駱駝乳清蛋白對熱應激所致大鼠肝氧化損傷的保護作用

烏恩吉雅，馬雪妮，杜冬華，2，哈斯蘇榮，3*

(1.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院 農業(yè)農村部動物疾病診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018；2.河北北方學院動物科技學院 預防獸醫(yī)學重點實驗室，張家口 075131；3.內蒙古駱駝研究院，阿拉善 750300)

隨著全球氣溫升高和現代畜牧業(yè)的飛速發(fā)展，熱應激(heat stress, HS)對動物的影響幾乎不可避免，已給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失[1-2]。當機體產生的熱量超過其將熱量散發(fā)到周圍環(huán)境的能力時，可導致HS的發(fā)生，進而促使動物體核溫度升高，造成采食量、生產性能和繁殖能力降低，亦會影響肉類和乳制品的產量[3]。研究表明，肝損傷是HS病例中最致命的并發(fā)癥，也是導致患病動物死亡的直接原因[4-6]。因此，數十年來，HS誘導的肝損傷一直是國內外學者和畜牧業(yè)關注的焦點。雖然HS導致肝損傷的機制尚未被完全闡明，但有證據表明其涉及氧化應激(oxidative stress, OS)，且提高機體抗氧化能力可緩解HS所致組織損傷[1, 7-8]。因此，增強肝組織的抗氧化能力可能是預防HS所致肝損傷的有效策略。

如上所述，OS參與HS所致肝損傷的機制已被諸多研究證實。當HS引起的體溫升高和代謝過度時可引起組織/細胞內活性氧(ROS)的產生增加。在正常生理條件下，ROS水平可被抗氧化防御機制有效控制，包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽(GSH)等?？寡趸烙到y(tǒng)可通過限制氧化的速度和進程來保護細胞免受氧化應激[8]。然而，當過量產生的ROS超過機體抗氧化系統(tǒng)處理能力時，就會導致OS。反過來，OS通過破壞細胞成分，如蛋白質、脂質和核酸(DNA和RNA)等，引起細胞內蛋白質羰基化(PCO)、脂質過氧化和DNA突變等不良反應，從而導致氧化損傷[9]。如果OS得不到有效控制，這種反應可進而引起廣泛的組織損傷[1]。最近的研究亦證實，ROS的過量產生在HS誘導的肝氧化應激、肝細胞凋亡和壞死過程中發(fā)揮了重要作用[4, 8]。因此，應用抗氧化劑干預，已成為應對這一嚴重并發(fā)癥的重要策略。

目前，已在HS動物模型中證實，抗氧劑對肝具有保護作用[10-12]。天然抗氧化劑因具有安全、有效和廉價等特性已被用于多種疾病的輔助治療。駱駝乳清蛋白(camel whey protein, CWP)是一種強大的天然抗氧化劑，可降低ROS生成、提高GSH含量、緩解氧化應激，且其抗氧化活性顯著高于牛和其它動物源乳清蛋白[13-15]。此外，CWP雖然和牛乳清蛋白成分相似，均由α-乳白蛋白(α-LA)、乳鐵蛋白(LF)、血清白蛋白(SA)、乳過氧化物酶(LPO)、肽聚糖識別蛋白(PGRP)、溶菌酶(LZM)和各種免疫球蛋白(Ig)等組成，但缺乏易引起幼齡動物和嬰幼兒過敏反應的β-乳球蛋白(β-LG)[16]。CWP可通過誘導GSH和抗氧化酶的表達降低HS所致氧化應激和組織損傷[7, 16-17]。近年來，關于CWP的研究大多集中在其獨特的抗糖尿病作用，且證實CWP可調節(jié)氧化應激反應是其治療糖尿病的重要因素[13]。Ebaid等[18]研究亦表明，CWP可通過激活谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)緩解肝脂質過氧化，并可通過增加GSH水平抑制肝氧化應激。本課題組前期在體外試驗中也證實，經過模擬胃腸消化的CWP可通過激活抗氧化信號通路緩解HS誘導的大鼠肝細胞凋亡和損傷[19]。由此可見，CWP的強抗氧化應激作用使其具有潛在的抗HS所致肝損傷的醫(yī)用價值。然而，迄今為止還沒有研究報道在動物模型中CWP對HS所致肝損傷的影響。因此，本研究側重于闡明CWP對HS誘導的肝氧化應激和損傷的保護作用，為其臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

CWP由本實驗室按先前報道的方法制備并保存[19]；組織活性氧(ROS)檢測試劑盒(DHE)購自北京百奧萊博科技有限公司；總SOD 活性檢測試劑盒(WST-8 法)、Western blot及IP細胞裂解液、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；丙二醛(MDA)含量及過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)活性檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；蛋白定量用Pierce BCA Protein Assay Kit，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；大鼠維持飼料購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。

1.2 試驗動物分組及處理

36只6周齡SPF級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自內蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證編號為SCXK(蒙)2015-0001，實驗動物使用許可證編號為SYXK(蒙)2015-0001。SD大鼠試驗期間給予標準的實驗室飼料及清潔的飲水，于(21±1)℃，相對濕度60%～75%環(huán)境中隔離飼養(yǎng)，室內燈光于每天08:00開啟，20:00關閉。將所有大鼠適應性飼養(yǎng)2周后隨機分為6組，每組6只。即HS致肝損傷組(HS)、CWP低劑量干預組(L組)、CWP中劑量干預組(M組)、CWP高劑量干預組(H組)、正常對照組(Control)和CWP對照組(CWP)。L、M和H組灌服CWP(CWP溶于1 mL生理鹽水，劑量分別為100、200和400 mg·kg-1)，Control組和HS組每天灌服1 mL生理鹽水，CWP組每天灌服400 mg·kg-1的CWP，連續(xù)2周。之后，除Control組和CWP組外，其余各組大鼠均按本實驗室前期確定的程序建立HS致大鼠肝損傷模型：將大鼠置于人工氣候箱內(溫度為(40±0.2)℃，相對濕度為60%～65%)HS處理2 h(上午10:00～12:00)，連續(xù)處理8 d。每次HS處理結束后，立即將大鼠移出人工氣候箱并于初始環(huán)境飼養(yǎng)22 h。HS期間，于每次HS處理前1 h灌服上述劑量CWP或生理鹽水。

1.3 肝功能生物標志物AST和ALT檢測

試驗結束后采集各組大鼠血液，1 000×g離心15 min分離血清。按試劑盒說明書操作，用Curve Expert 1.4軟件繪制標準曲線并計算血清樣本中AST和ALT含量。

1.4 HE染色觀察肝組織病理學變化

試驗結束后，將各組大鼠麻醉后處死并采集肝組織。將各大鼠肝組織一部分固定于4%多聚甲醛固定過夜。按常規(guī)方法，組織塊經石蠟包埋并制成4 μm切片后進行HE染色，觀察肝組織病理學變化。剩余大鼠肝組織用預冷PBS沖洗除去血污，于液氮冷凍后置-80 ℃保存，備用。

1.5 檢測肝組織ROS及MDA含量

按試劑盒說明書操作，采用DHE探針檢測ROS含量。取大鼠肝組織50 mg，加入1 mL勻漿緩沖液，充分勻漿后于4 ℃ 1 000×g離心10 min，取上清；采用微量法，于96孔板中依次加入勻漿后的上清190 μL和DHE探針10 μL，混勻；將96孔板于37 ℃避光孵育30 min后用酶標儀檢測熒光強度(Synergy H4, BioTek, USA，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長610 nm)；另取勻漿上清50 μL，采用BCA法測定樣品蛋白含量，以每毫克蛋白熒光強度(RFU·mg-1prot)表示ROS含量。按試劑盒說明書操作，檢測組織勻漿中MDA含量。

1.6 檢測肝組織SOD、CAT及GSH-Px活性

取50 mg肝組織，剪碎后加入200 μL Western blot及IP細胞裂解液，充分勻漿后于4 ℃ 12 000×g離心5 min，取上清用BCA法進行蛋白定量，剩余部分進行后續(xù)檢測。按試劑盒說明書操作，檢測組織勻漿中SOD、CAT、GSH及GSH-Px活性。

1.7 數據統(tǒng)計分析

所有試驗數據均以(Mean±SE)表示，用SPSS 25.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD進行組間比較，結果以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異極其顯著。

2 結 果

2.1 CWP對HS大鼠血清肝功能生物標志物的影響

HS誘導的肝氧化應激可誘發(fā)肝細胞損傷，進而導致肝功能障礙[4]。因此，本研究檢測了大鼠血清中肝功能生物標志物ALT和AST水平，以探討CWP對HS大鼠肝功能的影響。結果顯示，HS組大鼠血清ALT(圖1A)和AST(圖1B)水平和Control組相比極顯著升高(P<0.001)，表明HS處理對大鼠肝有明顯的損傷作用。CWP組大鼠ALT和AST水平和Control組相比差異不顯著(P>0.05)，表明本研究所用CWP劑量無肝毒性。同時可見，CWP以劑量依賴性方式降低了HS大鼠血清ALT和AST水平，其中H組和HS組相比差異極顯著(P<0.01)。本研究在體內試驗中證實，CWP可緩解HS所致肝損傷。

A.ALT水平；B.AST水平；*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001。Control.正常對照組；CWP.CWP對照組；HS.HS致肝損傷組；L.CWP低劑量干預組；M.CWP中劑量干預組；H.CWP高劑量干預組。下同

2.2 CWP對HS大鼠肝組織學變化的影響

由圖2可見，Control 組和CWP組大鼠肝細胞核圓潤位于細胞中央；肝細胞排列呈索狀，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列；肝血竇間隙大小均勻，未見擴張或萎縮；組織中未見水腫、壞死、炎性細胞浸潤等病理變化，組織形態(tài)結構正常，表明CWP無肝細胞毒性。HS組大鼠肝組織部分肝小葉中央靜脈周圍和肝血竇內可見以淋巴細胞為主的炎性細胞彌散性或小灶性浸潤(如黑色箭頭所示)；大量肝細胞水腫和空泡變性，細胞顯著腫脹、胞漿淡染，細胞核固縮、深染(如橙色箭頭所示)、碎裂(如灰色箭頭所示)；大量肝細胞脂肪變性，細胞內可見形態(tài)規(guī)則的圓形空泡(如藍色箭頭所示)；部分中央靜脈和大量肝血竇內可見充滿大量紅細胞(如紫色箭頭所示)。結合“2.1”數據分析，HS可導致大鼠肝組織發(fā)生損傷。然而，重要的是，CWP可以劑量依賴性方式緩解HS誘導的大鼠肝損傷，高劑量組除部分肝小葉匯管區(qū)和肝血竇內炎性細胞浸潤外，肝組織病理學形態(tài)基本恢復正常，表明CWP對HS誘導的大鼠肝損傷有明顯的緩解作用。

2.3 CWP對HS大鼠肝氧化應激標志物的影響

本研究通過檢測肝中ROS和MDA水平，評價了CWP對HS大鼠肝氧化應激的保護作用。結果顯示，HS可誘導大鼠肝組織內ROS(圖3A)及脂質過氧化產物MDA水平(圖3B)極顯著升高(P<0.001)。然而，在HS處理前灌服CWP的大鼠肝中ROS和MDA水平顯著下降(P<0.05)，且呈劑量依賴性。同時，CWP對正常大鼠肝中ROS和MDA水平無影響(P>0.05)。這些結果表明，CWP可在不引起正常機體氧化應激前提下對HS誘導的大鼠肝氧化應激有明顯緩解作用。

圖3 CWP對HS大鼠肝中ROS產生(A)及MDA水平(B)的影響

2.4 CWP對HS大鼠肝中抗氧化防御系統(tǒng)的影響

HS可引起組織中抗氧化酶活性和GSH水平降低，從而導致ROS清除障礙和氧化應激[7]。因此，本研究檢測了HS大鼠肝中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平。結果顯示，HS降低了大鼠肝中SOD(圖4A)、CAT(圖4B)和GSH-Px(圖4C)活性及GSH(圖4D)水平，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。然而，HS處理前灌服CWP的大鼠肝中SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平均有不同程度升高，且呈劑量依賴性。同時可見，CWP亦可明顯增強正常大鼠肝中CAT(P<0.05)及GSH-Px(P<0.05)活性。以上結果表明，CWP可通過上調抗氧化劑水平及抗氧化酶活性提高大鼠肝的抗氧化防御能力，從而保護肝組織免受HS引起的氧化損傷。

3 討 論

隨著全球氣溫升高和集約化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，熱應激(HS)對動物養(yǎng)殖業(yè)的危害已不可避免。據報道，肝損傷及肝功能障礙幾乎是所有HS病例中最常見且致命的病理變化[4]。雖然HS致肝損傷的機制尚未完全闡明，但有證據表明其涉及氧化應激(oxidative stress, OS)[1, 3, 7, 16]。氧化反應在機體的信號轉導中發(fā)揮著非常重要的作用，然而，當該反應產生的ROS超過機體抗氧化防御系統(tǒng)處理能力時就會引起組織發(fā)生氧化損傷[20]。HS引起的肝損傷和功能障礙也是由OS所介導的[11]。因此，應用抗氧化劑，尤其是安全有效的天然抗氧化劑增強機體抗氧化能力，進而緩解HS所致肝損傷已成為研究熱點。乳蛋白通常是通過胃腸消化后釋放的各種生物活性肽的前體，越來越受到國內外學者關注。天然蛋白源的生物活性肽作為營養(yǎng)添加劑或治療藥物最大的優(yōu)點是在體內幾乎沒有毒副作用[13]。CWP已被證實是一種強大的天然抗氧化劑，且其抗氧化活性優(yōu)于牛和其他動物源乳清蛋白，這可能是因為它的抗氧化氨基酸含量較高[13]。本課題組前期的體外研究亦表明，水解的CWP可通過增強大鼠肝細胞抗氧化能力緩解HS所致細胞損傷[19]。在此基礎上，本研究進一步在體內試驗中證實了CWP對HS大鼠肝損傷的保護作用，其機制可能是通過增強肝組織抗氧化防御能力實現的。

本研究觀察到,HS大鼠血清ALT和AST水平升高，表明HS可導致大鼠肝功能障礙。ALT主要存在于肝細胞胞漿中，血清中其水平升高提示肝細胞膜受損，膜通透性增加。AST主要分布在肝細胞的胞漿和線粒體中，血清中其水平升高表明這些細胞器受損[21]。先前有報道稱，駝乳可通過降低這些肝功能生物標志物水平改善酒精性肝損傷，但沒有明確CWP的作用[22]，本研究發(fā)現，HS大鼠肝功能生物標志物水平顯著升高，表明肝細胞及肝功能已明顯受損，而CWP可顯著降低ALT和AST水平。另外，本研究發(fā)現，HS大鼠肝組織病理學變化與肝功能生物標志物水平一致，說明，暴露于HS環(huán)境可顯著破壞大鼠肝組織結構，表現為大量肝細胞水腫和空泡變性，核固縮、碎裂及溶解，炎性細胞浸潤，中央靜脈及肝血竇充滿大量紅細胞等，這些病理改變與近期的另一項研究一致，在該研究中，暴露于HS的大鼠肝組織顯示肝細胞腫脹、空泡變性、壞死、炎性浸潤及出血[4]。而本研究發(fā)現，HS前用CWP進行干預的大鼠，肝損傷程度明顯降低?？傊?，本研究首次提供了進一步證據，證明駝乳的主要成分CWP具有潛在的抗HS所致肝功能障礙及損傷作用。

如前所述，HS誘導的OS，尤其是過量的自由基，如ROS，可通過靶向各種大分子，包括蛋白質、脂質和DNA，誘導肝細胞損傷并導致肝功能障礙[23]。MDA是多不飽和脂肪酸脂質過氧化的產物，也是衡量機體氧化應激水平的常用生物標志物[24]。本研究中觀察到，HS顯著增加了大鼠肝細胞ROS和MDA水平，而 CWP降低了ROS及MDA水平，且呈劑量依賴性，這也是最終緩解了HS所致肝損傷及功能障礙的重要原因。先前的報道表明，水解的CWP含有可有效清除自由基的生物活性肽，因此可作為治療氧化應激相關疾病的營養(yǎng)品或治療肽[25]。針對氧化應激疾病，機體組織/細胞已經進化出防御系統(tǒng)，包括GSH、SOD、CAT、GSH-Px等，從而控制OS的進程，保護組織細胞免受氧化損傷。其中，GSH是抗線粒體功能障礙和凋亡的關鍵抗氧化劑，其水平失衡可能會破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)。SOD、CAT、GSH-Px是控制ROS水平重要的抗氧化酶，通過清除自由基參與抗氧化防御，從而限制氧化的速度和進程，最終保護細胞免受氧化損傷[9]。各種應激因素會降低抗氧化防御系統(tǒng)功能，本研究中亦顯示，HS顯著降低了SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH水平，這是HS導致肝發(fā)生氧化應激的重要因素。本研究發(fā)現，HS前補充CWP的大鼠肝中GSH水平及SOD、CAT、GSH-Px活性均明顯恢復。之前的研究表明，與單獨喂食被黃曲霉毒素污染飼料的動物相比，日糧補充CWP可恢復肝及睪丸中的抗氧化酶活性和GSH水平[13]。另一項研究表明，CWP可通過激活GSH-S-轉移酶減少肝脂質過氧化并增加GSH水平來控制氧化應激[18]。本課題組前期研究亦顯示，水解的CWP可通過增強抗氧化酶活性降低HS誘導的大鼠肝細胞損傷[19]。這些數據表明，增強肝的抗氧化能力可改善各種應激因素引起的肝損傷。另外，本研究顯示，CWP可明顯增強正常大鼠肝中CAT及GSH-Px活性，表明了其可作為營養(yǎng)性添加劑的潛力?？傊?，這些結果提示，膳食補充CWP可以提高大鼠肝的抗氧化能力，從而緩解HS誘導的氧化損傷。

4 結 論

綜上所述，補充CWP可緩解HS所致大鼠肝損傷，其機制可能是提高了肝中GSH水平及SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性，進而有效地緩解了ROS介導的氧化應激，也為CWP作為一種營養(yǎng)性添加劑抵御高溫環(huán)境引起的肝氧化損傷提供了科學依據。