氰氟草酯對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)

涂杰 沈艷 劉曉敏 武健 董旭 朱偉華 張勇

摘要 [目的]評價97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)。[方法]參考《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》，測定97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)，計算半效應(yīng)濃度LC 50和生物富集系數(shù)BCF。[結(jié)果]97%氰氟草酯原藥對斑馬魚急性毒性為中毒，生物富集等級屬于中等富集性。[結(jié)論]在實際應(yīng)用過程中，氰氟草酯應(yīng)嚴格控制其用量，盡可能減少對斑馬魚和水生生態(tài)系統(tǒng)的危害。

關(guān)鍵詞 氰氟草酯;斑馬魚;急性毒性;生物富集

中圖分類號 X 503.225? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）18-0084-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Acute Toxicity and Bioconcentration of Cyhalofop-butyl in Brachydanio rerio

TU Jie1，2， SHEN Yan2， LIU Xiao-min2 et al

（1.Hefei University， Hefei，Anhui? 230031;2.Institute of Plant Protection and Agro-Products Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei，Anhui? 230031）

Abstract [Objective] To evaluate the acute toxicity and bioenrichment effects of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio. [Method] The acute toxicity and bioaccumulation effect of 97% cyhalofop-butyl on? Brachydanio rerio were determined. The median effective concentration LC 50 and bioconcentration factor BCF were calculated by reference to Test Guidelines on Environmental Safety Assessment for Chemical Pesticides. [Result] The acute toxicity of 97% cyhalofop-butyl on Brachydanio rerio was middle toxic;cyhalofop-butyl was a kind of medium bioconcentration pesticide. [Conclusion] The cyhalofop-butyl should be strictly controlled to minimize the damage to zebrafish and aquatic ecosystem.

Key words Cyhalofop-butyl;Brachydanio rerio;Acute toxicity;Bioaccumulation

作者簡介 涂杰（1993—），男，安徽安慶人，碩士研究生，研究方向：農(nóng)藥環(huán)境毒理。

*通信作者，副研究員，從事除草劑、殺菌劑藥效及安全性評價研究。

收稿日期 2020-12-21;修回日期 2021-02-19

我國是世界范圍內(nèi)最大的農(nóng)藥生產(chǎn)國和使用國之一，每年施用大量的化學(xué)農(nóng)藥用于防治農(nóng)作物病蟲草害[1]。2015年農(nóng)業(yè)部公布我國農(nóng)藥利用率僅為36.6%[2]。其余大部分未被利用的化學(xué)農(nóng)藥則進入自然環(huán)境中，不僅對水體、土壤等生態(tài)系統(tǒng)造成污染，也會導(dǎo)致非靶生物受到不同程度的毒害作用。

水生生物是在農(nóng)藥污染的水環(huán)境中的非靶標生物[1]。魚類作為水生生物中的重要物種，所受到的農(nóng)藥污染危害最大，水質(zhì)污染會對漁業(yè)造成巨大損失[3]。藍色斑馬魚是一種小型雜食性淡水熱帶魚，成魚體長3～4 cm，染色體數(shù)為50條[4]。斑馬魚飼養(yǎng)方法簡單，對水質(zhì)要求不高，水溫25～31 ℃為宜，pH 7～8為最適宜[5]。因此，ISO和OECD已將斑馬魚作為毒理學(xué)測試標準的推薦測試物種，用于測試化合物對生物體的毒性。目前研究最多的是斑馬魚的急性毒性試驗。

氰氟草酯是水稻田應(yīng)用最廣泛的除草劑之一，目前因用量大而使雜草對其產(chǎn)生抗性，其對水生物及水體環(huán)境的影響同樣值得關(guān)注。筆者選用97%氰氟草酯原藥，研究其對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)，旨在為更全面評價氰氟草酯在環(huán)境中的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗生物

藍色斑馬魚（Brachydanio rerio），購自合肥市裕豐花鳥蟲魚市場。試驗用水，曝氣自來水（24 h以上），水溫為21～25 ℃，pH為6.0～8.5，溶解氧含量不低于空氣飽和值的60%，水質(zhì)硬度為10～250 mg/L（以CaCO 3計）。試驗前預(yù)養(yǎng)7 d（與試驗相同的環(huán)境條件下），且試驗前24 h內(nèi)不喂食。

1.2 試驗藥劑

97%氰氟草酯原藥由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所提供。氰氟草酸標準品購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司。99.8%重鉻酸鉀、助溶劑丙酮（分析純）、乳化劑吐溫-80等均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。乙腈、甲醇、乙酸銨、甲酸均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要儀器

萬分之一電子天平、溫度計、水質(zhì)硬度計、溶解氧分析儀、移液器、便攜式pH計、日本島津SHIMADZULCMS-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、高速離心機、渦旋振蕩器等。

1.4 試驗方法

1.4.1 斑馬魚急性毒性試驗。

采用半靜態(tài)法研究97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的急性毒性效應(yīng)[6]。設(shè)置2.000、2.500、3.125、3.906、4.883、6.104、7.629 mg/L 7個濃度組，同時設(shè)空白和助溶劑對照組，每隔24 h更換試驗溶液。試驗時，先向試驗魚缸內(nèi)加入經(jīng)活性炭吸附后的曝氣自來水配制的各試驗溶液，然后將預(yù)養(yǎng)的斑馬魚放入試驗魚缸內(nèi)，每缸7條，不設(shè)重復(fù)。試驗開始時及每隔24 h觀察魚死亡和中毒狀況，并測定各處理濃度和空白對照魚缸內(nèi)水的pH、溶氧量及溫度等。

1.4.2 斑馬魚生物富集試驗。

采用半靜態(tài)法研究97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的生物富集效應(yīng)[7]。根據(jù)急性毒性試驗的96 h-LC 50，設(shè)置3.9×10-2 mg/L（1/100）和0.39 mg/L（1/10）2個濃度組，同時設(shè)空白和助溶劑對照組。每組設(shè)4個重復(fù)，每重復(fù)40條魚。每隔24 h更換試驗藥液，并于0、24、48、96、144、192 h從各處理組中取50 mL試驗藥液和5條魚樣，用于檢測其中的供試藥物及其代謝產(chǎn)物的含量，同時測定pH、水溫、溶解氧含量等并觀察魚中毒和死亡情況。

1.4.3 樣品前處理。

水樣：取2.000 mL離心后的水樣至10 mL塑料離心管，加入2.000 mL色譜純乙腈，渦旋混勻1 min，靜置10 min，過0.22 μm有機濾膜，待測。

魚樣：稱取已勻漿試樣2 g于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶液，振蕩提取40 min，加入1～2 g氯化鈉，振搖2 min，以5 000 r/min離心3 min，取上層溶液2 mL過0.22 μm有機系微孔膜，待測。

1.4.4

儀器分析方法。SHIMADZULCMS-8030液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測條件：色譜柱Shim-pack XR-ODS-Ⅲ，2.0 mm×50 mm，1.6 μm;流動相A-5 mmol/L乙酸銨水溶液+0.02%甲酸;B-甲醇;流速0.4 mL/min;進樣體積2 μL;柱溫40 ℃。

1.4.5

標準曲線的繪制。用甲醇配制1.000、0.800、0.500、0.100、0.080、0.050、0.010、0.005 mg/L氰氟草酯標準品系列標準工作溶液按上述條件進樣分析，以濃度-峰面積繪制氰氟草酯標準曲線，其回歸方程為y=17 993x+61.584，r2=0.994 1。用甲醇配制1.000、0.800、0.400、0.100、0.080、0.040、0.010、0.008 mg/L氰氟草酸標準品系列標準工作溶液按上述條件進樣分析，以濃度-峰面積繪制氰氟草酸標準曲線，其回歸方程為y=89 109x-459.7，r2=0.999 6。結(jié)果表明，氰氟草酯和氰氟草酸分別在0.005～1.000 mg/L和0.008～1.000 mg/L濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.4.6

氰氟草酯和氰氟草酸在水樣中添加回收率測定。分別向試驗用水中添加氰氟草酯和氰氟草酸的標準溶液，濃度均配制為0.2、0.5、1.0 mg/L，采用上述前處理方法和儀器分析方法，測定試驗溶液濃度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。氰氟草酯平均回收率為81.6%～85.3%，相對標準偏差（RSD）為1.8%～2.8%;氰氟草酸平均回收率為79.0%～82.4%，RSD為2.3%～3.7%。

1.4.7

氰氟草酯和氰氟草酸在魚樣中添加回收率測定。在魚樣中分別添加氰氟草酯和氰氟草酸標準溶液，均配制為0.01和0.50 mg/L 2個添加濃度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)。氰氟草酯平均回收率為85.8%～86.0%，RSD為3.5%～3.8%;氰氟草酸平均回收率為78.7%～81.7%，RSD為2.7%～3.9%。

1.5 數(shù)據(jù)方法

統(tǒng)計分析：用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0計算斑馬魚急性毒性試驗LC 50及95%置信區(qū)間。

氰氟草酯殘留總量計算方法：氰氟草酯總量=氰氟草酯含量+氰氟草酸含量×R，其中系數(shù)R=1.186為母體分子量與代謝物分子量比值。

生物富集系數(shù)（BCF）計算公式為BCF = Cfs /Cws，其中，Cfs為平衡時魚體內(nèi)的供試物含量，Cws為平衡時水體中的供試物含量。依據(jù)《準則》判定氰氟草酯對斑馬魚的毒性等級與生物富集等級（表1、2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比試驗結(jié)果

為了解選用斑馬魚的生長狀況及敏感性情況，試驗之前用重鉻酸鉀進行斑馬魚參比試驗。重鉻酸鉀對斑馬魚的參比試驗結(jié)果顯示，其半效應(yīng)濃度24 h-LC 50為245.515 mg/L，95%置信限為212.990～284.946 mg/L。

2.2 氰氟草酯對斑馬魚的急性毒性

試驗過程中空白對照組以及助溶劑對照組的斑馬魚死亡情況與試驗開始時比較無明顯變化。根據(jù)97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的急性毒性試驗結(jié)果，按照理論濃度計算，采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0分析其半致死濃度96 h-LC 50和95%置信限。97%氰氟草酯原藥對斑馬魚急性毒性的96 h-LC 50為3.964 mg/L，95%置信限為3.327～4.737 mg/L（表3）。試驗結(jié)果的毒性等級參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》進行劃分，97%氰氟草酯原藥對斑馬魚毒性等級為“中毒”。

2.3 氰氟草酯對斑馬魚的生物富集效應(yīng)

根據(jù)97%氰氟草酯原藥對斑馬魚的生物富集性試驗結(jié)果，按照生物富集系數(shù)計算公式，97%氰氟草酯原藥96 h-LC 50的1/100試驗處理組中，6 d時水體及魚體中氰氟草酯含量達到平衡，斑馬魚對氰氟草酯的生物富集系數(shù)（BCF 6d）為16.3（表4）。97%氰氟草酯原藥96 h-LC 50的1/10試驗處理組中，6 d時水體及魚體中氰氟草酯含量達到平衡，斑馬魚對氰氟草酯的生物富集系數(shù)（BCF 6d）為28.6（表5）。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》中的標準，判斷氰氟草酯對斑馬魚的富集效應(yīng)等級為中等富集性。

3 結(jié)論與討論

魚類不僅是生態(tài)系統(tǒng)中的重要生物，也是人類的主要食物之一，農(nóng)藥的合理施用對魚類的生存乃至人類的健康至關(guān)重要。因此，農(nóng)藥對魚類的毒性評價工作一直是農(nóng)藥環(huán)境評價的重點[8]。斑馬魚急性毒性試驗是檢測環(huán)境污染物急性毒性的常用方法之一[1]。而魚類生物富集試驗對農(nóng)藥的環(huán)境風(fēng)險評估及其慢性毒性研究具有非常重要的意義[9]。吳遲等[10]和李如美等[11]分別研究了戊唑醇和葉菌唑?qū)Π唏R魚的急性毒性及生物富集效應(yīng)，均表明農(nóng)藥對斑馬魚有一定的毒害效應(yīng)。

該研究選用97%氰氟草酯原藥，研究了其對斑馬魚的急性毒性和生物富集效應(yīng)。結(jié)果表明，97%氰氟草酯原藥對魚類急性毒性表現(xiàn)為中等毒性，生物富集性為中等富集性。

近年來，除草劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的使用量逐年增大，不同種類除草劑對水生生物的研究也越來越受到重視。廖藝鈺等[12]研究了草甘膦農(nóng)藥對斑馬魚的毒性，急性毒性試驗結(jié)果表明草甘膦屬于高毒農(nóng)藥;研究表明，西草凈對斑馬魚的急性毒性為中毒[13]，五氟磺草胺對3月齡幼魚也表現(xiàn)為中等毒性[14];Al-Sawafi等[15]將斑馬魚分別暴露在0.957、1.913 mg/L 的莠去津藥液中，結(jié)果表明斑馬魚能迅速富集該除草劑;何健等[16]報道了二甲四氯和二甲四氯異辛酯在斑馬魚體內(nèi)均有富集效應(yīng)。這表明除草劑對斑馬魚有一定的毒性并能在魚體內(nèi)不同程度的富集。

該研究是在實驗室條件下進行的，氰氟草酯作為水稻田除草劑在水田施用，不可避免會進入水體，自然環(huán)境下農(nóng)藥的毒性效應(yīng)更為復(fù)雜。若要更全面地評估該除草劑在魚體內(nèi)的累積毒性及對環(huán)境的風(fēng)險，仍需進一步開展魚類生命周期或水生生態(tài)模擬系統(tǒng)等方面的研究。因此氰氟草酯在田間使用時，仍應(yīng)注意選擇毒性較低的劑型，嚴格控制用藥量等，科學(xué)合理的使用，盡量減少其對水體環(huán)境以及水生物的影響。

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