖4 mPbFuc29A1的最適pH值（A）、pH值穩(wěn)定性（B）、最適溫度（C）和溫度穩(wěn)定性（D）Fig.4 Optimal pH (A), pH stability (B), optimal temperature (C), and thermostability (C) of mPbFuc29A1

2.4 mPbFuc29A1的底物特異性和動(dòng)力學(xué)常數(shù)

如表1所示，突變酶mPbFuc29A1水解pNP-FUC和3’-FL的比活力分別為20.30 U/mg和4.72 U/mg，與PbFuc29A1相比，分別降低了22.8%和52.5%；此外，mPbFuc29A1水解2’-FL的比活力提高到約3 倍，為11.70 U/mg。

表1 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1底物特異性Table 1 Substrate specificity of PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

如表2所示，mPbFuc29A1對pNP-FUC的Vmax值為25.1 μmol/（min·mg），較PbFuc29A1略有降低，Km值為0.39 mmol/L，小于PbFuc29A1的Km值（0.72 mmol/L）。

表2 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of PbFuc29A1 and mPbFuc29A1

2.5 2’-FL和3’-FL的合成

對mPbFuc29A1合成3’-FL和2’-FL的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，溫度、pH值、加酶量、反應(yīng)時(shí)間和乳糖濃度對3’-FL和2’-FL的合成均有顯著影響（圖5）。其中，pH值對2’-FL合成的影響較為明顯，當(dāng)pH值由5.5升高至8.0時(shí)，mPbFuc29A1合成2’-FL濃度逐漸升高，而3’-FL濃度逐漸降低；當(dāng)pH值超過8.5時(shí)，3’-FL和2’-FL的轉(zhuǎn)化率均迅速下降。最終得到的mPbFuc29A1轉(zhuǎn)糖苷合成2’-FL相對最適條件為反應(yīng)溫度35 ℃、反應(yīng)pH 8.0、加酶量0.75 U/mL、反應(yīng)時(shí)間4.0 h和乳糖濃度0.7 mol/L，相對最適條件下2’-FL的轉(zhuǎn)化率為23.6%，比野生型酶提高了9.1%，3’-FL的轉(zhuǎn)化率為56.4%，2’-FL和3’-FL的總轉(zhuǎn)化率為80%。

圖5 轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)pH值（A）、加酶量（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）和乳糖濃度（D）對mPbFuc29A1合成2’-FL和3’-FL的影響Fig.5 Effects of pH (A), enzyme dosage (B), reaction time (C), and lactose concentration (D) on the synthesis of 3’-FL and 2’-FL by mPbFuc29A1

2.6 mPbFuc29A1序列分析、定點(diǎn)突變和結(jié)構(gòu)模擬

測序結(jié)果表明，α-L-巖藻糖苷酶突變基因（mPbFuc29A1）中有2 個(gè)堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致該突變體中2 個(gè)氨基酸發(fā)生改變，即Asp21Val和Glu266Lys，將PbFuc29A1和mPbFuc29A1的氨基酸序列與其他GH29家族α-L-巖藻糖苷酶進(jìn)行序列比對，發(fā)現(xiàn)Asp21和Glu266均為部分保守氨基酸。

定點(diǎn)突變酶的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物分析結(jié)果表明（表3），與野生型α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1相比，突變體Asp21Val的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物比例沒有明顯變化，而突變體Glu266Lys的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物中3’-FL的比例明顯降低，2’-FL的比例明顯升高，推測第266位谷氨酸（Glu）突變是造成PbFuc29A1轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物比例發(fā)生改變的關(guān)鍵因素。與突變體Glu266Lys相比，雙突變體Glu266Lys/Asp21Val的轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物中2’-FL的比例有進(jìn)一步提升。

表3 地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1及其突變酶轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物分析Table 3 Composition of the transglycosylation reaction products from PbFuc29A1 and its mutants

采用SWISS-MODEL對PbFuc29A1和mPbFuc29A1進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖5所示。PbFuc29A1的單體結(jié)構(gòu)由2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。N端結(jié)構(gòu)域具有類似于（β/α）8-TIM桶的折疊，主要由6 個(gè)β-片層和10 個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)組成，其中催化殘基位于TIM桶內(nèi)部。C端結(jié)構(gòu)域則包括6 個(gè)反向平行的β-片層和1 個(gè)小的α-螺旋結(jié)構(gòu)。在PbFuc29A1中，位于loop區(qū)第266位的谷氨酸（Glu）與第268位的賴氨酸（Lys）、第316位的絲氨酸（Ser）和第370位的絲氨酸（Ser）存在氫鍵相互作用，該位點(diǎn)在mPbFuc29A1中突變?yōu)橘嚢彼幔↙ys266），與周圍的氨基酸氫鍵作用減弱（圖5B）。而第21位氨基酸在突變前后，與周圍氨基酸的氫鍵作用力無明顯變化（圖5C）。此外，通過預(yù)測PbFuc29A1（圖5B）和mPbFuc29A1（圖5C）的表面電荷分布，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化后的mPbFuc29A1催化凹槽左側(cè)區(qū)域的電性由弱負(fù)電變?yōu)閺?qiáng)正，這主要是由Glu266Lys突變引起；而在催化凹槽背面的電性由強(qiáng)負(fù)變?yōu)橹行?，這主要是由Asp21Val突變引起。

圖5 α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1和mPbFuc29A1的結(jié)構(gòu)和電荷分布Fig.5 Structures and charge distributions of PbFuc29A1 and its mutants PbFuc29A1-Asp21Val and PbFuc29A1-Glu266Lys

3 討 論

目前關(guān)于提高α-L-巖藻糖苷酶的轉(zhuǎn)糖苷活性及區(qū)域選擇性的研究多采用理性或半理性設(shè)計(jì)的方法[15,17]，定向進(jìn)化技術(shù)應(yīng)用較少[18]。本研究利用易錯(cuò)PCR對地桿菌α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1進(jìn)行隨機(jī)突變，從約10 000 個(gè)突變株中獲得了一個(gè)合成2’-FL能力顯著提高的突變酶mPbFuc29A1。

mPbFuc29A1的最適pH值為5.0，明顯低于一些細(xì)菌來源的α-L-巖藻糖苷酶，如解硫胺素芽孢桿菌（Paenibacillus thiaminolyticus，pH 7.0～9.0）[23]、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenessp.pH 7.0）[24]、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）BL23（pH 7.0）[25]和福賽斯坦納菌（Tannerella forsythia，pH 7.0）[26]等。但與大部分真菌來源的α-L-巖藻糖苷酶接近，如黑曲霉（Aspergillus niger，pH 5.0）[27]、禾谷鐮刀菌（pH 4.6）[14]和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum，pH 5.5）[28]等。mPbFuc29A1的最適溫度為40 ℃，比PbFuc29A1提高了5 ℃，與大部分細(xì)菌和真菌來源的α-L-巖藻糖苷酶都接近，但明顯低于海棲熱袍菌[13]（60 ℃）和產(chǎn)堿桿菌[24]（50 ℃）來源的α-L-巖藻糖苷酶。值得注意的是，與PbFuc29A1相比，mPbFuc29A1的底物特異性發(fā)生顯著變化，對pNP-FUC和3’-FL的比活力顯著降低，但是對2’-FL的比活力升高到3 倍左右。一般來說，α-L-巖藻糖苷酶的底物特異性與其轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物組成相關(guān)[14,25]。因此，mPbFuc29A1底物特異性的變化可能會導(dǎo)致其轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物的變化。此外，mPbFuc29A1的Km值（0.39 mmol/L）小于PbFuc29A1（0.77 mmol/L），表明突變酶對pNP-FUC的親和力增強(qiáng)，但該酶對pNP-FUC的比活力卻沒有升高。

目前，已有一些具有轉(zhuǎn)糖苷活性的α-L-巖藻糖苷酶被用于2’-FL的合成。本研究中，mPbFuc29A1合成2’-FL的轉(zhuǎn)化率最高為23.6%，與PbFuc29A1比較提高了9.1%，高于芽孢桿菌（13%）[12]和禾谷鐮刀菌（14%）[14]來源α-L-巖藻糖苷酶，與α-L-巖藻糖苷酶突變體FgFCO1-D286H相當(dāng)（23%）[15]，但是低于海棲熱袍菌α-L-巖藻糖苷酶（32.5%）[13]。mPbFuc29A1合成3’-FL的轉(zhuǎn)化率為56.4%，合成2’-FL和3’-FL的總轉(zhuǎn)化率為80%，在2’-FL的合成中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

近年來，柔性loop區(qū)對糖苷水解酶催化活性的影響越來越引起廣泛關(guān)注[29]。GH29家族α-L-巖藻糖苷酶呈現(xiàn)典型口袋拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)，活性口袋內(nèi)部的氨基酸配體是嚴(yán)格保守的，但位于催化口袋周圍的loop環(huán)會影響催化口袋的形狀[30]。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，至少2 條loop環(huán)會參與酶的催化過程，且loop區(qū)在酶與底物結(jié)合后會發(fā)生變化[31-32]。因此，對α-L-巖藻糖苷酶催化口袋附近loop環(huán)區(qū)的氨基酸進(jìn)行改造也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，對一些糖苷水解酶的loop區(qū)進(jìn)行分子改造可提高酶的轉(zhuǎn)糖苷活性，如克氏錐蟲（Trypanosoma cruzi）轉(zhuǎn)唾液酸苷酶[32]和兩歧雙歧桿菌α-L-巖藻糖苷酶[17]等的改造。Loop區(qū)影響酶的轉(zhuǎn)糖苷活性的機(jī)制可能有3 種：1）使催化口袋形成封閉的拓補(bǔ)結(jié)構(gòu)；2）在催化活性中心入口處形成疏水環(huán)境；3）阻塞通往催化活性位點(diǎn)的水通道[17]。本研究中，α-L-巖藻糖苷酶PbFuc29A1位于loop環(huán)區(qū)第266位氨基酸由谷氨酸（Glu）突變?yōu)橘嚢彼幔↙ys），是酶催化活性發(fā)生改變的關(guān)鍵，改變了該酶對pNP-FUC、3’-FL和2’-FL的比活力。同時(shí)，該酶合成2’-FL轉(zhuǎn)化率提高，合成3’-FL的轉(zhuǎn)化率降低，但總轉(zhuǎn)化率仍高達(dá)80%。這可能是由于Glu266Lys氨基酸位點(diǎn)的變化降低了loop區(qū)與周圍氨基酸的氫鍵作用力，改變了酶的催化口袋的形狀，進(jìn)一步改變了該酶的最適溫度和底物特異性等酶學(xué)性質(zhì)[18,29-32]，增強(qiáng)了該酶在轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)中對α-1,2-糖苷鍵的區(qū)域選擇性，進(jìn)一步提高了該酶合成2’-FL的效率。

4 結(jié) 論

利用定向進(jìn)化技術(shù)成功將地桿菌α-L-巖藻糖苷酶（PbFuc29A1）進(jìn)行改造，使其合成2’-FL的轉(zhuǎn)化率從14.5%提高到23.6%。mPbFuc29A1水解2’-FL的比活力提高到3 倍左右，但是對pNP-FUC和3’-FL的比活力明顯降低。mPbFuc29A1中有2 個(gè)氨基酸發(fā)生替換，分別是Asp21Val和Glu266Lys，其中位于loop區(qū)的Glu266Lys是導(dǎo)致mPbFuc29A1c底物特異性和轉(zhuǎn)糖苷產(chǎn)物發(fā)生改變的關(guān)鍵。mPbFuc29A1在合成2’-FL中具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。