Beclin-1基因shRNA慢病毒載體的構建及其對B16F10細胞自噬及活力的影響

賈艷艷，趙瑩瑩，余祖華，何 雷，廖成水，李 靜，郁 川，張春杰*，李銀聚

(1.河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，洛陽 471000；2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽 471000)

自噬(autophagy)是一種高度保守性的細胞內(nèi)在機制[1]。當細胞處于低氧、低營養(yǎng)、低能量等惡劣條件時，細胞自動激活自噬機制，通過調(diào)控多種自噬相關蛋白ATG和溶酶體產(chǎn)生消化級聯(lián)反應，消化自身內(nèi)部衰老、病變的細胞器，以此維持細胞穩(wěn)態(tài)[2-3]。研究表明，在正常細胞中，自噬能夠通過對線粒體的穩(wěn)態(tài)性轉變和蛋白聚合物的清除來實現(xiàn)其抗腫瘤功能，而自噬基因的缺失會導致線粒體功能障礙，增加細胞的氧化性應激，最終破壞染色體的穩(wěn)定性而導致腫瘤發(fā)生[4-5]。因此在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中，自噬具有促進和抑制腫瘤的雙重作用，已成為生物醫(yī)學界研究的熱點[6]。

自噬蛋白Beclin-1是酵母ATG6的同源基因，主要包含BH3(Bcl-2-homology-3)、卷曲螺旋域(CCD)和保守進化域(ECD)等結構域，其與Ⅲ型磷脂酰肌醇-3-磷酸酯酶(PIK3C3)形成催化核心區(qū)，調(diào)節(jié)其他蛋白在自噬前體結構中的定位，從而調(diào)控自噬活性[7-8]。Beclin-1除了作為自噬核心復合物關鍵蛋白，且在多種腫瘤組織低表達，被認為可能是潛在的抑癌基因[9]。但也有報道Beclin-1基因敲除可抑制骨肉瘤細胞的自噬活性，并降低骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，可作為一個提高抗癌藥物療效的潛在靶點[10]，提示Beclin-1基因在腫瘤生物學中有著復雜且重要的作用。目前，國內(nèi)沒有關于敲除Beclin-1基因的小鼠黑色素瘤細胞B16F10株的報道，因此，本研究以小鼠黑色素瘤細胞B16F10為研究對象，利用RNAi技術構建沉默Beclin-1基因的腫瘤細胞系，為分析Beclin-1基因、自噬與腫瘤三者關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 生物材料及試劑 pMD2G、pSPAX2和穿梭質(zhì)粒[攜帶目的基因或者shRNA(short hairpin RNA, shRNA)]購自漢恒生物；大腸桿菌DH5α、293T細胞由河南科技大學動物疫病與公共衛(wèi)生實驗室保存；B16F10細胞系購自中國科學院腫瘤細胞庫。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、LipofiterTM購自Gibco公司，限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自Fermentas公司，puromycin購自Sigma公司，SYBR Green Master Mix購自TaKaRa公司，LC3多抗、RFP標記Beclin-1兔單克隆抗體和HRP標記羊抗兔IgG購自Proteintech公司。

1.1.2 主要儀器 PCR儀、蛋白質(zhì)電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司，臺式冷凍小離心機FRESCO 21購自Thermo公司，超聲波裂解儀購自Sonics & Materials公司，轉印儀購自Amer Sham公司。熒光定量PCR儀購自Roche公司，倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司。

1.2 shRNA的設計與合成

針對m-Beclin-1參考序列，根據(jù)RNAi序列的設計原則，設計并合成m-Beclin-1基因特異性siRNA靶點，序列如表1所示，以上shRNA由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 shRNA序列

1.3 m-Beclin-1-shRNA慢病毒載體的構建、包裝和滴度測定

經(jīng)預試驗發(fā)現(xiàn)shRNA1的干擾效果最好，將合成的shRNA1 DNA單鏈退火形成雙鏈，連接到慢病毒表達載體，轉化至感受態(tài)細胞DH5α，挑取陽性克隆測序。提取測序正確的陽性克隆質(zhì)粒，與pSPAX2和pMD2G共轉染293T細胞，于轉染后48 h收集細胞培養(yǎng)上清，利用超速離心機純化濃縮病毒，并進行滴度測定。

1.4 Beclin-1干擾穩(wěn)轉細胞系的構建與篩選

將慢病毒以MOI值為1、3、10感染B16F10細胞，感染48 h后觀察細胞熒光情況，摸索慢病毒的最佳MOI值。

將B16F10細胞培養(yǎng)于24孔板，待細胞匯合率約為60%，更換含puromycin的培養(yǎng)基，設定puromycin濃度梯度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·mL-1，每個濃度設3個復孔。2～3 d更換培養(yǎng)基，并保持puromycin濃度不變，觀察細胞的死亡情況，選取能夠殺死全部細胞的最低濃度為最佳細胞篩選濃度。

將過夜培養(yǎng)的B16F10細胞棄去細胞培養(yǎng)基，添加5 μg·mL-1的助感染試劑polybrene(hexadimethrine bromide，聚凝胺)后，將慢病毒以最佳MOI值感染B16F10細胞，用最佳細胞篩選濃度的 puromycin進行篩選培養(yǎng)，每48 h更換含puromycin培養(yǎng)基，待長出單克隆細胞，挑出細胞團，采用有限稀釋法對陽性孔細胞進行亞克隆，重復篩選3～5次，直至獲得穩(wěn)定沉默Beclin-1基因的小鼠黑色素瘤細胞株B16F10-Beclin-1-shRNA1。

1.5 qPCR檢測穩(wěn)轉細胞系的干擾效果

抽提穩(wěn)轉細胞系的總RNA，進行cDNA的合成及純化，最后進行Real-time PCR分析，具體的反應條件：95 ℃預變性15 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，39個循環(huán)，反應結束后分析Beclin-1 mRNA水平的變化。m-Beclin-1基因的PCR引物序列見表2。

表2 引物序列

1.6 熒光顯微鏡觀察穩(wěn)轉細胞系Beclin-1蛋白的表達情況

取生長狀態(tài)良好的穩(wěn)轉細胞系，消化后制備成單細胞懸液，將細胞懸液滴加至12孔板內(nèi)爬片，待細胞貼壁后，固定爬片、RFP標記Beclin-1兔單抗和HRP標記羊抗兔IgG孵育，DAPI避光孵育，封片后在熒光顯微鏡下采集圖像。

1.7 穩(wěn)轉細胞系自噬標志物LC3蛋白表達情況的測定

提取穩(wěn)轉細胞系總蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜后用脫脂牛奶進行封閉過夜，次日與GAPDH一抗(1∶1 000稀釋)、LC3一抗(1∶1 000稀釋)37 ℃ 孵育2～3 h，HRP標記二抗(1∶3 000稀釋)孵育1 h，化學發(fā)光顯色。

1.8 透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬小體的形成

將狀態(tài)良好的B16F10細胞棄掉培養(yǎng)基，更換含40 nmol·L-1的自噬誘導劑雷帕霉素(RAPA)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 h，消化收集細胞，加入戊二醛溶液固定過夜。次日，漂洗4次，1%鋨酸溶液固定1.5 h。漂洗4次，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透過夜。浸透后的樣本放入包埋膠囊的純環(huán)氧樹脂中，烤箱聚合。超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛各染色15 min，透射電鏡觀察并拍照。

1.9 細胞活力的測定

將細胞分別以1.0×104cells·孔-1接種至96孔板，每組細胞重復3次，待長成單層細胞后開始計時，于0、6、12、18、24、36、48、60、72、84、96和120 h后，每組孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，2 h后終止顯色，利用紫外分光光度記測定450 nm波長下各孔吸光度數(shù)值，分析細胞活力狀態(tài)。

1.10 統(tǒng)計與分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇單因素方差分析或t檢驗進行組間比較(*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001)，應用GradPrism5.0軟件作圖。

2 結 果

2.1 m-Beclin-1-shRNA慢病毒載體的測序鑒定

在含有抗性的LB平板上挑取轉化后的重組質(zhì)粒菌，于37 ℃，250 r·min-1條件下?lián)u菌14 h后，將菌液送公司測序。如圖1所示，測序結果(命名為NoName，見圖1)與目標序列(Q1897-2)比對后，與預期相符，表明成功構建了慢病毒載體m-Beclin-1-shRNA。

圖1 序列比對

2.2 慢病毒包裝及病毒滴度的檢測

利用瞬時轉染法，將構建好的包裝載體瞬時共轉染293T細胞系而產(chǎn)生重組慢病毒。隨后將病毒稀釋感染細胞，通過稀釋計數(shù)法計算出病毒滴度為1×108TU·mL-1。

2.3 Beclin-1干擾穩(wěn)轉細胞系的篩選

經(jīng)過puromycin濃度梯度摸索，能夠殺死B16F10空白細胞的最低puromycin濃度為1.5 μg·mL-1。將慢病毒以不同MOI值感染B16F10細胞，選擇感染效率高且細胞狀態(tài)較好的孔，對應為最佳MOI值，48 h后觀察發(fā)現(xiàn)MOI值為1、3、10熒光比例分別為20%、40%、70%左右，本次試驗中慢病毒最佳MOI值為10。

將慢病毒以MOI為10感染B16F10細胞，在puromycin加壓篩選下，利用有限稀釋法最終獲得干擾Beclin-1表達的穩(wěn)轉細胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1，熒光顯微鏡下觀察大多數(shù)細胞發(fā)出綠色熒光，見圖2。

A.B16F10細胞；B.B16F10-m-Beclin-1-shRNA1穩(wěn)轉細胞系

2.4 m-Beclin-1基因的mRNA相對表達水平的測定

經(jīng)TRIzol法提取細胞總RNA，利用qPCR檢測mRNA相對表達水平。如圖3所示，m-Beclin-1-shRNA1在B16F10細胞中有干擾下調(diào)作用，與對照細胞株相比，m-Beclin-1-shRNA1抑制率為75%(P<0.01)。

圖3 Real-time PCR檢測 Beclin-1基因mRNA的表達

2.5 穩(wěn)轉細胞系Beclin-1蛋白的表達量分析

利用Beclin-1熒光抗體檢測穩(wěn)轉細胞系Beclin-1蛋白的表達情況，熒光顯微鏡觀察兩組細胞的熒光強度。如圖4所示，在同一激發(fā)光強度下，B16F10-con-sh細胞內(nèi)Beclin-1蛋白熒光強度明顯高于m-Beclin-1-shRNA1細胞，結果表明穩(wěn)定沉默Beclin-1 B16F10細胞系的Beclin-1蛋白表達水平明顯降低。

圖4 免疫熒光分析Beclin-1蛋白的表達(40×)

2.6 Beclin-1沉默對自噬標志物蛋白LC3表達情況的影響

提取B16F10-m-Beclin-1-shRNA1和B16F10-con-sh細胞總蛋白，利用Western blot方法分析B16F10細胞內(nèi)自噬蛋白LC3的表達情況。如圖5所示，與對照組細胞相比，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細胞系中LC3-Ⅱ的蛋白表達水平顯著降低，降低了61.34%(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低，降低比例為117.93%(P<0.01)，結果表明沉默Beclin-1基因后B16F10細胞自噬被顯著抑制。

A.蛋白電泳圖(1.正常對照細胞 B16F10-con-sh；2.穩(wěn)轉細胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1)；B.LC3蛋白相對表達量

2.7 透射電鏡觀察B16F10細胞內(nèi)的自噬現(xiàn)象

收集細胞、固定、制樣后在透射電鏡下觀察，RAPA刺激后的B16F10-con-sh對照細胞內(nèi)細胞質(zhì)中可見多個散在的雙層膜結構的自噬小體及內(nèi)含細胞器的空泡狀自噬溶酶體，細胞超微結構正常，細胞膜清晰可見，然而RAPA刺激后的B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細胞中自噬小體較少。

A.正常對照細胞B16F10-con-sh；B.穩(wěn)轉細胞系B16F10-m-Beclin-1-shRNA1；N.細胞核；M.線粒體；Ass.自噬溶酶體

2.8 Beclin-1沉默對細胞活力的影響

利用CCK-8方法測定B16F10-m-Beclin-1-shRNA1和B16F10-con-sh細胞在不同培養(yǎng)時間點的OD值，通過公式計算出細胞活力。如圖7所示，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1組細胞活力顯著低于對照組，具有統(tǒng)計學意義。

圖7 CCK-8法測定細胞活力

3 討 論

自噬是一種進化上保守的溶酶體降解途徑，不僅負責細胞質(zhì)成分的更新，還能夠?qū)垢鞣N病原微生物的感染[11]。Beclin-1是自噬相關基因，其表達水平與自噬水平息息相關，且研究證實其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[12-13]。本研究通過RNAi技術成功構建了穩(wěn)定沉默Beclin-l的B16F10細胞系，結果顯示該細胞系Beclin-l基因的 mRNA和蛋白表達得到有效抑制，并且干預Beclin-1基因表達能夠抑制B16F10細胞自噬的發(fā)生，加速B16F10細胞死亡，提示自噬活性與B16F10腫瘤細胞增殖有關。

RNAi能夠特異性沉默靶基因，主要是通過短雙鏈結構誘導靶基因mRNA特異性降解[14-15]。shRNA(short hairpin RNA, shRNA)是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNAi沉默靶基因的表達[16]。本研究根據(jù)shRNA設計原則，同時設計了針對小鼠Beclin-1基因的3個慢病毒shRNA，根據(jù)敲低效果，選取沉默效率最高的一組用于后續(xù)試驗，提高了試驗效率。利用RNAi技術，選擇慢病毒作為載體轉染宿主細胞，慢病毒比腺病毒或逆轉錄病毒有較多優(yōu)勢，它能夠?qū)⒆陨砘蛘系剿拗骰蚪M中，且整合位點處于轉錄相對活躍的區(qū)域，從而獲得更加高效表達或抑制外源基因的穩(wěn)轉細胞系[17]。且本研究所用的穿梭質(zhì)粒攜帶有GFP報告基因，便于觀察轉染效率。本研究將Beclin-1干擾載體轉染293T細胞，在熒光顯微鏡下觀察到大量的綠色熒光，顯示慢病毒包裝成功，病毒滴度為1×108TU·mL-1。本試驗為促進病毒的感染效率，在感染過程中降低培養(yǎng)基中血清的濃度，同時添加5 μg·mL-1的助感染試劑polybrene，polybrene相當于破膜劑，只有細胞膜破了，病毒才有機會進入細胞，研究報道polybrene顯著提高重組腺病毒感染細胞的效率，且在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性[18]。以上研究為下一步篩選穩(wěn)轉細胞系奠定基礎。

構建穩(wěn)轉細胞系時常采用一些抗生素進行篩選，如G418、潮霉素B或puromycin，在篩選前需要先通過抗生素濃度梯度試驗，選擇殺死全部細胞的最低濃度為適合該類細胞的最佳篩選濃度。用G418或潮霉素B，選用在5 d左右出現(xiàn)細胞大批死亡，2周全部死亡的濃度作為篩選濃度。對于puromycin，通常采用在3～4 d殺死全部細胞的濃度。本試驗中慢病毒載體上帶有puromycin抗性基因，細胞感染病毒后則會成功獲得puromycin抗性，因此，本研究在穩(wěn)轉細胞系篩選前，將puromycin濃度梯度設置為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg·mL-1處理B16F10細胞，72 h后觀察細胞的死亡情況，最后確定能夠殺死B16F10空白細胞的最低puromycin濃度為1.5 μg·mL-1。經(jīng)過puromycin加壓篩選成功獲得干擾Beclin-1表達的B16F10穩(wěn)轉細胞系。

Beclin-1是第1個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物自噬相關基因，主要通過與PI3K中的亞基VPS34及其調(diào)控成分VPS15型組成Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶復合物，誘導吞噬泡形成，在自噬體的形成與成熟兩個階段發(fā)揮作用[19-20]。Western blot結果表明，與對照組細胞相比，B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細胞組中LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著降低；電鏡結果顯示，即使在自噬誘導劑RAPA刺激下B16F10-m-Beclin-1-shRNA1細胞內(nèi)自噬小體形成較少，以上結果充分說明沉默Beclin-1表達能夠有效抑制B16F10細胞自噬的發(fā)生。這與張松[21]報道沉默Beclin-1基因可以降低前列腺增生上皮細胞BPH-1的自噬活性相一致。以上結果為研究Beclin-l基因功能與自噬關系提供重要試驗材料。

越來越多研究表明，除調(diào)控自噬外，Beclin-1還可通過非自噬依賴性通路影響腫瘤的發(fā)生和進展[22]。本研究中CCK-8試驗結果顯示，隨著時間的延長，干預Beclin-1表達后的B16F10細胞活力與對照細胞相比顯著下降，說明Beclin-1表達下降能夠促進B16F10細胞死亡。Ye等[23]發(fā)現(xiàn)，Beclin-1基因敲除能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP-9蛋白抑制尤文肉瘤細胞SK-ES-1的增殖、侵襲和遷移。然而一些學者研究表明Beclin-1在肝癌等大多數(shù)腫瘤組織中表達量降低，且Beclin-1表達下降直接促進腫瘤細胞增殖活性[24]，以上結果的不一致推測可能與Beclin-1在調(diào)控腫瘤作用中存在階段性有關。

本研究利用慢病毒介導的RNAi技術構建了穩(wěn)定沉默Beclin-1基因B16F10細胞系，不僅可以有效沉默自噬基因Beclin-1的表達，而且能夠降低B16F10細胞自噬活性，加速B16F10腫瘤細胞死亡。由于自噬的復雜性和階段性，至于沉默Beclin-1基因激活哪些信號通路，從而促進B16F10腫瘤細胞死亡，這需要在后續(xù)試驗中進行探索。以上研究為探討B(tài)eclin-1基因在抗小鼠黑色素瘤中的作用機制奠定重要物質(zhì)基礎。

4 結 論

利用RNA干擾技術構建穩(wěn)定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤細胞系，結果顯示，該細胞系Beclin-l基因的 mRNA和蛋白表達得到有效抑制，并且干預Beclin-1基因表達能夠抑制B16F10細胞自噬的發(fā)生，加速B16F10細胞死亡，提示自噬活性與B16F10腫瘤細胞增殖密切相關，這為探討B(tài)eclin-1基因功能及自噬在抗腫瘤中的作用奠定重要基礎。