酸性磷酸酶在5′-肌苷酸生產(chǎn)中的研究進展

孔凡明,王海雷,吳 濤

(通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024)

5′-肌苷酸(Inosine-5′-monophosphate,簡稱IMP)因具有獨特鮮味,通常與5′-鳥苷酸(Guanosine-5′-monophosphate,簡稱GMP)協(xié)同作為各種食品添加劑中的風(fēng)味增強劑,其以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～12%加入谷氨酸中呈味效果比單用谷氨酸鈉高約8倍,有“強力味精”之稱[1-2]。核苷酸的呈味機理和其獨特的分子結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,研究表明:只有5′-碳原子上連接磷酸基團才表現(xiàn)出鮮味,而2′-和3′-碳原子磷酸酯化無鮮味,且5′-碳原子的磷酸基團上的兩個羥基解離才能產(chǎn)生鮮味,因此5′-肌苷酸鮮味劑通常以鈉(或鉀、鈣)鹽的形式存在[3-5]。

肌苷酸生產(chǎn)方法分為酶解法和發(fā)酵法,其中酶解法包括酶解核糖核酸法和酵母菌體自溶法,發(fā)酵法包括肌苷酸直接發(fā)酵法和肌苷發(fā)酵-轉(zhuǎn)化法[6]。酶解核糖核酸法和酵母菌體自溶法原料來源豐富,成本低廉且一次可得到4種核苷酸的混合物,但提取高純度產(chǎn)品難度大,提取工藝繁瑣,導(dǎo)致生產(chǎn)周期長。直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸不僅要考慮解除產(chǎn)物合成代謝過程反饋抑制,而且還要考慮改變細(xì)胞通透性使肌苷酸合成后能正常轉(zhuǎn)運到胞外,由此帶來發(fā)酵工藝復(fù)雜、發(fā)酵周期長、成本高和指標(biāo)難以有效提升等一系列問題[7]。利用發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷不存在直接發(fā)酵法存在的弊端,因此可通過發(fā)酵出肌苷后進一步磷酸化生產(chǎn)肌苷酸[8]。目前,較多生產(chǎn)廠家均采用化學(xué)磷酸化方法生產(chǎn)肌苷酸,其雖然有專一性強、副產(chǎn)物少和磷酸化產(chǎn)率高的優(yōu)勢,但過程所用到的原料成本較高,且對人體及環(huán)境有較大危害。近幾年,隨著環(huán)保觀念的普及和人們綠色發(fā)展理念的不斷提升,酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)核苷酸日益受到科技工作者的廣泛關(guān)注[9]。

1 磷酸化過程酶的選擇

酶轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、不需要保護基團和專一性強等特點,因此具有化學(xué)轉(zhuǎn)化法無法比擬的優(yōu)越性。目前,通過核苷磷酸化生產(chǎn)核苷酸的酶主要有核苷激酶(Nucleoside kinase)和酸性磷酸酶[10],核苷激酶是能將三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸基團特異性地轉(zhuǎn)移到核苷上的一類酶,其反應(yīng)過程為

ATP+核苷→5′-核苷酸+ADP

激酶可用于催化合成多種核苷酸,Hove-jensen等[11-13]就嘗試著利用肌苷/鳥苷激酶生產(chǎn)肌苷酸/鳥苷酸。此方法不足之處在于催化過程需要一直消耗ATP,所以必須同時培養(yǎng)能再生反應(yīng)中消耗ATP的微生物,使核苷激酶在核苷酸生產(chǎn)應(yīng)用中受到極大的限制[14]。

5′-肌苷酸二鈉分子結(jié)構(gòu)式為

酸性磷酸酶(Acid phosphatase/phosphpotransferases,簡稱AP/PTases,EC3.1.3.2)廣泛存在于植物、動物和微生物中。其在酸性條件下能以焦磷酸鹽或聚磷酸鹽等富能量物質(zhì)為底物,特異性地催化核苷合成相應(yīng)的核苷酸[15]。根據(jù)催化底物的不同,可將酸性磷酸酶分為非特異性酸性磷酸酶(NSAPs)和特異性酸性磷酸酶[16-17]。非特異性酸性磷酸酶不表現(xiàn)出明顯的底物特異性,通常能夠水解廣泛的有機磷酸酯,比如核苷酸、葡萄糖-6-磷酸和磷酸二羥基丙酮等[16]。非特性性酸性磷酸酶的分類如表1所示。根據(jù)氨基酸序列同源性的不同,NSAPs可分為A,B,C 3個大類,進一步又可以將A類細(xì)分為A1～A33個亞類,其中研究較多的非特異性酸性磷酸酶為摩根氏菌屬(PhoC-Mm)、鼠傷寒沙門氏菌(PhoN-St)和福氏志賀氏菌(Apy-Sf)[18-19]。由于酸性磷酸酶對多種磷酸化合物均具有脫磷酸活性且過程不需消耗ATP,因此為酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)肌苷酸提供一條新思路[20-21]。

表1 非特性性酸性磷酸酶的分類

酸性磷酸酶不僅具有特異的磷酸轉(zhuǎn)移酶特性,而且還具有5′-核苷酸酶活性,5′-核苷酸酶會將生成的肌苷酸進行水解,在轉(zhuǎn)化過程中會有逆反應(yīng)發(fā)生,因此通過構(gòu)建重組菌株提高過程轉(zhuǎn)化率顯得尤為重要。酸性磷酸酶以焦磷酸鹽和肌苷為底物進行磷酸化和去磷酸化的反應(yīng),其反應(yīng)過程如下:

1) 磷酸轉(zhuǎn)移酶活性,肌苷磷酸化反應(yīng)過程為

Pi inosine

2) 5′-核苷酸酶活性,肌苷酸去磷酸化反應(yīng)過程為

inosine H2O

式中:E為酸性磷酸酶;PPi為焦磷酸鹽;Pi為磷酸鹽。

2 酸性磷酸酶重組菌株的構(gòu)建

最早開展核苷生物法磷酸化研究的為日本學(xué)者Asano等[22],他發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌(M.morganii)中的磷酸化酶對肌苷和鳥苷具有催化作用,可生成相應(yīng)的肌苷酸和鳥苷酸,且催化反應(yīng)效率基本相同。之后Mihara等[23]發(fā)現(xiàn)菌株M.morganiiNCIMB10466發(fā)酵可產(chǎn)生具有選擇性磷酸轉(zhuǎn)移活性的酸性磷酸酶,經(jīng)過提取相關(guān)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并引入一系列突變后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,成功獲得一株高磷酸轉(zhuǎn)移酶活性突變株。使用該突變株進行肌苷酶轉(zhuǎn)化,肌苷酸的收率可達85%。為了進一步提高酶活,Mihara等[24]利用點飽和突變技術(shù)對蟑螂埃希氏菌(E.blattae)的酸性磷酸酶基因上活性位點進行一系列突變獲得突變菌,該突變菌株酸性磷酸酶的活性得到明顯提高。

國內(nèi)學(xué)者在重組酸性磷酸酶菌株的構(gòu)建方面成果豐碩。梁勝華[25]以產(chǎn)氣腸桿菌為出發(fā)菌和以pBV220為表達載體構(gòu)建高效表達溫度誘導(dǎo)型的酸性磷酸酶基因工程菌。將溫度提高到42 ℃誘導(dǎo)4 h即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達。趙洪新等[26]以產(chǎn)氣腸桿菌為出發(fā)菌,獲得酸性磷酸酶基因序列PhoC,將其與不同的載體連接,分別克隆進大腸桿菌構(gòu)建酸性磷酸酶基因工程菌。與野生型相比,工程菌合成肌苷酸活力提高,而水解肌苷酸的活力明顯下降。Liu等[27]通過基因工程技術(shù)合成來源于E.blattaeJCM 1650的酸性磷酸酶基因,并將酸性磷酸酶基因定向克隆并構(gòu)建成表達載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,成功構(gòu)建重組大腸桿菌重組菌,經(jīng)工藝優(yōu)化和IPTG誘導(dǎo)表達后,生物量達3.2 g/L,酶活達145.6 U/L,比優(yōu)化前分別提高1.5倍和2.1倍。沈愛萍等[28]對重組E.coliBL21(DE3)/pET28b-AP/PT開展發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗,確定最佳誘導(dǎo)劑為乳糖,誘導(dǎo)劑乳糖質(zhì)量濃度為10 g/L,最佳誘導(dǎo)時機為OD600在7.0左右,最高酶活可達221.4 U/L。何菊華[15]以大腸桿菌重組菌為出發(fā)菌株,確定獲得高酶活的細(xì)胞發(fā)酵工藝。其中誘導(dǎo)劑最適添加時機為對數(shù)前期,誘導(dǎo)OD600為2.0～2.5,持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h,最高酶活可達1 980.07 U/L。

3 酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化肌苷生產(chǎn)肌苷酸中的研究

酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)肌苷酸中的研究報道主要集中在轉(zhuǎn)化過程菌株選擇與酶處理方式、酶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化和底物濃度優(yōu)化等方面。

3.1 菌株選擇與酶處理方式

不同微生物種屬酸性磷酸酶活力相差較大,為了提高酶轉(zhuǎn)化效率對于菌株選擇顯得尤為必要。Mihara等[29]將來自M.morganii,P.stuarrtii,E.aerogenes,E.blattae,K.planticola的AP/PTase基因分別克隆進E.coli,然后用于催化肌苷合成5′-IMP,并對它們催化效率進行比較。與其他菌株相比,發(fā)現(xiàn)M.morganii更適合用來催化肌苷磷酸化。

酶液狀態(tài)對酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程影響較大,酸性磷酸酶屬于胞內(nèi)酶,對于胞內(nèi)酶一般需要經(jīng)過細(xì)胞破碎將酶釋放到胞外才能發(fā)揮更高的酶活性。Asano等[22]利用M.morganii游離細(xì)胞以焦磷酸鈉和肌苷為底物催化合成肌苷酸,底物肌苷濃度37.3 mmol/L,反應(yīng)9 h,得到肌苷酸濃度11.4 mmol/L,產(chǎn)率30.6%。Asano等[30]進一步利用從M.morganii中純化出的酸性磷酸酶粗酶液催化肌苷磷酸化合成肌苷酸,肌苷濃度80 mmol/L,反應(yīng)6 h,最終得到肌苷酸濃度32.6 mmol/L,收率41%,對比利用游離細(xì)胞指標(biāo)有進一步提升。趙洪新等[31]以產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)AM 1183研究酶液狀態(tài)對轉(zhuǎn)化過程的影響,發(fā)現(xiàn)破碎細(xì)胞液在轉(zhuǎn)化肌苷合成肌苷酸方面優(yōu)于靜息細(xì)胞。

3.2 酶轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

在酶轉(zhuǎn)化過程,轉(zhuǎn)化溫度和pH對酶轉(zhuǎn)化過程影響較大。在適宜的轉(zhuǎn)化條件下,酶轉(zhuǎn)化效率能得到大幅提升[32]。綜合前人研究酸性磷酸酶一般最佳轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃,最佳轉(zhuǎn)化pH為4.5。張玲[33]對構(gòu)建重組大腸桿菌進行酶學(xué)性質(zhì)研究,確定該酶的最適pH為5.0,最適反應(yīng)溫度為30 ℃。進一步考察靜息細(xì)胞特異性磷酸化過程的影響,得到靜息細(xì)胞最適反應(yīng)溫度為35 ℃。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?7 mmol/L時,5′-肌苷酸的收率達到83.3%。永井秀忠等[34]利用三聚磷酸鈉為底物制備呈味核苷酸二鈉,在酶轉(zhuǎn)化優(yōu)化過程中確定最佳pH為4.5,最佳溫度為35 ℃,并指出pH是影響酶解轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵因素。孫麗慧等[35]對游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞反應(yīng)條件對比發(fā)現(xiàn),經(jīng)過固定化后的酸性磷酸酶最適轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃,稍高于游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度。二者最適反應(yīng)pH均為5.0,但固定化后的酸性磷酸酶作用pH較游離細(xì)胞更寬泛。酸性磷酸酶經(jīng)過固定化后操作穩(wěn)定性較好,重復(fù)使用12批后相對酶活力仍在54.5%。

3.3 底物濃度優(yōu)化

酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化肌苷過程的磷酸供體主要為多聚磷酸及其鹽,如焦磷酸、焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽等。通過對肌苷和磷酸鹽質(zhì)量濃度的優(yōu)化,在發(fā)酵成本控制、酶轉(zhuǎn)化效率提升和成品提取精制等方面均有重要作用[36]。梁勝華[25]以產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)為出發(fā)菌株構(gòu)建的溫度誘導(dǎo)性酸性磷酸酶基因工程菌進行肌苷酶轉(zhuǎn)化實驗。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 g/L肌苷+300 g/L焦磷酸鈉時,反應(yīng)2 h可得到肌苷酸質(zhì)量濃度為90.6 g/L,收率為92%。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度提高到100 g/L肌苷+300 g/L焦磷酸鈉時,反應(yīng)7 h可得到肌苷酸質(zhì)量濃度為153.7 g/L,收率為78%。李文峰等[37]使用磷酸轉(zhuǎn)移酶工程菌菌體細(xì)胞催化肌苷5′-位磷酸化的工藝條件,研究結(jié)果表明:在整細(xì)胞PhoC酶活45 U,肌苷濃度100 mmol/L,焦磷酸濃度120 mmol/L時,反應(yīng)6 h,肌苷轉(zhuǎn)化率達到63.36%。在添加0.3%表面活性劑Trion-x-100時,肌苷轉(zhuǎn)化率可提高到74.59%。Yuan等[38]用M.morganii酸性磷酸化酶突變株全細(xì)胞進行生物催化生產(chǎn)肌苷酸的研究,底物濃度為肌苷120 mmol/L和焦磷酸鈉200 mmol/L時,反應(yīng)7 h,肌苷酸產(chǎn)率為99.65%,此為目前報道最高指標(biāo)。

4 總結(jié)與展望

酸性磷酸酶催化肌苷/鳥苷制備呈味核苷酸反應(yīng)條件溫和,不需要保護基團和提供ATP,而且磷酸酶具有專一性強的優(yōu)點。日本味之素公司最早采用酸性磷酸酶轉(zhuǎn)化工藝工業(yè)化生產(chǎn)呈味核苷酸,產(chǎn)量占日本呈味核苷酸總產(chǎn)量39%以上。酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)核苷酸尚未在國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。限制因素主要為生產(chǎn)成本高、酶活力不穩(wěn)定、成品分離提純難度大和收率低等諸多問題。針對上述瓶頸,近年來在酶法轉(zhuǎn)化核苷酸過程中,不斷有新工藝得到報道與應(yīng)用,研究方向主要集中在酶的高效轉(zhuǎn)化、磷酸鹽的回收利用和鳥苷酶法磷酸化等工藝過程,工藝指標(biāo)穩(wěn)定提升的同時,一系列存在的生產(chǎn)難題也在不斷得以解決和實現(xiàn)突破,相信在技術(shù)成熟后酸性磷酸酶轉(zhuǎn)化法必將為核苷酸生產(chǎn)帶來巨大變革。