慢性束縛應(yīng)激對小鼠攻擊行為的影響及機制探討

陳子衿,劉明妮,董瑩瑩,馬文強,趙茹茜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生理生化重點實驗室/動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

應(yīng)激是指動物機體在受到各種內(nèi)外環(huán)境刺激時表現(xiàn)的非特異性反應(yīng)的總和[1-2]。畜禽生產(chǎn)過程中存在很多應(yīng)激源,這些應(yīng)激源都會對畜禽生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激能減少豬的采食并導(dǎo)致日增重下降,生長發(fā)育受阻[3-4]。熱應(yīng)激也會嚴(yán)重影響蛋雞的生產(chǎn)能力,導(dǎo)致飼料利用率下降,產(chǎn)蛋率降低[5-6]。長期處于免疫應(yīng)激狀態(tài)會導(dǎo)致動物食欲減退,免疫功能下降,生產(chǎn)性能降低[7]。集約化養(yǎng)殖環(huán)境中的眾多應(yīng)激源會抑制動物生長,誘發(fā)疾病,嚴(yán)重損害畜禽生產(chǎn)性能。

應(yīng)激不僅會影響畜禽的生產(chǎn)性能,而且會影響畜禽自然行為的發(fā)生。Meunier-Salaun等[8]報道當(dāng)生長育肥豬處于狹小的環(huán)境時(2.94頭/m2),會減少豬群間的社交行為。束縛應(yīng)激會顯著增加新?lián)P州雞的刻板行為和反抗行為,并且降低雞采食量和產(chǎn)蛋效率[9]。用應(yīng)激激素皮質(zhì)酮處理的雞胚,孵化后其攻擊行為明顯增加[10]。攻擊行為屬于社會行為的一種,但蓄意的攻擊行為以及身體沖突對受害者和侵略者都是潛在的危害[11-12]。與攻擊行為相關(guān)的腦神經(jīng)回路由多個區(qū)域組成,包括前額皮質(zhì)、杏仁核、海馬、下丘腦以及其他相互交聯(lián)的結(jié)構(gòu)[13]。與攻擊行為相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)主要包括5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)[14-15]。5-HT是調(diào)節(jié)雄性間攻擊行為的主要神經(jīng)遞質(zhì)[16],低含量的5-HT與沖動型攻擊行為有關(guān)[17],使用5-HT激動劑能夠降低嚙齒類動物的攻擊性[18-19]。DA是一種由下丘腦合成和分泌的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì),儲存于多巴胺能神經(jīng)元中[20]。DA同樣參與攻擊行為,DA受體拮抗劑能顯著減少雄性小鼠間的攻擊行為[21]。

慢性束縛應(yīng)激是一種非損傷性的心理應(yīng)激方式,可模擬動物機體所處的應(yīng)激狀態(tài)。本試驗采用慢性束縛應(yīng)激方式來建立束縛應(yīng)激模型,探討束縛應(yīng)激對小鼠攻擊行為和5-HT、DA分泌及其相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器光敏攝像機(DCRA-C155,Sony),冷凍離心機(AllegraTM64R,USA),超聲波破碎儀(Vcx130,Sonics),勻漿儀(MS-100R,TOMY),全波長多功能酶標(biāo)儀(Synergy2,BioTek),Real-time PCR儀(Mx3000,Stratagene),核酸定量儀(Nanodrop ND-1000,Stratagene),蛋白質(zhì)電泳儀(Min P4,BIO-RAD),凝膠成像系統(tǒng)(VersaDoc 4000MP,BIO-RAD)等。

1.1.2 試驗試劑Trizol(上海普飛),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(D6110A,南京諾唯贊),BCA總蛋白測定試劑盒(南京生興),實時熒光定量PCR試劑盒(大連TaKaRa),皮質(zhì)酮ELISA試劑盒(ADI-900-097,ENZO),5-HT(H104)、DA(H170)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE,H096)ELISA試劑盒(南京建成)。

1.2 試驗方法

選取52只7周齡C57BL/6J雄性小鼠,隨機分為對照組(control group,Con)和慢性束縛應(yīng)激組(chronic restraint stress group,RS);另選取7周齡雄性及雌性小鼠各12只,配對飼養(yǎng),同樣分為2組(對照組和慢性束縛應(yīng)激組),其中雄性小鼠作為駐留者用于攻擊行為評測,雌性小鼠不做任何處理,僅作陪伴公鼠用;此外,選取12只6周齡雄性小鼠作為入侵者用于攻擊行為評測。適應(yīng)期7 d結(jié)束后,慢性束縛應(yīng)激組小鼠連續(xù)7 d,每天束縛6 h(09:00—15:00);對照組小鼠在此期間禁食禁水,其余時間未做處理;雌性小鼠和入侵者在試驗期間未做任何處理。試驗結(jié)束后,對照組和慢性束縛應(yīng)激組各取12只小鼠(駐留者)進行攻擊行為試驗,其余小鼠麻醉后眼球采血,血液樣品以3 000 r·min-1離心10 min,分離血漿后放入-20 ℃冰箱備用。小鼠全身消毒后剪下鼠頭,迅速分離下丘腦及腦干,快速置于液氮后貯存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 生長性能測定記錄小鼠8周齡初始體重及9周齡終末體重。

1.3.2 小鼠爭斗行為評測在行為測試時,提前1 h將雌性小鼠從駐留者籠中拿出,將入侵者放入駐留者的鼠籠里,開始計時。采用錄像機對動物行為進行錄像,時間為20 min。由觀察者分析第1次攻擊的潛伏期(latency to the first bite,LB)和駐留者對入侵者的總攻擊次數(shù)(total number of attacks,NA)以及總攻擊時間(total duration of attack manifestations,DAM)[22]。爭斗行為包括側(cè)身威脅、追趕、尾巴豎起、防御性直立姿勢和攻擊咬傷[23-24]。綜合評分(compasite aggression score,CAS)計算公式[25]:CAS=NA+0.2×LB+0.2×DAM。

1.3.3 血漿和下丘腦皮質(zhì)酮及神經(jīng)遞質(zhì)含量的測定用相應(yīng)ELISA檢測試劑盒分別檢測血漿皮質(zhì)酮、5-HT、DA、NE和下丘腦中5-HT、DA的含量。

1.3.4 RT-qPCR檢測下丘腦攻擊行為相關(guān)基因表達稱取約40 mg下丘腦組織,用Trizol試劑提取總RNA,分光光度法測定RNA濃度后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后用RT-qPCR檢測下丘腦攻擊行為相關(guān)基因的表達。PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s;60 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s。攻擊行為相關(guān)蛋白基因:乙醛脫氫酶基因(acetaldehyde dehydrogenase gene,Aldh)、兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶基因(catechol-O-methytransferase gene,Comt)、多巴胺轉(zhuǎn)運體基因(dopamine transporter gene,Dat)、多巴脫羧酶基因(dopa decarboxylase gene,Ddc)、多巴胺受體基因(dopamine receptor D gene,Drd)、5-HT轉(zhuǎn)運體基因(5-hydroxytryptamine transporter gene,5-Htt)、5-HT受體基因(5-hydroxytryptamine receptor gene,5-Htr)、色氨酸羥化酶基因(tryptophan hydraxylase gene,Tph)、單胺氧化酶基因(monoamine oxidase gene,Mao)、酪氨酸羥化酶基因(tyrosine hydroxylase gene,Th)以及囊泡單胺類轉(zhuǎn)運體基因(vesicular monoamine transporter gene gene,Vmat),內(nèi)參基因為18SrRNA、β-actin以及Tubulin-α。以對照組目的基因的表達為基準(zhǔn),用2-ΔΔCT法計算各目的基因相對表達量。引物由南京擎科生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

表1 本試驗實時熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time fluorescence quantitative PCR in this study

1.3.5 Western blot檢測下丘腦攻擊行為相關(guān)蛋白的表達小鼠下丘腦樣品用蛋白裂解液RIPA處理后,采用BCA法測定蛋白濃度,而后蛋白樣本加入上樣緩沖液,95 ℃水浴10 min,置于-80 ℃冰箱備用。選取GAPDH蛋白為內(nèi)參,經(jīng)過SDS-PAGE,轉(zhuǎn)印硝酸纖維膜,封閉(40 g·L-1脫脂奶粉,2 h)后,加一抗4 ℃孵育過夜,加TBST緩沖溶液振蕩清洗(10 min,3次),用辣根氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h,再次加TBST洗膜后進行顯影,凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白條帶灰度值。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。攻擊行為相關(guān)蛋白抗體信息:VMAT2(sc-374079)、MAOB(df6464)、TPH2(sc-61700-pr)、DRD1(DF7097)、DAT(DF2243)、GAPDH(mkr227a)、兔二抗(BS10043)、鼠二抗(BS12478)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠生長性能的影響

如表2所示:與對照組相比,束縛應(yīng)激組極顯著降低小鼠終重和平均日增重(P<0.01),且顯著降低小鼠的平均日采食量(P<0.05)。

表2 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠生長性能的影響Table 2 Effects of chronic restraint stress treatment on growth performance of mice

2.2 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠攻擊行為的影響

如表3所示:在20 min的行為觀測期內(nèi),與對照組相比,束縛應(yīng)激顯著縮短小鼠攻擊潛伏期時間(P<0.05),顯著增加小鼠總攻擊次數(shù)(P<0.05)。

表3 慢性束縛應(yīng)激對小鼠攻擊行為的影響Table 3 Effects of chronic restraint stress on aggressive behavior of mice

2.3 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠血漿和下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

如表4所示:與對照組相比,束縛應(yīng)激顯著提高小鼠血漿皮質(zhì)酮含量(P<0.05),對小鼠血漿5-HT、DA及NE水平?jīng)]有顯著影響。此外,束縛應(yīng)激對小鼠下丘腦5-HT和DA的水平也沒有顯著影響。

表4 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠血漿和下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響Table 4 Effects of chronic restraint stress on plasma and hypothalamic neurotransmitters in mice ng·mL-1

2.4 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠下丘腦5-羥色胺代謝相關(guān)基因的影響

如圖1所示:與對照組相比,束縛應(yīng)激組顯著提高小鼠下丘腦中Vmat2、5-Ht1br及Aldh1a1mRNA水平(P<0.05)。

圖1 慢性束縛應(yīng)激對小鼠下丘腦中5-羥色胺代謝相關(guān)基因的影響Fig.1 Effects of chronic restraint stress(RS)on genes related to 5-HT metabolism in mice hypothalamus

2.5 慢性束縛應(yīng)激處理對小鼠下丘腦多巴胺代謝相關(guān)基因的影響

如圖2所示:與對照組相比,束縛應(yīng)激組顯著提高小鼠下丘腦中Vmat2、Ddc及Drd2mRNA水平(P<0.05),且極顯著提高DatmRNA水平(P<0.01)。

圖2 慢性束縛應(yīng)激對小鼠下丘腦中多巴胺代謝相關(guān)基因的影響Fig.2 Effects of chronic restraint stress on genes related to DA metabolism in mice hypothalamus

2.6 慢性束縛應(yīng)激對小鼠下丘腦攻擊行為相關(guān)蛋白的影響

如圖3所示:與對照組相比,束縛應(yīng)激組極顯著降低小鼠下丘腦DAT蛋白水平(P<0.01)。

圖3 慢性束縛應(yīng)激對小鼠下丘腦攻擊行為相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effect of chronic restraint stress(RS)on hypothalamic aggression-related proteins in mice

3 討論

應(yīng)激可降低動物的生長性能。研究發(fā)現(xiàn),免疫應(yīng)激和熱應(yīng)激可降低肉雞飼料利用率,抑制生長[26-27]。飼養(yǎng)密度增大可顯著增加仔豬攻擊行為次數(shù),降低仔豬日采食量和日增重[28]。應(yīng)激類激素地塞米松處理可抑制大鼠采食,降低體重[29]。本試驗結(jié)果顯示,慢性束縛應(yīng)激同樣可顯著降低小鼠采食量,并減少小鼠體重。動物機體基礎(chǔ)代謝率會隨著攻擊行為的發(fā)生而增加[30]。慢性束縛應(yīng)激對小鼠的生長抑制可能與攝食抑制及能量支出增加有關(guān)。

應(yīng)激可影響動物的攻擊行為。研究報道,與對照組相比,減牙和斷尾處理的仔豬表現(xiàn)出更多的攻擊行為[31]。用孤養(yǎng)、晝夜顛倒、非獎賞性挫敗等多種持續(xù)性應(yīng)激方法處理的大鼠攻擊次數(shù)、屈服后繼續(xù)攻擊與攻擊/威脅比這3項指標(biāo)存在顯著性差異[32]。與對照組相比,雄性金蒼鼠每天注射0.4 μg·g-1地塞米松,對入侵者攻擊次數(shù)顯著增多[33]。本試驗結(jié)果顯示,束縛應(yīng)激縮短小鼠攻擊的潛伏期時間,顯著增加總的攻擊次數(shù)。

5-HT和DA系統(tǒng)參與調(diào)控動物爭斗行為。研究發(fā)現(xiàn),高攻擊性的小鼠其前額葉皮質(zhì)內(nèi) 5-HT 水平較低[34],且運輸應(yīng)激可降低大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)部分腦區(qū)5-HT水平[35]。單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)主要降解去甲腎上腺素和5-HT,而單胺氧化酶A(monoamine oxidase A,MAOA)敲除后,幼鼠腦內(nèi)5-HT含量增加9倍,小鼠成年后表現(xiàn)出明顯的攻擊行為[36]。研究表明,反復(fù)經(jīng)歷社會失敗應(yīng)激模型的大鼠中縫核MaoamRNA水平顯著升高[37]。與對照組相比,心理應(yīng)激大鼠的黑質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)的DA水平增加[38]。本試驗結(jié)果顯示,慢性束縛應(yīng)激對小鼠血漿及下丘腦5-HT及DA水平?jīng)]有影響,但顯著降低小鼠下丘腦DAT蛋白表達。DAT能夠轉(zhuǎn)運DA,使DA更多停留在突觸間隙,停止DA的生物學(xué)效應(yīng),對DAT的阻斷會增加成年小鼠的攻擊行為[39]。慢性束縛應(yīng)激對小鼠爭斗行為的影響與下丘腦DAT表達抑制密切相關(guān)。

本試驗結(jié)果顯示:慢性束縛應(yīng)激可顯著降低小鼠體重和采食量,增加其攻擊行為,極顯著降低小鼠下丘腦DAT蛋白表達。