投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹生長、氨基酸代謝和胺類物質沉積的影響

華皓坤,劉文斌,劉婷燕,毛晶,戴永軍,米海峰,黃洋洋,吳業(yè)陽,蔣廣震*

(1.南京農業(yè)大學動物科技學院/江蘇省水產動物營養(yǎng)重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.通威股份有限公司,四川 成都 610041)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis),也稱河蟹,是東亞特別是中國最受歡迎的淡水水產品之一,因其獨特的鮮味和良好的營養(yǎng)價值而廣受消費者喜愛。近年來,中華絨螯蟹養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大,市場需求穩(wěn)步增加,到2019年,中國成蟹的養(yǎng)殖產量達到77.87萬t[1]。然而,在飼料使用方面,卻不盡如人意,目前主要采用投喂冰魚和飼料原料(小麥、玉米、黃豆和餅粕類等)的養(yǎng)殖方式[2]。這些傳統(tǒng)飼料來源不穩(wěn)定,質量不可控,易攜帶致病菌,惡化池塘水質,導致病害爆發(fā)、成蟹品質不穩(wěn)定和養(yǎng)殖效益低等問題,嚴重制約了中華絨螯蟹養(yǎng)殖產業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3]。但是,很多養(yǎng)殖者認為投喂冰魚養(yǎng)殖的河蟹味道更鮮美,并以此誤導消費者,給產業(yè)發(fā)展帶來了巨大的隱患。目前,雖然關于投喂配合飼料和冰魚對河蟹生長、品質和風味影響的研究已有報道[4],但針對不同投喂對河蟹生長、氨基酸代謝和胺類物質沉積的研究仍較少。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是蛋白激酶家族成員之一,mTOR通路是調節(jié)蛋白轉錄的重要通路[5-6]。mTOR可形成mTORC1(mTOR complex 1)和mTORC2(mTOR complex 2)2種復合物,其中,磷酸化后的AKT能使mTORC2在Ser473位點磷酸化從而活化,促進蛋白質合成,而mTOR磷酸化下游的4E-BP則可釋放出翻譯起始因子,并與其他翻譯起始因子結合啟動5′cap-mRNA的翻譯[7-8]。周群蘭[5]對團頭魴研究發(fā)現(xiàn),向植物蛋白源中添加氨基酸可以上調mTOR基因的表達量,并下調4E-BP基因的表達量。

胺類物質,也稱生物胺,常被作為水產品安全的重要監(jiān)測指標,同時也是水產品重要的呈味物質和神經遞質,肌肉中胺類物質的種類和數(shù)量與中華絨螯蟹風味息息相關。胺類物質按其化學結構可分為脂肪族(腐胺、尸胺、精胺和亞精胺等)、芳香族(酪胺、苯甲胺等)和雜環(huán)族(組胺、色胺等)。根據(jù)其組成成分又可分為單胺(組胺、酪胺、苯甲胺等)和多胺(尸胺、腐胺、精胺和亞精胺等)[9]。其中,單胺具有多種生理調節(jié)功能[10-12],多胺中的尸胺、精胺、亞精胺可有效阻止不飽和脂肪酸的氧化,清除自由基[9,11,13-14]。胺類物質在水產品肌肉中呈現(xiàn)出腥味等多種特殊風味,但是在不同水產品種類間,胺類物質沉積規(guī)律有很大的差異。一般來說,胺類物質廣泛存在于魚、蝦、蟹等各種水產品體內,但是不同種類水產品肌肉中胺類物質的含量和種類不同,目前普遍接受的觀點是海水水產品的胺類物質含量高于淡水產品[15-16]。這也導致關于水產品體內胺類物質沉積的研究集中在海水種類,而淡水種類的研究較少[17],食物中胺類物質是否在河蟹體內沉積尚少見報道[9]。在Tapia-Salazar等[18]對蝦的研究中,飼料中添加組胺并不影響蝦的飼料消耗、飼料轉化率和存活率,且對蝦的生長性能不會產生負面影響。鑒于此,本試驗通過對比投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹生長、氨基酸代謝和胺類物質沉積的影響,為胺類物質在中華絨螯蟹體內代謝規(guī)律提供基礎數(shù)據(jù),也為中華絨螯蟹的人工配合飼料開發(fā)提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料與試驗設計

試驗分為2組,分別為配合飼料組和冰魚組,配合飼料組全程投喂人工配合飼料,冰魚組全程投喂冰魚(冷凍的海水雜魚,以鯡科魚為主,購自南京市浦口區(qū)星甸鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū))。每個處理組設6個重復,每個重復8只中華絨螯蟹,6雄2雌。試驗前蟹平均體重27.41 g,投喂56 d。配合飼料購自江蘇興化地區(qū),主要營養(yǎng)成分和氨基酸含量見表1。

1.2 試驗用蟹來源及養(yǎng)殖管理

試驗蟹來源于南京農業(yè)大學水產教學科研基地,運輸?shù)金B(yǎng)殖實驗室后,馴化養(yǎng)殖14 d,投喂商品飼料。試驗在循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展,在每個桶中放置5個波紋塑料管(直徑25 mm,長12 cm)。試驗期間,桶內保持24 h充氧,每天更換30%～50%的水,保持水溫(24±5)℃。每天投喂2次(07:00、17:00),日投喂量約為蟹總生物量的2%～3%。每天觀察并記錄螃蟹的采食、脫殼及死亡情況。

表1 冰魚和配合飼料主要營養(yǎng)成分及氨基酸含量Table 1 Main biochemical composition and contents of amino acid in different feeds %

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖8周后,結束養(yǎng)殖試驗,采集樣本。具體方法:試驗結束時,每個桶收集大小和健康狀況相似的 6只螃蟹,冰上麻醉10 min(低溫可降低螃蟹的活力),然后殺死螃蟹,在冰床上解剖,剝離肌肉,用 4 ℃預冷的生理鹽水(0.89 g·L-1NaCl)徹底清洗,立即在液氮中冷凍,并在-80 ℃下保存供后續(xù)分析。

1.4 氨基酸和胺類物質含量測定

表2 不同飼料中胺類物質的含量(以鮮樣計)

氨基酸測定采用酸水解法[19],利用氨基酸分析儀(日立L-8900)測定。

胺類物質采用高效液相色譜法。具體如下:稱取2.0 g蟹肌肉或飼料樣品于50 mL離心管中,加入10 mL 0.4 mol·L-1高氯酸溶液,均質,于3 000 r·min-1離心10 min,取上層清液移入 25 mL 棕色容量瓶中,再重復提取1次,合并上清液于容量瓶中,用0.4 mol·L-1高氯酸溶液定容至25 mL。衍生處理:1)標準品:取1.0 mL 8種胺混合標準品適當濃度的標準液,加入300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和 2 mL 丙酮配制的10 g·L-1丹酰氯溶液,在40 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光反應45 min后,加100 μL體積分數(shù)為25%的濃氨水,靜置30 min,用乙腈定容到5 mL,振蕩混勻,取1 mL過0.20 μm濾膜的有機相針式濾器后待測;2)樣品:取1.0 mL提取液,依次加入100 μL 2 mol·L-1氫氧化鈉溶液、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液和2 mL 10 g·L-1丹酰氯溶液,同標準品衍生后待測。液相色譜檢測條件:流動相A為乙腈、B為超純水、C為 0.1 mol·L-1乙酸銨。梯度淋洗:0～7 min,45% C→50% C;7～25 min,50% C→10% C;25～35 min,10% C→45% C;35～45 min,45% C。柱溫40 ℃,流速1.0 m·min-1,進樣量10 μL,檢測波長254 nm。

1.5 生長性能指標及其計算方法

中華絨螯蟹增重率(WG)、特定生長率(SGR)、餌料系數(shù)(FCR)的計算公式如下:

WG=(Wt-W0)/W0×100%;SGR=(lnWt-lnW0)/T×100%;FCR=F/(Wt-W0),

式中:W0為中華絨螯蟹初始體重(g);Wt為試驗結束時中華絨螯蟹的體重(g);T為養(yǎng)殖時間(d);F為攝食量(g)。

1.6 氨基酸代謝相關基因表達量的測定

RNA提取:取組織樣0.1 g左右,加入盛有1 mL的Trizol液的EP管,4 ℃下充分勻漿,放置5 min后,加200 μL氯仿,劇烈振蕩15 s左右,然后低溫下12 000g離心10 min;取上清液300～500 μL,加入等體積的異丙酮,充分混勻后室溫放置10 min,再次離心10 min。小心移去上清液,加入500 μL體積分數(shù)為75%的乙醇,混勻后,12 000g離心5 min。重復此操作2次。棄上清液,取沉淀室溫下干燥10 min左右,加DEPC水40～100 μL溶解RNA,然后測定其濃度和質量后,稀釋成相同濃度,進行RNA的反轉錄。

RNA的反轉錄:按照大連寶生物公司試劑盒說明書進行反轉錄。反應采用二步法:第1步42 ℃反應40 min;第2步90 ℃反應2 min,最后4 ℃保存。10倍稀釋后,進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)。

RT-qPCR:1)引物設計:根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的中華絨螯蟹相關基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設計內參基因S27和肌肉TOR、AKT、4E-BP等的引物,并由上海Invitrogen公司合成,其序列參見表3;2)qPCR:根據(jù)TaKaRa SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒說明書進行操作,結果用2-ΔΔCT方法進行分析。

表3 本試驗中RT-qPCR所用引物的序列Table 3 Nucleotide sequences of the primers used in RT-qPCR

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

2 結果與分析

2.1 冰魚和配合飼料投喂對中華絨螯蟹生長的影響

表4 配合飼料和冰魚投喂在中華絨螯蟹生長性能上的比較

由表4可知:配合飼料組和冰魚組中華絨螯蟹的初均重、末均重、增重率、特定生長率均沒有顯著差異(P>0.05),其中配合飼料組中華絨螯蟹的增重率和特定生長率均略高于冰魚組。配合飼料組的餌料系數(shù)顯著低于冰魚組(P<0.05)。

2.2 冰魚和配合飼料投喂對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響

由表5可知:投喂配合飼料組和冰魚組中華絨螯蟹肌肉各種氨基酸、總必需氨基酸、總氨基酸均沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 冰魚和配合飼料投喂對中華絨螯蟹肌肉胺類物質含量的影響

由表6可知:配合飼料組中華絨螯蟹的酪胺含量和腐胺含量顯著高于冰魚組(P<0.05),而尸胺含量和亞精胺含量顯著低于冰魚組(P<0.05)。2組精胺、組胺的差異不顯著(P>0.05),但配合飼料組2者均略低于冰魚組。冰魚組中未檢測到酪胺和腐胺。2組均未檢測到色胺和苯乙胺。對比配合飼料與冰魚中胺類物質含量,發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹肌肉中胺類物質沉積種類和沉積量與攝入的胺類物質種類和量密切相關。

表5 冰魚和配合飼料投喂在中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成上的比較(以鮮樣計)Table 5 Comparison of amino acid composition of Chinese mitten crabbetween trash fish and compound feed(fresh weight basic) mg·100 g-1

表6 冰魚和配合飼料投喂在中華絨螯蟹肌肉胺類物質上的比較(以鮮樣計)Table 6 Comparison of the amines of Chinese mitten crab between trash fishand compound feed(fresh weight basic) mg·100 g-1

2.4 冰魚和配合飼料投喂對中華絨螯蟹AKT、4E-BP、mTOR基因表達量的影響

圖1 冰魚和配合飼料投喂在氨基酸代謝 相關基因表達量上的比較Fig.1 Comparison of expression level of amino acid metabolism related genes between trash fish and compound feed*P<0.05.

由圖1可知:2組飼料對中華絨螯蟹氨基酸代謝相關基因表達量有明顯的影響。配合飼料組的AKT、4E-BP基因的相對表達量顯著低于冰魚組(P<0.05);而冰魚組的mTOR基因相對表達量顯著低于配合飼料組(P<0.05)。

3 討論

3.1 投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹生長的影響

配合飼料具有來源穩(wěn)定、質量可控、投喂方便等優(yōu)點[2],其替代天然餌料飼養(yǎng)中華絨螯蟹已成產業(yè)發(fā)展的必然趨勢[20-21]。而且配合飼料替代冰魚對中華絨螯蟹生長發(fā)育沒有顯著影響[17]。從本試驗結果來看,投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹的初均重、末均重、增重率、特定生長率的影響均無顯著差異,這一結果與楊志剛等[17]的研究結果相似,這表明配合飼料能替代冰魚并滿足中華絨螯蟹生長發(fā)育的需求。闕有清等[22]的研究也顯示,全程投喂配合飼料替代冰魚對中華絨螯蟹成蟹存活和生長發(fā)育等各項指標無顯著影響。但本試驗中,冰魚組的餌料系數(shù)顯著高于配合飼料組,是配合飼料組的2.34倍,這暗示,投喂配合飼料相比于冰魚,可以提高飼料利用率,大幅度降低餌料系數(shù),而不會影響生長性能。楊志剛等[17]對冰魚和配合飼料成本的核算也證明了這一點。近年來,隨著研究者對中華絨螯蟹營養(yǎng)需求、生理特點的深入研究,其營養(yǎng)需求數(shù)據(jù)已經較為全面,基本的配合飼料配方已經能夠滿足中華絨螯蟹生長需要[2]。但關于中華絨螯蟹對各種飼料原料消化率的研究仍未見報道。目前生產中配合飼料的使用率仍然較低,大多數(shù)養(yǎng)殖者仍然采用配合飼料和冰魚間隔投喂的模式,這提示我們,需要在配合飼料標準制定、飼料原料消化率數(shù)據(jù)收集等方面開展進一步工作,加快配合飼料在中華絨螯蟹生產中的廣泛應用。

3.2 投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹肌肉氨基酸組成的影響

水產動物的體組成與餌料的營養(yǎng)成分相關[23-24]。其中,氨基酸組成一定程度上反映了水產動物對飼料中蛋白質的利用程度[25]。馬林等[26]在對珍珠龍膽石斑魚的研究中發(fā)現(xiàn),在配合飼料與冰鮮餌料的蛋白含量無顯著差異的情況下,攝食配合飼料的魚體肌肉中的各項氨基酸均顯著高于冰鮮餌料。本試驗結果表明,配合飼料組的各必需氨基酸含量均略高于冰魚組,且總氨基酸含量也略高于冰魚組,與石婧等[4]的研究結果相似。而投喂的2種飼料中,配合飼料中大部分氨基酸含量均略低于冰魚組,但養(yǎng)殖的中華絨螯蟹中各氨基酸含量略高于或與冰魚組相當,這可能是由于配合飼料中的氨基酸的組成更符合中華絨螯蟹的需要,與冰魚相比較為平衡,從而增加了中華絨螯蟹對氨基酸的利用率和沉積率,可以更經濟地維持中華絨螯蟹肌肉營養(yǎng)品質。

3.3 投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹肌肉胺類物質含量的影響

本試驗結果顯示,配合飼料組的酪胺和腐胺含量顯著高于冰魚組,而尸胺和亞精胺含量顯著低于冰魚組。Tapia-Salazar等[18]研究發(fā)現(xiàn),飼料中組胺含量的不同可以影響蝦體中其他胺類物質的濃度,如亞精胺含量會隨著組胺含量在飼料中的增加而增加,且尸胺、腐胺、精胺等均在蝦體中檢測出。Seidel等[27]認為,組織中多胺的濃度與其代謝能力有關。在本試驗中,尸胺與腐胺只有略微的沉積,這與張金彪[9]的研究結果相似,可能是因為中華絨螯蟹對尸胺、腐胺的代謝能力強,胺氧化酶將尸胺、腐胺氧化成醛類,再進一步氧化成羧酸,從而完成胺類物質的代謝[12]。配合飼料組中的酪胺含量顯著高于冰魚組,可能是由于投喂的配合飼料中含有一定的酪胺,而冰魚中沒有,由于酪胺的前體物質酪氨酸不是中華絨螯蟹的必需氨基酸,可能導致中華絨螯蟹對它的代謝能力不強。冰魚組中的亞精胺含量顯著高于配合飼料組,可能是由于腐胺、精胺轉化為亞精胺[28]。Yang等[29]從組胺對虹鱒和藍蝦的不同影響中認為,水生動物對組胺的反應可能具有種特異性。Tapia-Salazar等[18]認為,在飼料中添加1 200～2 400 mg·kg-1的組胺,可提高蝦的增重率,而本試驗中,配合飼料含有一定組胺含量,投喂后中華絨螯蟹的配合飼料組餌料系數(shù)低于用不含有組胺的冰魚投喂的冰魚組,但增重率無顯著差異,說明中華絨螯蟹的攝食量減少,這可能是由于組胺對中華絨螯蟹生長的促進作用引起的。

對于胺類物質的沉積情況來說,中華絨螯蟹肌肉中沉積的胺類物質的種類和沉積量,與攝入飼料中含有的胺類物質的種類和量有很強的相關性。這一結果暗示,胺類物質可在中華絨螯蟹肌肉中沉積。有研究顯示,一些種類的水生生物不能沉積飼料中的胺類物質,如Opstvedt等[30]對大西洋鮭上的研究表明,飼料中的胺類物質不能沉積到大西洋鮭的肌肉中。也有一些水生生物肌肉中胺類物質的種類和數(shù)量與攝食食物相關,如藍蝦[18]、擬穴青蟹[31]。我們推測,以中華絨螯蟹為代表的甲殼類,可能對胺類物質的代謝能力差,更容易沉積。這一點提示我們可通過控制飼料中胺類物質的種類和比例,調控中華絨螯蟹風味。

3.4 投喂配合飼料和冰魚對中華絨螯蟹AKT、4E-BP、mTOR基因表達的影響

一般認為,mTOR-AKT-4EBP信號通路在蛋白代謝中發(fā)揮重要作用。本試驗中,配合飼料組的AKT和4E-BP基因相對表達量顯著低于冰魚組,而mTOR基因相對表達量顯著高于冰魚組,這可能是由于配合飼料中的氨基酸比例更加平衡,與冰魚相比更加符合中華絨螯蟹的需要,mTOR基因表達量的上調使4E-BP和AKT基因表達量下降,從而促進蛋白質的轉錄。這一結果提示,攝食氨基酸更加合理的配合飼料可能通過激活TOR通路,增強蛋白代謝,降低了餌料系數(shù)。