添加微量元素螯合劑的L-色氨酸發(fā)酵研究

劉小都

(河南巨龍生物工程股份有限公司,河南 汝州 467599)

色氨酸是一種含有吲哚基的中性芳香族氨基酸,有L型和D型二種異構(gòu)體,其中L-色氨酸作為人體8種必需氨基酸之一被廣泛研究,其在人體代謝活動(dòng)中除了參與蛋白質(zhì)合成外,還具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)、促進(jìn)睡眠、提高免疫力和維持腦組織功能正常等功能,因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[1-2]。L-色氨酸也被認(rèn)為是人體及動(dòng)物所需8種必須氨基酸中的第二必需氨基酸[3]。在醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)供不應(yīng)求,因此探索如何提高色氨酸產(chǎn)量具有重大意義[4-6]。

色氨酸生產(chǎn)方法有傳統(tǒng)的化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法以及后續(xù)發(fā)展起來的酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物直接發(fā)酵法[7-11]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法存在環(huán)境污染嚴(yán)重、設(shè)備要求高和生產(chǎn)成本高等缺點(diǎn)[12],逐漸被原料簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和及生產(chǎn)成本低的微生物法所取代,因此微生物直接發(fā)酵成為了目前L-色氨酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的常用方法[13]。然而,微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸也面臨著許多亟待解決的問題,例如,微量元素是微生物正常生長(zhǎng)代謝不可或缺的營養(yǎng)成分,在微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)活動(dòng)中發(fā)揮著極其重要的作用,其與酶的活動(dòng)密切相關(guān),或者是可以作為酶的活性基團(tuán)的成分,或者是作為酶的激活劑,但是發(fā)酵生產(chǎn)中常用的微量元素添加劑為無機(jī)鹽類,包括硫酸錳、硫酸鐵和硫酸鋅等,這類微量元素添加劑存在著混合不均勻、易潮解、易氧化和吸收利用率低等缺點(diǎn),這就造成了菌體在生長(zhǎng)及生產(chǎn)過程中菌體活力下降,產(chǎn)酸能力不足等問題[14-17]。而以氨基酸鋅、氨基酸鐵、氨基酸錳和氨基酸銅為代表的氨基酸微量元素螯合劑具有化學(xué)穩(wěn)定性好、易吸收、生物學(xué)效價(jià)好、抗干擾能力強(qiáng)和刺激小等優(yōu)點(diǎn),可以起到補(bǔ)充微量元素營養(yǎng)并且兼有氨基酸強(qiáng)化劑的作用,能夠有效提高發(fā)酵菌體的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能[18-25]。以EscherichiacoliTRTH為供試菌株,對(duì)供試菌株的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸螯合劑的添加進(jìn)行研究,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)探究氨基酸螯合劑的最適添加量,為解決菌株發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸時(shí)在發(fā)酵過程中由于微量元素吸收利用率低所帶來的一系列問題提出建設(shè)性意見,從而提高菌體的產(chǎn)酸能力,進(jìn)一步提高色氨酸產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌 種

EscherichiacoliTRTH(trpEDCBA+TetR,Δtna)和(Phe-+Tyr-+5-MTR+5-FTR+CINR+SGR),公司菌種保藏中心提供。

1.2 培 養(yǎng) 基

活化斜面培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,牛肉膏10 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,瓊脂粉20 g/L,四環(huán)素50 mg/L。

種子培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖30 g/L,酵母粉4 g/L,檸檬酸0.5 g/L,(NH4)2SO41 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,VB11 mg/L,VH0.3 mg/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖10 g/L,酵母粉4 g/L,檸檬酸2 g/L,(NH4)2SO44 g/L,KH2PO46 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,VB15 mg/L,VH0.2 mg/L。

1.3 主要儀器

LDZH-100KBS型全自動(dòng)立式蒸汽滅菌器,天津博鑫生物科技有限公司;5 L和30 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所;KQ-C高壓蒸汽發(fā)生器,上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠;752分光光度計(jì),上海分析儀器廠;OLYMPUS生物顯微鏡,日本OLYMPUS會(huì)社。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取甘油管中菌種接種于活化斜面培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫傳代活化2次,每次培養(yǎng)24 h。

1.4.2 種子培養(yǎng)

5 L發(fā)酵罐,初始發(fā)酵液體積定容至3 L。初始通氣量為2 L/min,初始攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min,通過自動(dòng)流加25%的氨水控制發(fā)酵液pH在7.0～7.2,通過攪拌和通風(fēng)控制溶氧,以消泡劑消泡,恒溫37 ℃培養(yǎng),溶氧維持在25%～30%。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

30 L發(fā)酵罐,初始發(fā)酵液體積定容至12 L。恒溫37 ℃培養(yǎng),通過自動(dòng)流加25%的氨水控制培養(yǎng)基pH在7.0～7.2,控制溶氧在25%～40%,發(fā)酵過程中以泡敵消泡;底物葡萄糖消耗完后,根據(jù)DO反饋補(bǔ)料策略,流加質(zhì)量濃度為800 g/L的葡萄糖溶液,維持零殘?zhí)前l(fā)酵;過程中每隔2 h測(cè)樣、記錄數(shù)據(jù)。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 發(fā)酵液pH的測(cè)定

采用發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH電極進(jìn)行測(cè)定,pH在6.4～7.0,精密pH試紙輔助測(cè)定。

1.5.2 發(fā)酵液中殘?zhí)菧y(cè)定

每隔2 h進(jìn)行取樣,離心,取上清,將上清稀釋100倍,用SBA-40E生物傳感分析儀檢測(cè)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.5.3 菌體生物量的測(cè)定

菌體密度以菌體干質(zhì)量表示,取10 mL發(fā)酵液,13 000 r/min離心管內(nèi)離心2 min,將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于真空干燥箱中80 ℃干燥至恒質(zhì)量后用分析天平稱量。菌體生物量計(jì)算式為

式中:m1為離心管的質(zhì)量;m2為含菌體離心管干燥后的總質(zhì)量;V為測(cè)定用發(fā)酵液體積。

1.5.4 發(fā)酵液中L-色氨酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法和高效液相色譜法對(duì)不同樣品中的L-色氨酸質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測(cè),具體操作條件和步驟參考文獻(xiàn)[11]。

1.5.5 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算

糖酸轉(zhuǎn)化率SA計(jì)算公式

式中:SA為糖酸轉(zhuǎn)化率;ρ為L(zhǎng)-色氨酸質(zhì)量濃度;V為發(fā)酵液總體積;m為總耗糖質(zhì)量。

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次實(shí)驗(yàn)的平均值。單因素方差分析之后,Dunnet t檢驗(yàn)來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性(P<0.05)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 蛋氨酸螯合鐵對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響

為考察蛋氨酸螯和鐵對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響,在1.2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5組不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯合鐵(在不添加其他氨基酸和微量元素螯合劑的條件下),分析不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯合鐵對(duì)色氨酸發(fā)酵中生物量、色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率指標(biāo)的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯合鐵對(duì)生物量、 L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of iron methionine chelate on biomass, L-tryptophan yield and sugar acid conversion rate

由圖1可以看出:隨著蛋氨酸螯合鐵的質(zhì)量濃度的增加,色氨酸發(fā)酵過程中生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率逐漸上升,但當(dāng)?shù)鞍彼狎翔F質(zhì)量濃度超過了320 mg/L時(shí),生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)下降。通過分析,鐵元素是微生物正常生命活動(dòng)所必須的營養(yǎng)成分,而蛋氨酸螯合鐵加快了菌體對(duì)于鐵元素的吸收,增加了菌體的活力,導(dǎo)致菌體量有較大幅度的提升,同時(shí)伴隨著菌體活力的上升,菌體的發(fā)酵性能也出現(xiàn)了上升。但是菌體對(duì)于鐵元素的耐受能力是有一定限度的,過量的微量元素會(huì)起到毒害作用,所以菌體在蛋氨螯合酸鐵超過一定量后,生物量和L-色氨酸產(chǎn)量出現(xiàn)明顯下降。選擇合適的蛋氨酸螯合鐵質(zhì)量濃度才能起到提高菌體活力的效果,因此蛋氨酸螯合鐵的最適質(zhì)量濃度選擇為320 mg/L,此時(shí)最大生物量為49.8 g/L,L-色氨酸產(chǎn)量為50 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為18.9%。

2.1.2 蛋氨酸螯合錳對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響

將5組不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯和錳(在不添加其他氨基酸微量元素螯合劑的條件下)添加到1.2發(fā)酵培養(yǎng)基中,考察蛋氨酸螯和錳對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響,分析不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯合錳對(duì)色氨酸發(fā)酵中生物量、色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率指標(biāo)的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度的蛋氨酸螯合錳對(duì)生物量、 L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of manganese methionine chelate on biomass, L-tryptophan yield and sugar acid conversion rate

由圖2可以看出:當(dāng)?shù)鞍彼狎襄i的質(zhì)量濃度達(dá)到240 mg/L時(shí),菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸性能最好,最大生物量為50.3 g/L,L-色氨酸產(chǎn)量為52 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為19.2%。當(dāng)?shù)鞍彼狎襄i的質(zhì)量濃度不超過240 mg/L時(shí),生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率逐漸上升;當(dāng)?shù)鞍彼狎襄i的質(zhì)量濃度超過240 mg/L時(shí),生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)明顯下降。錳元素是菌體中磷酸烯醇式脫羧酶、檸檬酸合成酶和磷酸轉(zhuǎn)移酶等酶的重要組成成分,蛋氨酸螯合錳過少時(shí)不足以提供菌體代謝所需的錳元素,過高時(shí)錳元素的毒害作用又會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和生產(chǎn)活動(dòng),選擇合適的蛋氨酸螯合錳質(zhì)量濃度才能起到提高菌體活力和發(fā)酵性能的作用,所以蛋氨酸螯合錳最適質(zhì)量濃度選擇為240 mg/L。

2.1.3 丙氨酸螯合鋅對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響

為考察丙氨酸螯和鋅對(duì)色氨酸發(fā)酵的影響,在1.2發(fā)酵培養(yǎng)基中添加5組不同質(zhì)量濃度的丙氨酸螯和鋅(在不添加其他氨基酸微量元素螯合劑的條件下),分析不同質(zhì)量濃度的丙氨酸螯合鋅對(duì)色氨酸發(fā)酵中生物量、色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率指標(biāo)的影響,結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出:生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率隨著丙氨酸螯合鋅的質(zhì)量濃度的上升出現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì),出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要是丙氨酸螯合鋅的添加填補(bǔ)了微生物對(duì)于鋅元素的需求,增加了微生物菌體內(nèi)多種脫氫酶、磷酸酯酶、醛縮酶和羧肽酶等酶的活力,從而提高了菌體的活力,增加了L-色氨酸的產(chǎn)量;當(dāng)丙氨酸螯合鋅添加過量時(shí),菌體會(huì)吸收過量的鋅,鋅作為一種重金屬元素,質(zhì)量濃度過高會(huì)抑制菌體生長(zhǎng),進(jìn)而影響菌體的發(fā)酵性能。為了達(dá)到最大程度增加菌體活力和菌體發(fā)酵產(chǎn)酸能力的目的,最終選取80 mg/L的丙氨酸螯合鋅作為最適質(zhì)量濃度,此時(shí)最大菌體量為48.2 g/L,L-色氨酸產(chǎn)量為49 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為19.3%。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定實(shí)驗(yàn)因素,蛋氨酸螯合鐵、蛋氨酸螯合錳和丙氨酸螯合鋅的最佳質(zhì)量濃度分別為320,240,80 mg/L。繼續(xù)以生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率為考察因素,選用L9(33)為正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)3因素3水平正交實(shí)驗(yàn),對(duì)色氨酸發(fā)酵的關(guān)鍵因素進(jìn)行分析,正交實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,說明氨基酸微量元素螯合劑的添加對(duì)L-色氨酸的發(fā)酵有益,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2所示,極差R分析如表3所示。

表1 色發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 色氨酸發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)極差分析表

為進(jìn)一步確定不同因素的最優(yōu)化組合,以不同因素水平為橫坐標(biāo),以不同考察指標(biāo)為縱坐標(biāo)[26],制得不同因素水平對(duì)生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的趨勢(shì)圖如圖4所示[27]。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)因子與響應(yīng)指標(biāo)關(guān)系趨勢(shì)圖Fig.4 Trend chart of relation between different test factors and response indexes

由圖4可以看出:對(duì)于不同的考察指標(biāo)因素A2和B2都為最優(yōu)水平,且B因素對(duì)不同考察指標(biāo)的變化趨勢(shì)最大,這與表2,3中分析B對(duì)考察結(jié)果的影響最大結(jié)果一致;隨著C因素的變化,生物量雖然有小幅上漲,但是糖酸轉(zhuǎn)化率和L-色氨酸產(chǎn)量卻逐漸降低,糖酸轉(zhuǎn)化率和L-色氨酸產(chǎn)量的變化幅度明顯大于生物量的變化幅度,同時(shí)在發(fā)酵行業(yè)中目標(biāo)產(chǎn)品的糖酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量是主要的技術(shù)及經(jīng)濟(jì)指標(biāo),應(yīng)根據(jù)主要指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選B2C1組合,綜合考慮以上結(jié)果,優(yōu)選既提高菌體生物量又能增加L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的組合,因此最佳氨基酸微量元素螯合劑添加條件為A2B2C1,即蛋氨酸螯合鐵質(zhì)量濃度320 mg/L、蛋氨酸螯合錳質(zhì)量濃度240 mg/L、丙氨酸螯合鋅質(zhì)量濃度40 mg/L。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

因?qū)嶒?yàn)中添加的氨基酸微量元素螯合劑中同時(shí)能為微生物提供氨基酸和相應(yīng)微量元素,為排除添加氨基酸微量元素螯合劑實(shí)驗(yàn)時(shí)帶入發(fā)酵培養(yǎng)基中氨基酸基團(tuán)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響,同時(shí)依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)所得的氨基酸微量元素螯合劑最佳添加組合,進(jìn)行多批次不同策略方式進(jìn)行平行發(fā)酵驗(yàn)證保證實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性,所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5,6和表4所示(方式1表示不添加等濃度氨基酸和相應(yīng)微量元素;方式2表示添加等濃度氨基酸和相應(yīng)微量元素;方式3表示添加氨基酸微量元素螯合劑)。由圖5可以看出:通過對(duì)比3種不同發(fā)酵策略的生物量發(fā)酵過程曲線,方式1和方式2的最大菌體量分別為44.4 g/L和47.5 g/L,發(fā)酵后期菌體量分別為39.8,45.0 g/L,下降幅度分別為4.6,2.5 g/L;方式3,即添加氨基酸微量元素螯合劑的最大菌體量為50.3 g/L,發(fā)酵后期菌體量為49.0 g/L,最大菌體量下降幅度僅為1.3 g/L,較方式1和方式2的最大菌體量分別提升了13.3%,5.9%,下降幅度分別降低了71.7%,48.0%。表明氨基酸微量元素螯合劑對(duì)于促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)代謝具有明顯作用。

圖5 不同添加方式對(duì)于生物量的影響Fig.5 Effects of different addition methods on biomass

表4 3種發(fā)酵方式對(duì)于糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

由圖6和表4可以看出:方式1和方式2的L-色氨酸最終產(chǎn)量分別為47.7,51.0 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率分別為17.9%,19.1%;方式3,即添加氨基酸微量元素螯合劑的L-色氨酸最終產(chǎn)量為54.2 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為20.8%,較方式1和方式2的L-色氨酸的最終產(chǎn)量分別提高了13.6%,6.9%,糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了16.2%,6.7%。

圖6 不同添加方式對(duì)于L-色氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Influence of different addition methods on L-tryptophan yield

綜上結(jié)果,出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是因?yàn)槲⒘吭厥俏⑸锷L(zhǎng)所必需的物質(zhì),適當(dāng)添加微量元素能夠有利于菌體內(nèi)各種酶的合成,提高酶的活力從而提高菌體自身的活力,加快菌體生長(zhǎng),所以方式2和方式3對(duì)于菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酸有明顯益處。同時(shí),相較于無機(jī)鹽類的微量元素添加方式,采用氨基酸微量元素螯合劑效果更加明顯:一方面,氨基酸微量元素螯合劑的吸收效率高,比無機(jī)微量元素高30%,氨基酸微量元素螯合劑是利用配位體(氨基酸或肽)的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)吸收,而不是金屬元素的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),故不必先同其他物質(zhì)結(jié)合[17];另一方面,金屬微量元素能以配位鍵或離子鍵與氨基酸配位體鍵合,使自身被保護(hù)在絡(luò)合物的中心,通過配位體的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),以絡(luò)合物的形式穿過黏膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而減弱金屬微量元素之間的拮抗作用,大大提高金屬微量元素的利用率[20,23]。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),在初始裝液量為12 L的30 L發(fā)酵罐的常規(guī)發(fā)酵配方中添加蛋氨酸螯合鐵質(zhì)量濃度320 mg/L,蛋氨酸螯合錳質(zhì)量濃度240 mg/L,丙氨酸螯合鋅質(zhì)量濃度40 mg/L時(shí),最大菌體量為50.3 g/L,發(fā)酵后期菌體量為49.0 g/L;L-色氨酸最終產(chǎn)量為54.2 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為20.8%;較常規(guī)發(fā)酵的最大菌體量提升了13.3%,下降幅度降低了71.7%,提高了發(fā)酵后期的菌體活力;L-色氨酸最終產(chǎn)量提高了13.6%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了16.2%。這主要是因?yàn)榘被嵛⒘吭仳蟿┑奶砑?保證了各種微量元素的高效利用,提高了菌體的活力,促進(jìn)了菌體的產(chǎn)酸能力,所以本研究為進(jìn)一步提高色氨酸發(fā)酵產(chǎn)量提供了新的研究思路。