Streptomyces alboflavus TD-1產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及其毒素的抑制作用

張曉君，路來風(fēng)，李淑華，王昵霏，李王強(qiáng)，王安琪，宋冠林，李貞景，王昌祿*

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

鏈霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有免疫抑制、抗癌、抗真菌及細(xì)菌等多種功能[1-2]，在植物病害、儲(chǔ)糧及飼料防霉、抑制毒素等方面具有廣泛應(yīng)用[3]。調(diào)控鏈霉菌一個(gè)重要的機(jī)制為碳分解代謝抑制。葡萄糖是一種可被快速利用的碳源，可以起到縮短菌體延滯期和促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用[4]，碳源較多的培養(yǎng)基可延緩菌絲自溶，有利于合成代謝產(chǎn)物積累，反之，碳源稀薄則會(huì)導(dǎo)致菌絲早期自溶[5]。當(dāng)碳源濃度過高，又會(huì)使許多化合物的成受阻[6]。Romero-Rodríguez等[7]發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖會(huì)抑制鏈霉菌在固體培養(yǎng)基上的孢子形成。只有在葡萄糖被消耗到一定程度，阻遏作用被解除時(shí)才開始合成次級(jí)代謝產(chǎn)物[8-9]。

微生物代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）在控制病原菌方面有巨大潛力[10]，其分子質(zhì)量低、可快速降解[11]，對(duì)植物病原菌顯示出良好的拮抗活性[12-13]。此外，利用食品級(jí)VOCs保護(hù)農(nóng)作物和動(dòng)物免受真菌病原體的侵害也受到廣泛關(guān)注[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，1-辛烯-3-醇和其他VOCs（如反式-2-己醛）是拮抗青霉菌和其他真菌的有效熏蒸劑[15-17]。作為一種食品級(jí)VOCs，1-辛烯-3-醇最初在真菌中發(fā)現(xiàn)，后來也在多種植物中發(fā)現(xiàn)[18-19]，是植物細(xì)胞反應(yīng)、植物-食草動(dòng)物相互作用和植物-植物相互作用的信號(hào)分子[20]，也是抑制絲狀真菌萌發(fā)的信號(hào)化合物[15]，但是，目前1-辛烯-3-醇作為一種揮發(fā)性信號(hào)化合物對(duì)其他真菌及其生理機(jī)制影響的研究并不深入。

黃曲霉（Aspergillus flavus）是一種常見霉菌，多存在于發(fā)霉的糧食及飼料中，部分黃曲霉菌還能產(chǎn)生黃曲霉毒素，其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素對(duì)人類和家畜都有很強(qiáng)的毒性及致癌性。生物防治具有無污染、對(duì)人體健康無不良影響等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。因此，利用生物防治法預(yù)防糧食及飼料等發(fā)生霉變具有重要意義[21]。

本實(shí)驗(yàn)以課題組早期從土壤中分離的白黃鏈霉菌TD-1（Streptomyces alboflavusTD-1）為拮抗菌，研究其在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及其產(chǎn)生的VOCs對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的影響，并對(duì)VOCs組分進(jìn)行鑒定分析，篩選出一種食品級(jí)單體化合物1-辛烯-3-醇，對(duì)其拮抗黃曲霉的抑菌機(jī)理及抑制黃曲霉毒素合成的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，旨在為微生物源VOCs在食品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

拮抗菌：白黃鏈霉菌TD-1，本實(shí)驗(yàn)室專利菌種。指示菌：黃曲霉，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC 2219）。

1.1.2 培養(yǎng)基

鏈霉菌采用高氏一號(hào)改良MM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其中，種子培養(yǎng)基為不加葡萄糖的MM培養(yǎng)基，接種量為10%，28 ℃培養(yǎng)48 h備用。

高氏一號(hào)改良MM培養(yǎng)基：黃豆粉5.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4?7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01 g，蒸餾水1 000 mL（固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉）。

將100 mL高氏一號(hào)改良培養(yǎng)基分裝到250 mL三角瓶中，使用時(shí)每瓶加入10 mol/L葡萄糖5.0、0.5、0.05 mL和0 mL，分別制成500、50、5 mmol/L和0 mmol/L濃度葡萄糖MM培養(yǎng)基，pH 7.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將市售馬鈴薯洗凈、去皮，稱量200 g后切塊，加水煮沸20～30 min，8 層紗布過濾，向?yàn)V液中加入葡萄糖20 g，攪拌均勻，稍冷卻后加水至1 L，pH值自然，加入瓊脂30 g。

以上培養(yǎng)基滅菌條件為121 ℃、20 min。

1.1.3 試劑

羅丹明123、二甲基亞砜（均為分析純） 北京索萊寶生物科技公司；乙醇、甲醇、乙腈、二氯甲烷（均為分析純） 天津康科德科技有限公司；1-辛烯-3-醇（分析純） 天津索羅門生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；HYG-IIa型迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；XMTD-1000型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LRH-250-GII型恒溫培養(yǎng)箱 珠江廣東省醫(yī)療器械廠；Allegra X-30型臺(tái)式高速離心機(jī) 美國Beckman公司；1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司；QP2010 Ultral型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌TD-1生長(zhǎng)的影響

將含有不同濃度葡萄糖的MM培養(yǎng)基倒平板并晾干，等距離放置3 個(gè)直徑6 mm的濾紙片，吸取3 μL 1×107個(gè)/mL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液，滴于濾紙片上，立即用封口膜進(jìn)行密封，28 ℃培養(yǎng)，在第3、5、7、10、12、14天采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。

1.3.2 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌TD-1生物量的影響

在含有不同濃度葡萄糖的MM培養(yǎng)基上平鋪一層已滅菌玻璃紙，吸取100 μL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液（106～108CFU/mL），均勻涂布于玻璃紙上，立即用封口膜進(jìn)行密封，28 ℃培養(yǎng)10 d。將玻璃紙上的菌絲刮下，稱其濕質(zhì)量，50 ℃烘箱中烘干，稱其干質(zhì)量。

1.3.3 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌VOCs抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)的影響

采用雙皿對(duì)扣法[22]，吸取100 μL白黃鏈霉菌TD-1孢子懸浮液，均勻涂布于不同濃度葡萄糖平板上，制成下板；在上平板正中央放入一個(gè)直徑為6 mm的濾紙片，吸取3 μL黃曲霉孢子懸浮液，滴于濾紙片上，空白組（CK）下板為純培養(yǎng)基，不涂布鏈霉菌孢子懸浮液。將上下兩板對(duì)扣，28 ℃培養(yǎng)，觀察黃曲霉生長(zhǎng)狀況。

1.3.4 不同濃度葡萄糖培養(yǎng)白黃鏈霉菌TD-1產(chǎn)生VOCs的氣相色譜-質(zhì)譜分析鑒定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)含有不同濃度葡萄糖的白黃鏈霉菌TD-1液態(tài)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的VOCs進(jìn)行收集和鑒定。在第0、2、4、6、8天進(jìn)行取樣。參照Yang Mingguan等[23]方法，取5 mL白黃鏈霉菌TD-1發(fā)酵液，放入頂空進(jìn)樣瓶中進(jìn)行VOCs吸附及氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.5 1 -辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)情況的影響

采用雙皿對(duì)扣法[22]測(cè)定揮發(fā)性單體物質(zhì)對(duì)黃曲霉的抑制作用，略作修改：在培養(yǎng)基中央放置一個(gè)直徑為6 mm濾紙片，吸取3 μL黃曲霉孢子懸浮液，滴于濾紙片上；取1-辛烯-3-醇放置在另一個(gè)皿底中，迅速將兩皿對(duì)扣，用雙層封口膜進(jìn)行密封，28 ℃培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測(cè)量各菌落直徑，用體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween 80溶液洗下黃曲霉孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)各組黃曲霉孢子數(shù)量。以添加同體積無菌水進(jìn)行對(duì)扣，作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3 次平行，重復(fù)操作3 次。

按照式（1）計(jì)算對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)抑制率，按式（2）計(jì)算對(duì)黃曲霉產(chǎn)孢抑制率：

1.3.6 1 -辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉孢子和菌絲體微觀形態(tài)的影響

按照Li Qian等[24]方法，用掃描電子顯微鏡觀察1-辛烯-3-醇處理后黃曲霉孢子和菌絲體微觀形態(tài)的變化。

1.3.7 1 -辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉線粒體膜電位的影響

采用羅丹明123染色法檢測(cè)1-辛烯-3-醇處理后黃曲霉線粒體膜電位的變化[25-26]。吸取100 μL黃曲霉孢子懸液（1×105CFU/mL），均勻涂布在PDA培養(yǎng)基中，將已經(jīng)滅菌的蓋玻片以45°角插入培養(yǎng)基中，28 ℃預(yù)培養(yǎng)36 h，暴露在10 μL/L的1-辛烯-3-醇環(huán)境中12 h和24 h，用鑷子將插入的蓋玻片夾出，將10 μmol/L羅丹明123溶液與菌絲體混合，在黑暗條件下37 ℃孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次載玻片，吸干水分，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.8 1 -辛烯-3-醇對(duì)AFB1生物合成的影響

黃曲霉的培養(yǎng)同1.3.6節(jié)黃曲霉菌絲體的培養(yǎng)方法。

AFB1的提?。河么蚩灼鳎? mm）打取5 個(gè)長(zhǎng)滿黃曲霉菌絲體的瓊脂塊，用15 mL二氯甲烷浸提，室溫下振動(dòng)30 min，將提取液吸出，重復(fù)2 次，合并提取液，3 000 r/min離心10 min，用真空濃縮儀濃縮干燥，加入1 mL流動(dòng)相（乙腈-甲醇-水（1∶1∶2，V/V））溶解凝結(jié)物，用0.22 μm濾膜過濾，待測(cè)。

參照宋文靜[27]的方法測(cè)定AFB1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05，差異顯著。所有數(shù)值均以±s表示，采用Origin 9.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌生長(zhǎng)的影響

控制碳源含量是許多微生物優(yōu)化發(fā)酵和控制培養(yǎng)條件的關(guān)鍵[28]。白黃鏈霉菌TD-1在葡萄糖濃度分別為0、5、50、500 mmol/L及N-乙酰-D-葡萄糖胺培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況如圖1所示。在葡萄糖濃度增加的情況下，TD-1的生物量都呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。在濃度為500 mmol/L時(shí)，其濕質(zhì)量為247.1 mg，干質(zhì)量為55.6 mg。TD-1在高氏一號(hào)改良MM培養(yǎng)基（未添加葡萄糖）生長(zhǎng)的菌落直徑最大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其菌落逐漸變大，在10～14 d時(shí)直徑變化不明顯，且菌落開始變黑。隨著葡萄糖濃度逐漸增大，菌落直徑呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，較無葡萄糖小，第7天以后鏈霉菌菌斑變厚，濃度為500 mmol/L時(shí)，TD-1菌落在發(fā)酵后期最厚且無發(fā)黑現(xiàn)象，添加N-乙酰-D-葡萄糖胺的效果沒有添加葡萄糖效果好。說明添加速效碳源有利于鏈霉菌生長(zhǎng)，且可以減少其自溶現(xiàn)象。

圖1 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌TD-1生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of glucose on the growth of S.alboflavus TD-1

2.2 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌產(chǎn)VOCs抑制黃曲霉菌能力的影響

如圖2A所示，與CK相比，白黃鏈霉菌TD-1對(duì)黃曲霉的抑制作用極為明顯，其菌絲體及孢子較少，對(duì)扣過程中其孢子和菌絲體沒有掉落在對(duì)扣板上，CK掉落在對(duì)扣板上的菌絲體和孢子較多。葡萄糖濃度為0、5 mmol/L時(shí)，黃曲霉孢子產(chǎn)生的相對(duì)較多，菌絲體較少，50、500 mmol/L的孢子較少，菌絲體較多，說明葡萄糖濃度越高白黃鏈霉菌TD-1產(chǎn)生的VOCs對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)，50、500 mmol/L產(chǎn)生的VOCs抑菌能力較0、5 mmol/L強(qiáng)。

由圖2B可知，TD-1在高氏一號(hào)改良MM培養(yǎng)基（即葡萄糖濃度為0 mmol/L）培養(yǎng)時(shí)，開始產(chǎn)生的揮發(fā)性成分較其他濃度高，但總峰面積增幅較小，在第8天時(shí)明顯減少，葡萄糖濃度為5 mmol/L時(shí)產(chǎn)生的揮發(fā)性成分相對(duì)其他濃度較少，但一直呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)；葡萄糖濃度為50 mmol/L時(shí)，在0～4 d的揮發(fā)性成分產(chǎn)量大幅增加，在第4天達(dá)到最高值，但后期明顯下降；葡萄糖濃度為500 mmol/L時(shí)，0～2 d產(chǎn)揮發(fā)性成分少，但在2～4 d揮發(fā)性成分增長(zhǎng)幅度明顯升高，4 d以后產(chǎn)揮發(fā)性成分較為穩(wěn)定，且超過50 mmol/L時(shí)VOCs產(chǎn)量為4 種葡萄糖濃度中最高。說明葡萄糖濃度過高在發(fā)酵初期有分解代謝阻遏，到后期高濃度的葡萄糖為菌體的生長(zhǎng)提供了豐富的碳源和能量來源，延緩了菌體的自溶，為代謝產(chǎn)物的生物合成提供了保障。

圖2 葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌TD-1產(chǎn)生的VOCs抑制黃曲霉能力（A）及產(chǎn)VOCs總峰面積（B）的影響Fig.2 Influence of different glucose concentrations on anti-A.flavus effect (A) and total peak area of VOCs produced by S.alboflavus TD-1 (B)

2.3 不同濃度萄糖培養(yǎng)下白黃鏈霉菌TD-1 VOCs的組分鑒定

由圖3可知，共鑒定出60 種主要VOCs，包括酸類、酮類、醇類、醛類、醚類、呋喃類、萜烯類、烷烴類等物質(zhì)。其中，部分烷烴類物質(zhì)，包括1,2-環(huán)氧庚烷以及二十一烷含量等隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)、葡萄糖濃度的增加總體降低；醛類物質(zhì)包括己醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛等含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，然而，隨著葡萄糖濃度的增加，部分酮類物質(zhì)2,3-丁二酮、乙偶姻隨著葡萄糖濃度的增加含量逐漸增加；部分醇類物質(zhì)異丁醇、正己醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇等物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，含量大體呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，其中1-辛烯-3-醇最為明顯；萜烯類物質(zhì)2-甲基異冰片隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)含量大體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。隨著葡萄糖濃度的增加，醚類物質(zhì)如苯甲醚、二甲基三硫醚含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)略有增加。在VOCs組分中，乙酸、異丁酸、己醛、甲氧基-苯基肟、1-辛烯-3-醇、3-辛酮、2-正戊基呋喃、2-乙基-1-己醇、2-甲基異冰片、1,4-甲基-1H-環(huán)戊噠嗪、6-亞甲基-螺環(huán)癸烷、二甲萘烷醇（土味素）、異長(zhǎng)葉烯-8-醇、二十一烷等含量較多。乙酸、己醛、1-辛烯-3-醇、2-正戊基呋喃、2-甲基異冰片、苯乙酮均具有一定的抑菌作用[29-32]。其中己醛、1-辛烯-3-醇具有抑制菌絲生長(zhǎng)以及孢子萌發(fā)的作用，且1-辛烯-3-醇含量與抑制率具有相似的變化趨勢(shì)，具有作為食品添加劑使用安全的特性。因此，將1-辛烯-3-醇作為起主要抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行抗黃曲霉活性以及對(duì)黃曲霉毒素合成調(diào)控的深入研究。

圖3 白黃鏈霉菌TD-1發(fā)酵過程中VOCs的熱圖Fig.3 Heatmap showing dynamic changes of VOCs from S.alboflavus TD-1

2.4 1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)情況的影響

1-辛烯-3-醇含量梯度為0、5、10、15、20、25 μL/L，對(duì)黃曲霉進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果如表1所示。不同含量1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)、產(chǎn)孢抑制率結(jié)果如圖4所示。在1-辛烯-3-醇含量為5～25 μL/L時(shí)，對(duì)黃曲霉均具有明顯的拮抗作用，生長(zhǎng)抑制率在24.94%～100%之間，產(chǎn)孢抑制率在84.50%～100%之間。隨著1-辛烯-3-醇含量的增加抑菌活性逐漸增強(qiáng)，15 μL/L時(shí)可完全抑制黃曲霉菌的生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)，10 μL/L時(shí)其幾乎沒有孢子，產(chǎn)孢抑制率可達(dá)到99.85%，生長(zhǎng)抑制率達(dá)到75.29%。

圖41 -辛烯-3-醇含量對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)、產(chǎn)孢抑制率的影響Fig.4 Inhibitory effects of different concentrations of 1-octen-3-ol on the hyphal growth and spore germination of A.flavus

2.5 1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉微觀形態(tài)的影響

圖51 -辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉孢子及菌絲體微觀形態(tài)的影響Fig.5 Conidial morphology and hyphal morphology of A.flavus treated by 1-octen-3-ol

如圖5A、B所示，空白組中大部分黃曲霉孢子伸出芽管，孢子形態(tài)良好，1-辛烯-3-醇處理組尚無芽管出現(xiàn)并觀察到孢子表面有凹陷現(xiàn)象，且孢子數(shù)較少，說明1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉孢子有致畸作用，且會(huì)抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)。

如圖5C～F所示，預(yù)培養(yǎng)2 d黃曲霉菌絲體已經(jīng)形成孢子囊，生長(zhǎng)點(diǎn)較為豐富，且其尖端呈現(xiàn)正常的圓錐形，菌絲體粗細(xì)較為均勻、飽滿?？瞻捉M（處理4 d）的菌絲體形成的孢子囊極多，且有很多成熟的孢子掉落，菌絲體粗細(xì)均勻且較為飽滿。處理組的菌絲呈現(xiàn)不規(guī)則扭曲、干癟，表面褶皺不平，生長(zhǎng)點(diǎn)數(shù)量極少，菌絲體較細(xì)。說明1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉菌絲體也有明顯的致畸作用。

2.6 1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉線粒體膜電位的影響

圖61 -辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉菌絲體羅丹明染色的結(jié)果Fig.6 Effect of 1-octen-3-ol on mitochondrial membrane potential of A.flavus

線粒體可為細(xì)胞提供能量，與細(xì)胞凋亡具有密切關(guān)系[33]，羅丹明123是一種可選擇性染色活細(xì)胞線粒體的熒光染料，可通過細(xì)胞膜在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)聚集發(fā)出黃綠色熒光。熒光強(qiáng)度越弱說明聚集在線粒體內(nèi)的染料越少，線粒體膜被破壞越嚴(yán)重，ATP合成能力越弱[34]。1-辛烯-3-醇對(duì)黃曲霉線粒體膜電位的影響如圖6所示，預(yù)培養(yǎng)36 h后，菌絲體呈現(xiàn)出明亮的綠色，說明線粒體膜電位正常；培養(yǎng)48 h及60 h空白組的孢子囊增多且較為為明亮；預(yù)培養(yǎng)36 h后暴露于1-辛烯-3-醇12、24 h處理組發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，熒光強(qiáng)度顯著降低。由此可知，1-辛烯-3-醇可顯著降低黃曲霉線粒體膜電位，減弱黃曲霉線粒體產(chǎn)ATP的能力。

2.7 1-辛烯-3-醇對(duì)AFB1生物合成的影響

圖71 -辛烯-3-醇對(duì)AFB1的抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of 1-octen-3-ol on AFB1 production

AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=11.028x+9.715 6，R2=0.999 9。由圖7可知，黃曲霉接種2 d后AFB1含量為19.49 μg/kg；培養(yǎng)至第4天AFB1迅速升高，含量高達(dá)67.79 μg/kg，而經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)2 d后暴露在1-辛烯-3-醇中2 d，AFB1含量為21.68 μg/kg，相較于空白組，AFB1含量下降了68.02%，黃曲霉產(chǎn)生AFB1量得到了很好地控制，抑制其合成速率達(dá)到31.98%。

3 結(jié) 論

以白黃鏈霉菌TD-1為拮抗菌，以黃曲霉為指示菌，研究培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)白黃鏈霉菌TD-1生長(zhǎng)和VOCs產(chǎn)量等的影響，在發(fā)酵初期，500 mmol/L葡萄糖可抑制白黃鏈霉菌TD-1的生長(zhǎng)，但在發(fā)酵后期，葡萄糖慢慢被消耗，6 d后阻遏作用被解除，TD-1開始合成次級(jí)代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵后期，有足夠而又不過量的葡萄糖，可對(duì)白黃鏈霉菌TD-1的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成起到明顯促進(jìn)作用，生物量及產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物VOCs含量較高，產(chǎn)量穩(wěn)定，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可對(duì)黃曲霉菌起到很好的抑制作用。此外，從白黃鏈霉菌TD-1所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中篩選出一種食品級(jí)揮發(fā)物1-辛烯-3-醇，其對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，可抑制黃曲霉菌的孢子萌發(fā)，破壞細(xì)胞膜以及線粒體膜完整性，顯著降低黃曲霉菌AFB1的產(chǎn)量。以上研究結(jié)果可為微生物源VOCs在食品中的應(yīng)用提供參考。然而，白黃鏈霉菌TD-1降低AFB1產(chǎn)量是通過抑制黃曲霉生長(zhǎng)還是通過1-辛烯-3-醇調(diào)控黃曲霉產(chǎn)毒基因還需進(jìn)一步研究。