異常威客漢姆酵母產(chǎn)酯酶培養(yǎng)基優(yōu)化及發(fā)酵液香氣物質(zhì)分析

石 馨,惠 明,田 青,黃繼紅

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001)

酯酶(E.C.3.1.1.1)是催化酯鍵合成和水解的一類酶的總稱[1],廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,其中微生物源的酯酶在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最多[2-3]。已有研究證明:酵母[4-5]、霉菌[6]和細(xì)菌[7]均可產(chǎn)生酯化酶,在培養(yǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生豐富的酯類風(fēng)味物質(zhì)[8-12],比如己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等,均能呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味,這些酯類對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的感官指標(biāo)有較大的影響,并且酯類物質(zhì)都屬于白酒風(fēng)味的重要貢獻(xiàn)物質(zhì)。因此,酯化酶廣泛應(yīng)用于白酒工業(yè),為白酒提酯增香[13-14],改善普通白酒酯香味不足的質(zhì)量缺陷[15-19]。異常威客漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)在培養(yǎng)過(guò)程中可產(chǎn)酯類、醇類和有機(jī)酸類等風(fēng)味物質(zhì),對(duì)香氣的形成起著重要作用,常常作為白酒釀造、發(fā)酵食品的重要功能微生物。筆者以實(shí)驗(yàn)室保藏的異常威客漢姆酵母Y-1為出發(fā)菌株,通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)酯酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,確定適宜的培養(yǎng)基組分,用以提高Y-1菌所產(chǎn)酯酶的活力,并采用固相微萃取法(SPME)對(duì)其發(fā)酵液揮發(fā)性成分進(jìn)行提取,結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)其進(jìn)行定量分析,研究Y-1菌的產(chǎn)酯風(fēng)味成分,為其推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌 種

異常威客漢姆酵母Y-1,本實(shí)驗(yàn)室分離及保藏。

1.1.2 主要試劑

乙腈、對(duì)硝基苯酚乙酸酯,上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培 養(yǎng) 基

YPD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基,購(gòu)自瑞楚生物公司。

液體產(chǎn)酯發(fā)酵培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):葡萄糖10 g/L,酵母膏10 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.2 g/L,KH2PO40.2 g/L,MgSO40.2 g/L,CaCl20.2 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平,梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、QP2010氣質(zhì)聯(lián)用儀,日本島津有限公司;固相微萃取裝置(SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭),江蘇默克儀器有限公司;ZHJH-C1112C超凈工作臺(tái)、ZQZY-CS全溫恒溫培養(yǎng)搖床、ZXSD-A1160恒溫培養(yǎng)箱,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將菌株接入YPD液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,再將菌液稀釋涂布于YPD固體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h,相同培養(yǎng)條件下活化2次,將活化后的菌體接至斜面PDA培養(yǎng)基,于4 ℃冰箱保藏。產(chǎn)酯發(fā)酵時(shí),將種子液按體積分?jǐn)?shù)8%的接種量接至液體發(fā)酵培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件與菌種活化時(shí)一致。

1.3.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取兩環(huán)活化好的菌體,接入YPD液體培養(yǎng)基中,以溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)22 h,每2 h測(cè)1次600 nm處的吸光度OD,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600為縱坐標(biāo),繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 酯酶活力測(cè)定

酯酶活力測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[20]的方法。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

分別以玉米淀粉、蔗糖、可溶性淀粉和葡萄糖作為碳源,質(zhì)量濃度均為10 g/L,同時(shí)保證培養(yǎng)基其余組分不變。裝液量為100 mL∶250 mL,接種量按體積分?jǐn)?shù)8%接種,溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測(cè)定酯酶活力。

分別以酵母浸粉、蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、NH4NO3和KNO3作為氮源,質(zhì)量濃度均為20 g/L,同時(shí)保證培養(yǎng)基其余組分不變。裝液量為100 mL∶250 mL,接種量按體積分?jǐn)?shù)8%接種,溫度28 ℃,轉(zhuǎn)速120 r/min條件下培養(yǎng)24 h,測(cè)定酯酶活力。

1.3.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design-Expert 8.0軟件創(chuàng)建Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)可知:影響較大的3個(gè)因素為酵母膏、NH4Cl和玉米淀粉,以酯酶活力作為響應(yīng)值,記為變量Y。根據(jù)初始培養(yǎng)基的產(chǎn)酯酶結(jié)果,設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素及水平如表1所示。

表1 Box-Behnke實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.3.6 香氣物質(zhì)分析

按照1.3.1的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后8 000 r/min離心5 min,取上清液,即為發(fā)酵液。精確量取8 mL發(fā)酵液,緩慢加入到20 mL的頂空瓶中,倒入時(shí)樣品不得沾到瓶壁,以免萃取頭沾到樣品,對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。加入1 μL的內(nèi)標(biāo)物(2%乙酸正丁酯),再倒入1 g的NaCl,立刻將樣品瓶密封壓緊。NaCl的加入能夠促進(jìn)香氣成分揮發(fā),在同樣的處理?xiàng)l件下,加入NaCl的樣品可檢出物質(zhì)種類明顯增加,并且檢出同一物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,能夠最大程度地全部檢出;萃取溫度選擇45 ℃,溫度過(guò)低,會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)出的物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低,溫度過(guò)高,可增強(qiáng)物質(zhì)的揮發(fā)能力,同時(shí)解吸能力也增大,也會(huì)使檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變小。萃取之前,先將頂空瓶置于45 ℃水浴中平衡10 min,平衡結(jié)束之后萃取50 min。詳細(xì)萃取方法以及氣相色譜、質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)[21]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線繪制

所測(cè)得的異常威客漢姆酵母菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可知:在0～2 h,菌液濃度緩慢上升,屬于新環(huán)境的適應(yīng)階段,為遲滯期;在2～8 h,菌液濃度加速升高,為快速生長(zhǎng)期,此時(shí)期以最快的速度進(jìn)行繁殖;8 h后隨著時(shí)間的增長(zhǎng),吸光度值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì),這時(shí)培養(yǎng)體系中缺乏了菌體生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分,菌體逐漸減小直至死亡,故在8～20 h的前段為穩(wěn)定期,后段為衰退期。因此,在相同培養(yǎng)條件下制備種子液,培養(yǎng)至10 h左右即可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 異常威客漢姆酵母Y-1生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Saccharomyces cerevisiae Y-1

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

碳源通過(guò)微生物代謝作用為微生物整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程提供能量[22],碳源的不同種類對(duì)微生物酶的產(chǎn)生具有直接影響;同時(shí),微生物因其可以將碳源轉(zhuǎn)化成自身的細(xì)胞組成成分,所以微生物的生長(zhǎng)對(duì)碳源也具有選擇性,即二者之間存在雙向選擇的關(guān)系[23]。在實(shí)驗(yàn)中,共探究了4種不同碳源對(duì)產(chǎn)酯酶的影響,其結(jié)果如圖2所示,當(dāng)酯酶活力最高時(shí),碳源為玉米淀粉,以葡萄糖作為碳源時(shí)酯酶活力相對(duì)較低,說(shuō)明碳源的種類對(duì)菌株產(chǎn)酯酶活力具有一定影響,因此選取玉米淀粉為固定碳源。實(shí)驗(yàn)以玉米淀粉為固定碳源,考察不同有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)碳源對(duì)產(chǎn)酯酶活力的影響微生物細(xì)胞中的含氮物質(zhì)通常利用氮源物質(zhì)來(lái)合成,僅有少數(shù)情況下也會(huì)被作為能源物質(zhì),微生物對(duì)碳源的利用同樣具有選擇性。結(jié)果表明:有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酯酶活力的影響程度與碳源的影響程度相差不大,但是無(wú)機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酯酶活力的影響較大,實(shí)驗(yàn)以氯離子最為明顯,與楊曉曦等[24]所研究的含有氯離子的無(wú)機(jī)氮源可以促進(jìn)產(chǎn)酶的結(jié)果一致。

圖2 不同碳源、氮源對(duì)產(chǎn)酯酶活力的影響Fig.2 Effects of carbon source on producing esterase activities

2.3 Box-Behnke設(shè)計(jì)與分析

用Design-Expert 8.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)方法,選取了3個(gè)對(duì)酯酶活性有明顯影響的因素,在3個(gè)水平下對(duì)酯酶活力的影響作進(jìn)一步研究和探討,以獲得其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnke實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及響應(yīng)值

利用Design-Expert 8.0軟件,以異常威客漢姆酵母Y-1菌株所產(chǎn)酯酶活力(U/mL)為響應(yīng)值,A(酵母膏質(zhì)量分?jǐn)?shù))、B(NH4Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù))、C(玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù))為自變量,擬合得到回歸方程為

Y=0.25+0.022A-3.694B+0.063C-

6.694AB-0.020AC+5.387BC+

2.258A2-0.062B2-0.037C2

對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析,得到顯著性檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可以看出:本實(shí)驗(yàn)所選的模型回歸方程P<0.01,F=12.41?；貧w方程的顯著性一般通過(guò)F值來(lái)反映,對(duì)應(yīng)P值越小,說(shuō)明相應(yīng)變量的顯著性就越高,所以此回歸模型顯著;模型中的一次項(xiàng)A,C和二次項(xiàng)B2對(duì)響應(yīng)值的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01),二次項(xiàng)C2達(dá)到顯著水平(P<0.05)。失擬項(xiàng)(Lack of fit)代表模擬函數(shù)與真實(shí)函數(shù)之間的差異,差異越小意味著效果越好,一般通過(guò)P值的顯著性來(lái)判斷,P值越大,說(shuō)明擬合的模型方程效果越好。表3顯示:本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷氖M項(xiàng)P=0.300 4,其P>0.05,不顯著,說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好,與真實(shí)實(shí)驗(yàn)不存在分歧,該模型可用于本實(shí)驗(yàn)條件下的培養(yǎng)基組分優(yōu)化。根據(jù)軟件計(jì)算結(jié)果,可得各因素對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)值分別為A=1,B=0.02,C=0.29,此時(shí)響應(yīng)值Y為最大值,Ymax=0.275 U/mL。由回歸方程方差結(jié)果可知:決定系數(shù)為0.941,調(diào)整決定系數(shù)為0.865 2,說(shuō)明模型解釋了響應(yīng)變量中大約14%的變異,說(shuō)明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合度較高,可以應(yīng)用于實(shí)際實(shí)驗(yàn)中的分析。

表3 回歸方程顯著性分析

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件得到多元二次回歸方程所代表的響應(yīng)曲面及等高線圖如圖3～5所示,通過(guò)圖形可以直觀反映出3個(gè)因素之間相互作用的影響程度。響應(yīng)面中的曲線彎曲程度不同則代表因素對(duì)結(jié)果的影響不同,越彎曲則說(shuō)明研究因素對(duì)結(jié)果影響越大;等高線越趨近于橢圓,則說(shuō)明研究因素的交互作用對(duì)于響應(yīng)值作用顯著,呈圓形則說(shuō)明交互作用不顯著,顏色過(guò)渡變化的越快表明坡度越大,對(duì)結(jié)果影響越顯著[25]。經(jīng)軟件分析,單個(gè)因素對(duì)酯酶活力的影響比交互項(xiàng)的影響顯著。由圖3可知:隨NH4Cl質(zhì)量的增加,酯酶活力逐漸降低,隨酵母膏的增多,酯酶活力逐漸增高。由圖4可知:玉米淀粉和酵母膏對(duì)酯酶活力的影響均隨每個(gè)因素增大,增加到最大值后再逐漸減小。由圖5可知:隨玉米淀粉的量增加,酯酶活力有所提高,隨NH4Cl增加,酯酶活力先提高后再下降。

圖3 酵母膏和NH4Cl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力的交互影響Fig.3 The interactive influence of yeast extract and NH4Cl mass fraction on enzyme activity

圖4 酵母膏和玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力的交互影響Fig.4 The interactive influence of the content of yeast extract and corn starch on enzyme activity

圖5 NH4Cl和玉米淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活力的交互作用影響Fig.5 The interactive Effect of NH4Cl and corn starch content on enzyme activity

為了驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性,按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度):酵母膏10 g/L,NH4Cl 0.2 g/L,玉米淀粉2.9 g/L,蛋白胨20 g/L,(NH4)2SO40.1 g/L,KH2PO40.1 g/L,MgSO40.1 g/L,CaCl20.1 g/L,在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果為0.263 U/mL,驗(yàn)證值與模型預(yù)測(cè)值0.275接近,說(shuō)明該模型可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化異常威客漢姆酵母Y-1產(chǎn)酯酶的發(fā)酵培養(yǎng)基是可行的,并有較好的適用性。

2.5 香氣物質(zhì)的分析

2.5.1 發(fā)酵液中揮發(fā)性組分總體分析

發(fā)酵液揮發(fā)性組分固相微萃取后,經(jīng)GC-MS分析,總離子流色譜圖如圖6所示,與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),并結(jié)合保留時(shí)間對(duì)待測(cè)樣品中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性,共鑒定出41種揮發(fā)性物質(zhì)。發(fā)酵液中揮發(fā)性物質(zhì)種類包括酯類、酸類、烷類和其他類(酚類、酮類和苯等),但不同類型揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量區(qū)別較大。發(fā)酵液中所含酯類、烷類較多,分別有17,7種,其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為86.23%,2.44%;酸類種類較少,有5種,其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.47%;其他物質(zhì)種類共有12種,相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.86%。

圖6 揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig.6 Total ion chromatography of GC-MS of the volatile components

2.5.2 發(fā)酵液中酯類物質(zhì)鑒定結(jié)果分析

白酒釀造過(guò)程中的酯類物質(zhì)是由酸和醇酯化作用形成,主要形成途徑有白酒發(fā)酵過(guò)程中相關(guān)微生物的代謝反應(yīng)生成;白酒發(fā)酵過(guò)程中添加的大曲及糖化劑催化形成相應(yīng)酯類物質(zhì);通過(guò)單純的有機(jī)反應(yīng)合成酯[28]。這些脂類大多數(shù)會(huì)呈現(xiàn)花香及果香,是白酒中的主要呈香物質(zhì)[29]。經(jīng)分析得到發(fā)酵液中的主要酯類(0.1%以上),物質(zhì)種類及相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)如表4所示。其中己酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(除內(nèi)標(biāo)液乙酸正丁酯),占10.345%,可能為該菌株的特征性酯類物質(zhì),其次質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的分別是乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯和戊酸乙酯,相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.719%,1.216%,0.343%,不同的酯類物質(zhì)有著不同的香氣,構(gòu)成了白酒的不同風(fēng)味特征。比如己酸乙酯,具有強(qiáng)烈的果香;辛酸乙酯,有一定的白蘭地酒香;庚酸乙酯,有菠蘿香氣。

表4 主要酯類成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)表

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了適宜異常威客漢姆酵母Y-1生長(zhǎng)的最適碳源、氮源,然后設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化,最終得到了菌株Y-1的培養(yǎng)基組分,確定了各組分的最佳添加量,并在此組分下驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),酯酶活力達(dá)到0.263 U/mL,是優(yōu)化前的4.3倍,且與預(yù)測(cè)值0.275接近,說(shuō)明該模型具有較好的適用性;利用固相微萃取以及氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)該培養(yǎng)組分下菌株Y-1發(fā)酵液揮發(fā)性成分進(jìn)行提取并分析,共檢測(cè)出17種酯類物質(zhì),其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)占總揮發(fā)成分的86.23%。通過(guò)微生物產(chǎn)酯化酶來(lái)改善白酒品質(zhì)是提升我國(guó)白酒質(zhì)量的一個(gè)研究方向,同時(shí)也為酯酶的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了理論參考。