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    羅非魚魚糜自然發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)對其品質(zhì)形成的影響

    2021-09-28 03:27:16李春生王悅齊陳勝軍李來好
    食品科學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:魚糜白度羅非魚

    趙 躍,李春生*,王悅齊,陳勝軍,李來好*,黃 卉

    (1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510300)

    羅非魚(Tilapia)是我國南方最主要的淡水養(yǎng)殖品種之一,憑借生長速度快、繁殖量大、容易養(yǎng)殖、產(chǎn)量高等特點(diǎn),逐漸成為全球關(guān)注的淡水養(yǎng)殖魚類[1]。2019年我國羅非魚的總產(chǎn)量達(dá)到164.2萬 t,較2018年產(chǎn)量提高了1.05%[2]。近幾年,我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球羅非魚總產(chǎn)量的近50%[3]。目前,羅非魚加工產(chǎn)品形式單一,大部分加工成魚片出口,精深加工產(chǎn)品少,產(chǎn)品附加值低[4]。因此,合理利用羅非魚資源,開發(fā)切實(shí)有效的加工技術(shù),已成為我國羅非魚產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。魚糜加工是目前國內(nèi)外發(fā)展較快的魚制品加工方式。魚糜制品具有高蛋白、低脂肪、口感嫩爽、食用方便等特點(diǎn),并且產(chǎn)量逐年增加。由于海水魚魚糜具有良好的凝膠特性,市場上魚糜制品的生產(chǎn)原料多采用海水魚[5]。研究發(fā)現(xiàn),羅非魚魚肉中鹽溶性蛋白含量低,應(yīng)用傳統(tǒng)魚糜加工方式加工形成的魚糜制品凝膠強(qiáng)度差,極大地限制了羅非魚魚糜加工的應(yīng)用[4]。因此提高羅非魚魚糜凝膠強(qiáng)度,開發(fā)高品質(zhì)羅非魚魚糜制品,已成為羅非魚魚糜加工亟待解決的關(guān)鍵問題。

    利用微生物發(fā)酵技術(shù)提高淡水魚魚糜品質(zhì)是目前研究的熱點(diǎn)。發(fā)酵魚糜一般使用乳酸菌作為發(fā)酵劑,依靠快速降低的pH值促進(jìn)魚肉凝膠化,抑制有害微生物的生長[6-7]。同時(shí),乳酸菌發(fā)酵作用使魚糜的蛋白質(zhì)、脂肪或碳水化合物發(fā)生不同變化,形成其特有的風(fēng)味與口感[8]。國內(nèi)外對發(fā)酵魚糜的研究主要集中于利用市售的乳酸菌等微生物菌種作為發(fā)酵劑,分析加菌發(fā)酵對魚糜品質(zhì)和風(fēng)味等相關(guān)理化指標(biāo)的影響。楊方[9]利用Lactobacillus plantarum發(fā)酵鰱魚魚糜,建立發(fā)酵魚糜體系和酸性模擬體系,探討魚肉內(nèi)源酶對發(fā)酵魚糜凝膠特性的影響。Liu Zhongyi等[6]利用L.casei、Streptococcuslactis、Saccharomyces cerevisiae和Monascus anka混合發(fā)酵鳙魚魚糜,結(jié)果發(fā)現(xiàn)加菌發(fā)酵后的魚糜在味道和外觀上都優(yōu)于未加菌的對照組。王洋等[7]利用L.pentosus、L.plantarum、Staphylococcus sciuri、Staphylococcus xylosus等復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵鱘魚魚糜,其產(chǎn)品具有優(yōu)良的感官品質(zhì)和理化特性。然而,目前發(fā)酵魚糜研究主要集中鰱魚、鳙魚、草魚、鱘魚等淡水魚,對羅非魚魚糜發(fā)酵過程品質(zhì)變化的研究鮮見相關(guān)報(bào)道。

    發(fā)酵魚糜一般采用添加單菌或復(fù)合菌劑的方式進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn),然而由于魚糜原料中微生物菌群比較復(fù)雜,實(shí)際的魚糜品質(zhì)形成過程是由復(fù)雜的微生物菌群代謝活動引起。明確發(fā)酵魚糜復(fù)雜微生物群落的結(jié)構(gòu)及其功能調(diào)控是實(shí)現(xiàn)發(fā)酵魚糜產(chǎn)業(yè)升級的重要環(huán)節(jié)。然而,目前絕大部分研究并未考慮微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝活動對發(fā)酵魚糜品質(zhì)的影響。而且,由于不同淡水魚魚糜中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)差異較大,盲目使用微生物發(fā)酵劑不僅不會改善魚糜品質(zhì),而且會與原料自身優(yōu)勢菌群發(fā)生競爭性抑制,大大降低發(fā)酵魚糜的品質(zhì)。因此,如何篩選適用于特定淡水魚魚糜的功能微生物是發(fā)酵魚糜研究的難點(diǎn)。目前,基于16S/18S/ITS的二代高通量測序技術(shù)已較為普遍地應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物菌群多樣性研究。朱雯娟等[10]利用16S rRNA高通量測序技術(shù)對梅香魚樣品的微生物菌群進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Lactobacillus、Staphylococcus和Tetragenococcus是參與梅香魚發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌屬。Wang Zongmin等[11-12]通過16S rRNA和ITS高通量測序技術(shù),明確了Acetobacter、Lactobacillus、Enhydrobacter、Lactococcus、Gluconacetobacer、Bacillus、Staphylococcus7 個(gè)微生物菌屬是鎮(zhèn)江香醋中產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味的核心微生物菌群。利用16S rRNA高通量測序技術(shù)能夠解析羅非魚發(fā)酵魚糜中的微生物菌群,進(jìn)一步利用Pearson、主成分分析(principal component analysis,PCA)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法能夠揭示微生物菌群對發(fā)酵魚糜品質(zhì)形成的影響規(guī)律,有利于定向篩選適用于特定淡水魚魚糜的功能微生物,避免所用微生物發(fā)酵劑不合適或效果差,降低了發(fā)酵劑選擇盲目性,節(jié)省了發(fā)酵魚糜生產(chǎn)成本。

    因此,本研究以羅非魚魚糜為研究對象,利用16S rRNA高通量測序技術(shù)揭示羅非魚魚糜自然發(fā)酵過程中微生物菌群變化情況,結(jié)合羅非魚魚糜發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)、凝膠強(qiáng)度、色度等品質(zhì)變化結(jié)果,借助Pearson、PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法揭示微生物菌群對發(fā)酵魚糜品質(zhì)形成的影響規(guī)律,為定向分離篩選適用于羅非魚發(fā)酵魚糜的功能微生物、靶向改善羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì)提供一定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羅非魚、食鹽、蔗糖和葡萄糖(食品級) 廣東廣州市海珠區(qū)客村華潤萬家超市。

    PCA培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;FastDNA?Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒 美國MP Biomedicals公司;NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒 美國Bioo Scientific公司;MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒 美國Illumina公司;Biowest Agarose瓊脂糖西班牙Biowest公司;FastPfu Polymerase聚合酶 中國TransGen公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    IKA-T25組織勻漿機(jī) 德國IKA公司;CT3質(zhì)構(gòu)儀美國Brookfield公司;3K30臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司;SZ-22絞肉機(jī) 湖南省長沙固利食品機(jī)械有限公司;CR-410全自動色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)光學(xué)影像公司;QuantusTMFluorometer微型熒光劑 美國Promega公司;Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina公司;ABI GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國ABI公司。

    1.3 方法

    1.3.1 羅非魚發(fā)酵魚糜制備

    在市場購買鮮活羅非魚(500~750 g/條)后,立刻運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室,去頭、去鱗、去內(nèi)臟,取背部魚肉并用冷水沖洗,然后用絞肉機(jī)絞碎成魚糜。在低溫環(huán)境下(4 ℃),將魚糜與0.5%葡萄糖、2%食鹽、0.5%蔗糖等輔料斬拌均勻。使用手動灌腸機(jī)灌入直徑30 mm的塑料腸衣中,每根長約15 cm,然后置于30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵30 h,分別在第0、18、24、30小時(shí)取樣分析(標(biāo)記為C0、C18、C24、C30)。

    1.3.2 16 S rRNA高通量測序

    將3.0 g發(fā)酵香腸充分?jǐn)囁楹?,置?7 mL生理鹽水中充分混勻,取含菌的生理鹽水在12 000 r/min、4 ℃離心10 min,獲得菌體沉淀。16S rRNA高通量測序參照文獻(xiàn)[8]方法。采用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提,利用NanoDrop2000檢測DNA純度和濃度。采用上游引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s,27 個(gè)循環(huán);然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在10 ℃進(jìn)行保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化,用QuantusTMFluorometer進(jìn)行檢測定量,使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫,利用Illumina MiSeq PE300進(jìn)行雙末端測序。

    1.3.3 質(zhì)構(gòu)分析

    將發(fā)酵香腸切成高25 mm且切面平整的圓柱體,采用質(zhì)構(gòu)儀測定發(fā)酵魚糜的硬度、彈性、黏性、內(nèi)聚力、咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性。選用4 mm TA44平底圓柱形探頭,TA-RT-KIT夾具,測試速率1 mm/s,距離目標(biāo)值15 mm,每個(gè)樣品進(jìn)行軸向壓縮2 次,2 次下壓間隔時(shí)間1 s,觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g。每次實(shí)驗(yàn)做5 次平行,取平均值。

    1.3.4 凝膠強(qiáng)度分析

    將發(fā)酵香腸切成高25 mm且切面平整的圓柱體,采用質(zhì)構(gòu)儀分析魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度。選用壓縮模式測定香腸凝膠的破斷強(qiáng)度(g)和凹陷深度(cm),選用直徑5 mm球形探頭壓縮樣品,下壓位移設(shè)置為15 mm,觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載5 g,測試速率1 mm/s。每次實(shí)驗(yàn)做5 個(gè)平行,取平均值。凝膠強(qiáng)度按式(1)計(jì)算:

    1.3.5 色差分析

    將發(fā)酵香腸切成25 mm且切面平整的圓柱體,采用全自動色彩色差儀在457 nm波長處用標(biāo)準(zhǔn)白板對儀器進(jìn)行校對,然后測定魚糜凝膠的亮度(L*)值、紅/綠(a*)值、黃/藍(lán)(b*)值,按式(2)計(jì)算白度值(W):

    1.3.6 pH值測定

    將5.0 g發(fā)酵香腸置于45 mL超純水中勻漿,10 000 r/min離心10 min取上清液,用酸度計(jì)測定pH值。

    1.3.7 菌落總數(shù)測定

    將3.0 g發(fā)酵香腸充分?jǐn)囁楹?,置?7 mL生理鹽水中充分混勻,梯度稀釋后,涂布于PCA培養(yǎng)基上,將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    1.4.1 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

    采用Fastp(v0.19.6)軟件對16S rRNA高通量測序原始序列進(jìn)行質(zhì)控,利用Flash(v1.2.11)軟件將雙末端測序得到的成對reads進(jìn)行組裝拼接。使用UPARSE(v7.0.1090)軟件在97%相似度條件下進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類并剔除嵌合體,利用RDP classifer(v2.11)軟件比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138)進(jìn)行物種分類注釋。分別采用Mothur(v1.30.2)和QIIME(v1.9.1)軟件計(jì)算樣品的α多樣性值和β多樣性值。

    1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用單因素方差分析中的Tukey-Kramer檢驗(yàn)方法,“*”表示不同微生物菌群在不同發(fā)酵時(shí)間下菌群差異顯著(P<0.05),利用Pearson、PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析微生物菌群與發(fā)酵魚糜品質(zhì)變化的相關(guān)性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 16S rRNA高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    利用Illumina MiSeq測序技術(shù)研究羅非魚發(fā)酵魚糜微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化,如表1所示。8 個(gè)樣品共得到368 664 條序列,平均每個(gè)樣品46 083 條序列,平均長度約為428 bp。序列經(jīng)過優(yōu)化后,在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTU。8 個(gè)樣品共獲得246 種OTU,其中發(fā)酵24 h的OTU種類最多,平均值達(dá)到117 種。

    表1 羅非魚魚糜自然發(fā)酵過程中微生物16S rRNA高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of bacterial 16S rRNA gene sequencing data for tilapia surimi during natural fermentation

    2.2 羅非魚魚糜發(fā)酵過程中微生物多樣性變化

    2.2.1α多樣性分析

    α多樣性是對單個(gè)樣品中物種多樣性進(jìn)行分析,Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況,而Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則同時(shí)考慮群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。覆蓋率反映各樣本文庫的覆蓋程度,即樣本中序列被測出的概率。如表2所示,Sobs指數(shù)、Chao指數(shù)和ACE指數(shù)結(jié)果顯示,發(fā)酵到第24小時(shí),樣品中的微生物豐富度最高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)結(jié)果顯示,未發(fā)酵時(shí)物種的均勻度最高,自然發(fā)酵能降低物種的均勻度,發(fā)酵后期(24~30 h)物種的均勻度最小;所有發(fā)酵時(shí)間樣品的序列被捕獲概率均大于0.999,表明測序結(jié)果的完整度較高。

    表2 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜微生物α多樣性分析Table 2 α-Diversity analysis of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

    2.2.2 獨(dú)有和特有的OTU組成分析

    如圖1所示,4 個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)共有的微生物種類為54 種;發(fā)酵后期即發(fā)酵24 h和30 h共有微生物種類最多,達(dá)到105 種;發(fā)酵24 h時(shí),獨(dú)有的微生物種類最多,達(dá)到47 種。

    圖1 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜微生物群落Venn圖Fig.1 Venn diagram analysis of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

    2.2.3β多樣性分析

    在OTU分類水平上采用Bray-Curtis、unweighted UniFrac和weighted UniFrac距離算法比較不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜β多樣性,結(jié)果如圖2所示。Bray-Curtis的計(jì)算只考慮樣品中物種的存在情況,而不考慮序列間的進(jìn)化距離。結(jié)果顯示,平行樣品間微生物菌群差異較小,發(fā)酵18、24 h和30 h樣品的微生物菌群差異較小,而與未發(fā)酵魚糜中微生物菌群的差異較大(圖2A)。UniFrac是利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息比較不同樣品間物種群落差異,其中unweighted UniFrac不考慮物種豐度,而weighted UniFrac考慮物種豐度。在不考慮物種豐度(圖2B)和考慮物種豐度(圖2C)的情況下,其分析結(jié)果均與Bray-Curtis結(jié)果相似,平行樣品間微生物菌群差異最小,羅非魚魚糜自然發(fā)酵后(18~30 h)與未發(fā)酵魚糜的菌群差異較大。

    圖2 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜微生物菌群β多樣性熱圖Fig.2 Heatmap for β-diversity of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages

    2.3 羅非魚魚糜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化

    羅非魚魚糜在自然發(fā)酵條件下微生物菌群變化較為明顯(圖3)。在門水平上(圖3A),F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria為整個(gè)發(fā)酵過程主要微生物菌門,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,F(xiàn)irmicutes中的微生物相對含量逐漸增加,而Proteobacteria相對含量逐漸下降。這與傳統(tǒng)豬肉干制香腸[13]和自然發(fā)酵魚露[14]發(fā)酵過程門水平上微生物菌群變化結(jié)果相似。自然發(fā)酵30 h后,F(xiàn)irmicutes成為最主要微生物菌群,相對含量接近90%。

    圖3 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜微生物菌群在門(A)和屬(B)水平的相對豐度Fig.3 Relative abundance of microbial community in tilapia surimi at different fermentation stages at phylum (A) and genus (B) levels

    在屬水平上(圖3B),Lactococcus、Macrococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus等微生物菌屬在整個(gè)發(fā)酵過程中的變化具有顯著差異(P<0.05)。未發(fā)酵前羅非魚魚糜原料中Macrococcus(29.0%)、Acinetobacter(22.2%)、Lactococcus(12.6%)、Floricoccus(11.5%)、Streptococcus(6.9%)為主要微生物菌群。Lactococcus在自然發(fā)酵18 h內(nèi)的相對豐度顯著增長到64.9%,并在隨后的發(fā)酵過程中(18~30 h)相對豐度保持穩(wěn)定,因而是羅非魚發(fā)酵魚糜中主要的微生物菌屬。Lactococcus在魚茶[15]、豆腐乳[16]等其他發(fā)酵食品中也是主要的發(fā)酵菌屬。值得注意的是,Pediococcus在羅非魚魚糜原料中的相對豐度較低(0.02%),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增長迅速,發(fā)酵30 h的相對含量僅次于Lactococcus,達(dá)到13.2%。此外,Enterococcus和Lactobacillus等微生物菌屬的相對豐度也隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈增長趨勢。由此可見,Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等微生物菌屬均可適應(yīng)羅非魚魚糜發(fā)酵環(huán)境,這些微生物的代謝作用可能對發(fā)酵魚糜品質(zhì)的形成有很大的影響。

    隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,Macrococcus、Acinetobacter、Streptococcus、Floricoccus、Rothia、Enhydrobacter、Psychrobacter、Pseudomonas、Chryseobacterium等微生物菌屬的相對含量呈降低趨勢,同時(shí),Enterobacter、Citrobacter、Photobacterium、Aeromonas、Plesiomonas、Vagococcus、Vibrio在發(fā)酵18 h時(shí)呈顯著增長趨勢,但發(fā)酵后期(24~30 h)含量又逐漸下降。由此可見,這些微生物菌屬可能不適應(yīng)羅非魚魚糜的弱酸性厭氧發(fā)酵環(huán)境。Yin等[17]相關(guān)研究報(bào)道表明添加乳酸菌能顯著抑制發(fā)酵鯖魚糜中Pseudomonas、Staphylococcus和Enterobacteriaceae的生長,并在發(fā)酵12 h后即成為優(yōu)勢菌種。因此,發(fā)酵后期羅非魚發(fā)酵魚糜中有害微生物豐度的顯著降低可能與Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等乳酸菌的大量繁殖有關(guān)。

    2.4 羅非魚魚糜發(fā)酵過程中品質(zhì)特征變化

    如圖4所示,凝膠強(qiáng)度是衡量魚糜凝膠制品品質(zhì)最基本的指標(biāo)之一。一般來說,具有令人愉悅的彈性口感的凝膠強(qiáng)度在300 g·cm以上[18],而使用加熱法生產(chǎn)的羅非魚魚糜的凝膠強(qiáng)度只有200 g·cm左右[4]。本研究發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵能夠顯著提高羅非魚魚糜的凝膠強(qiáng)度,發(fā)酵18 h羅非魚魚糜的凝膠強(qiáng)度超過450 g·cm,發(fā)酵30 h超過670 g·cm。而且,利用發(fā)酵方法得到的羅非魚魚糜的凝膠強(qiáng)度也優(yōu)于加熱法生產(chǎn)的混合海水魚(馬鮫魚、海鱸魚、金鯧魚等)的羅非魚魚糜[19]。白度也是評價(jià)魚糜凝膠制品的標(biāo)準(zhǔn)之一,它直接影響消費(fèi)者對商品的可接受程度,對于魚糜制品而言,白度越高產(chǎn)品越受消費(fèi)者喜愛[20]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),自然發(fā)酵能顯著提高魚糜的白度,且發(fā)酵時(shí)間(18~30 h)對魚糜白度的影響無顯著性差異。發(fā)酵后羅非魚魚糜的白度值明顯優(yōu)于加熱法生產(chǎn)的羅非魚魚糜,且優(yōu)于海鱸魚、黃花魚、金鯧魚、紅三魚、馬鮫魚等海水魚魚糜[4]。羅非魚魚糜發(fā)酵過程中菌落總數(shù)呈逐漸上升趨勢,可能與Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等乳酸菌的大量繁殖有關(guān)。同時(shí),羅非魚魚糜的pH值在18 h內(nèi)迅速下降,發(fā)酵后期(24~30 h)則降速減緩。菌落總數(shù)和pH值變化結(jié)果與自然發(fā)酵鰱魚魚糜的結(jié)果一致[21]。pH值是影響魚糜凝膠形成的重要因素,研究表明,由于pH值的變化可以改變氨基酸殘基側(cè)鏈的電荷分布,蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)處所帶的靜電荷為0,蛋白質(zhì)分子間就失去了靜電斥力作用,使蛋白分子相互迅速聚集,使產(chǎn)品產(chǎn)生較佳的硬度與彈性[22]。本研究中,羅非魚魚糜發(fā)酵過程中pH值的下降對其凝膠強(qiáng)度的改善起著重要作用。

    質(zhì)構(gòu)特性是影響發(fā)酵香腸品質(zhì)的重要因素,優(yōu)良發(fā)酵香腸的組織結(jié)構(gòu)應(yīng)該是緊密且切片富有彈力,其中,硬度、彈性和黏性能比較好反映魚糜制品的感官適口性,是表征香腸質(zhì)地特征的重要力學(xué)參數(shù)[23]。如圖4所示,羅非魚魚糜發(fā)酵前的黏性較高,而隨著發(fā)酵的進(jìn)行,魚糜由溶膠狀態(tài)變?yōu)槟z狀組織,使其黏性逐漸下降。硬度是指第1次壓縮樣品時(shí)的壓力峰值,可衡量其熟化程度,通常是由魚肉蛋白的變性和凝膠化以及水分的損失引起。羅非魚發(fā)酵魚糜的硬度在發(fā)酵過程中始終保持增長趨勢,并在第30小時(shí)達(dá)到最大。彈性反映的是試樣在第1次壓縮形變后能夠再復(fù)原的程度;內(nèi)聚性反映形成食品形態(tài)所需內(nèi)部結(jié)合力的大小[24];咀嚼性反映了魚糜制品從咀嚼的狀態(tài)到可吞咽狀態(tài)所需要的能量,咀嚼性越高“咬感”就越好[25]。羅非魚發(fā)酵魚糜的彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性在發(fā)酵過程中的變化趨勢相同,表現(xiàn)為在發(fā)酵前18 h明顯下降并在24 h達(dá)到最大值。發(fā)酵24 h時(shí),羅非魚發(fā)酵魚糜具有更佳的硬度與彈性,此特性有助于發(fā)酵魚肉香腸被切成薄片。

    圖4 不同發(fā)酵時(shí)間羅非魚魚糜的品質(zhì)特征變化Fig.4 Changes in quality characteristic of tilapia surimi at different fermentation stages

    2.5 微生物群落結(jié)構(gòu)對羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì)特性變化的影響規(guī)律

    為研究微生物群落結(jié)構(gòu)對羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì)特性變化的影響規(guī)律,篩選相對豐度前10的菌屬(Lactococcus、Macrococcus、Acinetobacter、Enterobacter、Pediococcus、Citrobacter、Floricoccus、Streptococcus、Enterococcus、Rothia),結(jié)合發(fā)酵魚糜品質(zhì)指標(biāo)(凝膠強(qiáng)度、白度、菌落總數(shù)、pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、硬度),利用Pearson和PCA等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法研究微生物群落結(jié)構(gòu)與魚糜品質(zhì)的相關(guān)性。

    如圖5A所示,凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚糜品質(zhì)指標(biāo)之間具有顯著正相關(guān)(P<0.05),同時(shí)與菌落總數(shù)、Pediococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus、Lactococcus表現(xiàn)出正相關(guān),特別是與Lactococcus的正相關(guān)最為顯著(P<0.05),相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.907、0.980、0.957;與內(nèi)聚性、彈性和pH值以及Acinetobacter、Rothia、Floricoccus、Streptococcus、Macrococcus等菌屬具有顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),而與咀嚼性和黏性均無顯著相關(guān)。PCA作為一種多變量的相關(guān)性分析方法,已被應(yīng)用于分析中國米酒[26]和韓國Saeu-jeot[27]等發(fā)酵食品中主要的菌群與化學(xué)物質(zhì)之間的關(guān)系。本研究中,利用PCA方法比較微生物菌群與魚糜品質(zhì)的相關(guān)性,如圖5B所示。結(jié)果顯示,PCl的方差貢獻(xiàn)率為77.7%,PC2的方差貢獻(xiàn)率為9.6%,這2 個(gè)PC可以反映全部信息的87.3%,提取較為完全,說明這2 個(gè)PC能夠替代原始19 個(gè)成分反映樣品信息。結(jié)果顯示,就不同發(fā)酵階段而言,羅非魚魚糜發(fā)酵后(18、24、30 h)的樣本與魚糜原料(0 h)的差異性較大。PCA相關(guān)性分析結(jié)果與Pearson聚類結(jié)果類似,19 個(gè)成分明顯分為兩大類,一類為凝膠強(qiáng)度、白度、菌落總數(shù)、硬度、Lactococcus、Enterobacter、Pediococcus、Citrobacter、Enterococcus,另一類為pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、Macrococcus、Acinetobacter、Floricoccus、Streptococcus、Rothia,每個(gè)類別內(nèi)的成分之間呈正相關(guān),2 個(gè)類別間的成分呈負(fù)相關(guān),其中發(fā)酵過程中Lactococcus相對豐度的增加與凝膠強(qiáng)度、白度、硬度的提高以及魚糜pH值的下降相關(guān)性最為顯著(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析和PCA結(jié)果表明,羅非魚發(fā)酵魚糜中Lactococcus、Pediococcus、Enterobacter、Citrobacter、Enterococcus等產(chǎn)酸菌的代謝作用導(dǎo)致發(fā)酵魚糜的pH值逐漸下降,從而促進(jìn)了凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚糜品質(zhì)指標(biāo)的改善。

    圖5 利用Pearson(A)和PCA(B)方法分析微生物群落結(jié)構(gòu)與羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì)的相關(guān)性Fig.5 Correlation analysis of microbial community with quality indexes in fermented tilapia surimi using Pearson correlation analysis (A) and PCA (B)

    Lactobacillus、Pediococcus等乳酸菌屬經(jīng)常被用作商業(yè)發(fā)酵劑用于淡水魚魚糜發(fā)酵,有助于發(fā)酵魚糜形成良好的品質(zhì)[21,28-29]。而本研究中相對豐度最高的Lactococcus在淡水魚發(fā)酵魚糜的應(yīng)用較少。盡管Enterococcus并未列入歐盟安全合理推定和美國公認(rèn)安全認(rèn)證的安全性菌屬名單,但有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),Enterococcus是奶酪和香腸發(fā)酵過程中常見的微生物菌屬,對其品質(zhì)和風(fēng)味形成起著重要的作用[28,30]。本研究表明,Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus等乳酸菌屬,特別是Lactococcus和Pediococcus與羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì)形成密切相關(guān)。

    3 結(jié) 論

    采用16S rRNA高通量測序技術(shù)研究羅非魚魚糜自然發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性變化。羅非魚魚糜發(fā)酵過程中微生物多樣性較為豐富,并在發(fā)酵第24小時(shí)的OTU總數(shù)和獨(dú)有的種類最多,發(fā)酵18、24和30 h樣品的微生物菌群差異較小,而與發(fā)酵初期(0 h)菌群差異較大。Firmicutes和Proteobacteria為整個(gè)發(fā)酵過程主要微生物菌門,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,F(xiàn)irmicutes中的微生物相對含量逐漸增加,而Proteobacteria相對含量逐漸下降。Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Lactobacillus等微生物菌屬均可適應(yīng)羅非魚魚糜發(fā)酵環(huán)境,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而迅速增長。Lactococcus是羅非魚發(fā)酵魚糜中主要的微生物菌屬,在自然發(fā)酵18 h內(nèi)的相對豐度從12.6%顯著增長到64.9%,并在隨后的發(fā)酵過程中保持穩(wěn)定,其次是Pediococcus,發(fā)酵第30小時(shí)的相對含量達(dá)到13.2%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,凝膠強(qiáng)度、白度、硬度、菌落總數(shù)等品質(zhì)指標(biāo)逐漸增加,pH值、黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性等品質(zhì)指標(biāo)與發(fā)酵前相比有所下降。Pearson相關(guān)性分析和PCA發(fā)現(xiàn),羅非魚發(fā)酵魚糜中Lactococcus、Pediococcus、Enterococcus、Enterobacter、Citrobacter等產(chǎn)酸菌屬與凝膠強(qiáng)度、白度、硬度等關(guān)鍵魚糜品質(zhì)指標(biāo)呈正相關(guān)而與pH值呈負(fù)相關(guān),這些菌的代謝作用(特別是產(chǎn)酸特性)對于發(fā)酵魚糜品質(zhì)的形成發(fā)揮著重要作用?;诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)可以從Lactococcus、Pediococcus等乳酸菌中定向分離篩選菌株,開發(fā)適用于羅非魚魚糜的發(fā)酵劑,用于靶向改善羅非魚發(fā)酵魚糜品質(zhì),本研究結(jié)果也為其他淡水魚魚糜發(fā)酵菌株的定向篩選提供了重要技術(shù)參考。

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