CC類趨化因子配體2對結(jié)核分枝桿菌感染人單核巨噬細胞THP-1自噬的影響及分子機制

李秀萍，王 玲，王 馨，嚴曉蕓，董 力

結(jié)核病是一種嚴重的傳染病，由結(jié)核分枝桿菌感染引起，對人類健康構(gòu)成了巨大威脅。有流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，近年來我國結(jié)核病病例顯著增加[1]。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌是一種細胞內(nèi)病原體，可寄生于宿主巨噬細胞，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)及吞噬體酸化、成熟等不同機制調(diào)節(jié)宿主細胞死亡[2]。巨噬細胞能夠殺滅微生物，但結(jié)核分枝桿菌仍然能夠克服巨噬細胞的殺微生物機制而存活并復(fù)制[3]。自噬促進受損細胞器和錯誤折疊蛋白質(zhì)降解，在抗菌防御機制中起著關(guān)鍵作用。重要的是，自噬既可以調(diào)節(jié)宿主對分枝桿菌感染的抗性，又可以控制細胞的存活[4]。CC類趨化因子配體2(CCL2)是一種調(diào)節(jié)單核細胞和巨噬細胞向感染部位遷移和滲透的關(guān)鍵趨化因子，其水平與結(jié)核病嚴重程度相關(guān)[5]。有研究顯示，CD44能夠促進結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞中CCL2的表達[6]。還有研究表明，CCL2參與調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞的自噬[7]。然而，現(xiàn)臨床尚未確定CCL2對結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的影響。因此，本研究探討CCL2對結(jié)核分枝桿菌感染人單核巨噬細胞THP-1自噬的影響及分子機制，以期為結(jié)核病的防治提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細胞株和主要試劑 結(jié)核分枝桿菌H37Rv株和人單核巨噬細胞THP-1(美國ATCC)；RPMI 1640培養(yǎng)基和青-鏈霉素雙抗(美國HyClone)；胎牛血清(美國Gibco)；Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen)；TRIzol試劑(北京索萊寶)；PrimeScript RT試劑盒和Green Premix Ex Taq Ⅱ(日本TaKaRa)；CCL2 siRNA和siRNA control(廣州銳博生物)；CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗(美國CST)；RIPA裂解液(上海碧云天)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(賽默飛世爾)。

1.2細胞培養(yǎng) THP-1細胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液加1%青-鏈霉素雙抗中進行培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，觀察細胞生長狀態(tài)并及時更換培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化細胞并傳代處理，選取生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3H37Rv感染THP-1細胞 將傳代的THP-1細胞接種到6孔板中，接種密度為1×106/ml，向每孔中加入濃度為150 ng/ml的佛波酯(PMA)(美國Sigma公司)溶液，37 ℃培養(yǎng)箱誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h，去上清，PBS沖洗3次，再向每孔中添加2 ml無血清無雙抗的培養(yǎng)液，將H37Rv以MOI=5感染細胞[8]，37 ℃培養(yǎng)箱感染4 h，棄上清，更換成新的培養(yǎng)液，此時記為感染0 h，測定CCL2 mRNA和蛋白表達，隨后分別在感染6、12、24和48 h時測定CCL2 mRNA和蛋白表達。

1.4細胞轉(zhuǎn)染和分組處理 待THP-1細胞貼壁良好，根據(jù)Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說明書分別將CCL2 siRNA或siRNA control轉(zhuǎn)染至THP-1細胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換完全培養(yǎng)液，實驗分為Mock(對照)組、H37Rv(感染)組、H37Rv+si-NC(降低CCL2感染對照)組和H37Rv+si-CCL2(降低CCL2感染)組，其中H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組的THP-1細胞于轉(zhuǎn)染48 h后，將H37Rv以MOI=5進行感染，并在H37Rv+si-CCL2組中添加濃度為150 ng/ml的NF-κB信號通路激活劑PMA進行干預(yù)作為H37Rv+si-CCL2+PMA組，24 h后分別收集各組細胞進行相關(guān)指標的檢測。

1.5RT-PCR檢測CCL2 mRNA表達量 使用TRIzol試劑分離待測各組THP-1細胞中總RNA，使用PrimeScript RT試劑盒對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，按照使用說明書采用Green Premix Ex Taq Ⅱ進行RT-PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt分析CCL2 mRNA表達量。GAPDH上游引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。CCL2上游引物：5'-GCTCCGGGCCCAGTATCT-3'，下游引物：5' -ACAGGGAAGGTGAAGGGTATGA-3' 。

1.6Western blot檢測CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α蛋白表達量 將待測THP-1細胞在裂解緩沖液中裂解以提取總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，隨后將蛋白質(zhì)用15%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與一抗(CCL2、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、p65、IKK-α和IκB-α均為1∶1000稀釋)在4 ℃下孵育過夜，然后將膜與二抗(1∶3000稀釋)一起孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，采集圖像獲得條帶，以GAPDH進行標定，使用Image J軟件分析目的蛋白相對表達水平。

1.7菌落形成單位計數(shù)分析H37Rv胞內(nèi)存活率 將降低CCL2表達的THP-1細胞以2×105/孔接種到6孔板中，貼壁后將H37Rv以MOI=5進行感染，6 h后棄上清，PBS沖洗3次，加入含20 μg/ml阿米卡星(山東齊魯制藥有限公司)的培養(yǎng)液，殺死未進入細胞的H37Rv，在第4天以0.1%的Triton X-100裂解細胞，以10倍梯度稀釋，涂布在7H11平板中，在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周，進行菌落計數(shù)分析H37Rv胞內(nèi)存活率。

2 結(jié)果

2.1H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達 H37Rv感染THP-1細胞不同時間CCL2 mRNA和CCL2蛋白總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。H37Rv感染THP-1細胞6 h CCL2 mRNA和CCL2蛋白開始逐漸升高，隨著感染時間延長CCL2 mRNA和CCL2蛋白持續(xù)升高，于24 h達到最高水平，48 h又有所降低。H37Rv感染THP-1細胞不同時間CCL2 mRNA和CCL2蛋白兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1和圖1。后續(xù)實驗選擇感染時間為24 h。

表1 不同時間H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達比較

圖1 不同時間H37Rv感染THP-1細胞中CCL2蛋白表達

2.2CCL2在H37Rv感染THP-1細胞中轉(zhuǎn)染效率 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達H37Rv組和H37Rv+si-NC組均升高；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv感染THP-1細胞中CCL2 mRNA和CCL2蛋白表達H37Rv+si-CCL2組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2和圖2。

表2 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2表達比較

圖2 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中CCL2蛋白表達

2.3CCL2降低對H37Rv感染THP-1細胞自噬影響 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv組和H37Rv+si-NC組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達升高，LC3-Ⅱ表達降低；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv+si-CCL2組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達降低，LC3-Ⅱ表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3和圖3。

圖3 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

表3 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

2.4CCL2降低對H37Rv胞內(nèi)存活影響 H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組H37Rv胞內(nèi)存活率分別為(100.00±9.22)%、(98.57±9.14)%和(46.88±4.52)%。3組H37Rv胞內(nèi)存活率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。H37Rv組和H37Rv+si-NC組H37Rv胞內(nèi)存活率明顯高于H37Rv+si-CCL2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.5CCL2對H37Rv感染THP-1細胞中NF-κB信號通路激活影響 Mock組、H37Rv組、H37Rv+si-NC組和H37Rv+si-CCL2組4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與Mock組比較，H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達H37Rv組和H37Rv+si-NC組均升高；與H37Rv組和H37Rv+si-NC組比較，H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達H37Rv+si-CCL2組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4和圖4。

圖4 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達

表4 采用不同處理方式4組H37Rv感染THP-1細胞中p65、IKK-α和IκB-α表達比較

2.6PMA逆轉(zhuǎn)CCL2降低對H37Rv感染THP-1細胞自噬影響 與H37Rv+si-CCL2組比較，H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ和p62表達升高，LC3-Ⅱ表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表5和圖5。

圖5 H37Rv+si-CCL2組和H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達

表5 H37Rv+si-CCL2組和H37Rv+si-CCL2+PMA組H37Rv感染THP-1細胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和p62表達比較

3 討論

結(jié)核分枝桿菌感染肺部時，將導(dǎo)致結(jié)核病的發(fā)生，結(jié)核病是一種高病死率的傳染病[9]。到目前為止，尚沒有有效疫苗可以預(yù)防所有的結(jié)核分枝桿菌菌株，當前結(jié)核病的藥物治療面臨耐藥性的障礙，故現(xiàn)迫切需要弄清結(jié)核分枝桿菌感染的病理機制，以便可以確定有效的治療靶標和診斷生物標志物[10]。在體內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌具有較長的潛伏期，這給結(jié)核病診斷和治療帶來了挑戰(zhàn)，而及時的診斷和治療對遏制結(jié)核病的傳播具有重要意義。越來越多的研究表明，結(jié)核分枝桿菌可以改變基因表達，從而導(dǎo)致免疫逃逸[11-12]。以往研究發(fā)現(xiàn)，CCL2在肺結(jié)核患者中異常表達，提示它可能在肺結(jié)核發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H37Rv感染THP-1細胞能夠升高CCL2的表達，降低CCL2的表達可通過阻斷NF-κB信號通路抑制H37Rv感染THP-1細胞自噬。

人體防御機制是病原體入侵研究必不可少的內(nèi)容。自噬是許多類型病原體感染的關(guān)鍵防御機制[14]。自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要生理過程，可促進細胞存活，為抵抗微生物入侵的重要防御機制。然而，在分枝桿菌感染中，分枝桿菌利用自噬以確保其細胞內(nèi)存活[15-16]。因此，在分枝桿菌感染中發(fā)現(xiàn)自噬過程背后的主要調(diào)節(jié)劑具有重要意義。本研究探討CCL2對結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的影響。首先，本研究評估了CCL2和結(jié)核分枝桿菌之間的關(guān)系，觀察到結(jié)核分枝桿菌以時間依賴的方式升高CCL2的表達水平。接著，本研究確認由結(jié)核分枝桿菌改變的防御機制是否與CCL2的異常表達有關(guān)。然后，本研究探討CCL2表達降低對巨噬細胞自噬及結(jié)核分枝桿菌存活的影響。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)CCL2表達降低增強了正常巨噬細胞自噬，并抑制結(jié)核分枝桿菌的存活。這一發(fā)現(xiàn)證實了結(jié)核分枝桿菌對細胞自噬的影響是通過CCL2表達降低實現(xiàn)的，這表明CCL2可能為肺結(jié)核提供了新的治療靶點。以往研究顯示，在結(jié)核病患者中NF-κB信號通路異?；罨医Y(jié)核分枝桿菌感染后能夠激活NF-κB信號通路[17-18]。有研究顯示，大豆凝集素誘導(dǎo)的自噬通過產(chǎn)生活性氧并通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗結(jié)核分枝桿菌的作用[19]。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中NF-κB信號通路關(guān)鍵蛋白p65、IKK-α和IκB-α表達升高，而降低CCL2能夠有效抑制p65、IKK-α和IκB-α的表達。此外，NF-κB信號通路激活劑PMA能夠逆轉(zhuǎn)CCL2降低對結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬的抑制作用。以上結(jié)果表明CCL2可能通過抑制NF-κB信號通路調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞自噬。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細胞中CCL2表達升高，降低CCL2能夠激活自噬并抑制結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)存活，其作用機制與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。CCL2似乎是結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞中宿主防御機制的一部分，本研究結(jié)果有助于進一步了解細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)在防御細菌感染中的調(diào)控機制，為結(jié)核病的治療提供實驗基礎(chǔ)。