瀕危龍樹科植物DNA條形碼鑒定方法

李井干 吳晶 劉曉宇 許忠祥 李洋 郭靜 伏建國(guó) 楊曉軍

摘要：為了建立瀕危龍樹科植物DNA條形碼鑒定方法，本研究選取rbcL、matK、ycf1b等3對(duì)引物對(duì)9種21份龍樹科植物進(jìn)行DNA提取、序列擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序，比較序列擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率;應(yīng)用DNASTAR Lasergene 軟件對(duì)測(cè)得的雙向序列進(jìn)行拼接;使用MEGA-X軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析種內(nèi)和種間變異;使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹。結(jié)果表明，ycf1b序列可以區(qū)分龍樹科4個(gè)屬的植物，聚類效果好，種間存在可靠序列差異，可作為龍樹科植物DNA條形碼鑒定的有效序列片段。

關(guān)鍵詞：龍樹科;DNA條形碼;聚類分析;物種鑒定;基因片段

中圖分類號(hào)：S184?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）17-0063-04

收稿日期：2021-01-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)量基礎(chǔ)的共性技術(shù)研究與應(yīng)用（編號(hào)：2017YFF0210300、2017YFF0210305）。

作者簡(jiǎn)介：李井干（1987—），男，山東滕州人，碩士，農(nóng)藝師，主要從事瀕危物種鑒定方面的研究。E-mail：570109771@qq.com。

龍樹科（Didiereaceae）別稱刺戟木科，原產(chǎn)非洲馬達(dá)加斯加島的南部，當(dāng)?shù)靥赜蟹N，是多肉植物中一個(gè)重要的科。按照恩格勒分類系統(tǒng)，龍樹科被分為4屬，分別是亞龍木屬[Alluaudia （Drake） Drake]、枝龍木屬（Alluaudiopsis Humbert & Choux）、曲龍木屬（Decarya Choux）和刺戟木屬（Didierea Baill）[1]，全科11種均被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅱ。龍樹科刺奇葉美，具有很高的觀賞價(jià)值，世界多地有引種栽培。另外，龍樹科還是一類重要的資源植物，刺戟木屬（Didierea Baill）的阿修羅城（Didierea trollii）還是馬達(dá)加斯加當(dāng)?shù)匾环N環(huán)尾狐猴的美味佳肴，對(duì)維護(hù)自然生態(tài)系統(tǒng)也起著重要作用[2]。由于環(huán)境氣候變化、過度采集利用等原因，導(dǎo)致龍樹科植物淪為瀕危植物，亟需準(zhǔn)確快速的物種鑒定方法來(lái)加強(qiáng)龍樹科植物的保護(hù)。雖然龍樹科的分類鑒定研究較早，但也只是局限在形態(tài)特征和理化結(jié)構(gòu)[3]，龍樹科DNA條形碼鑒定方法尚未有報(bào)道，且龍樹科條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)在物種豐富度及數(shù)量上都相對(duì)不完整，仍需進(jìn)行大量研究。

DNA條形碼（DNA barcoding）是依據(jù)1條或幾條短的DNA片段的序列差異作為物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)的分子鑒定方法[4]。植物體內(nèi)葉綠體含量高，容易提取和擴(kuò)增，因此植物DNA條形碼多選用葉綠體基因組DNA片段。常用的葉綠體片段有rbcL、matK、trnH-psbA、rpoB、accD、YCF5等[5]。植物家族種類龐大，不同類群存在較大遺傳差異，序列通用性差;且種內(nèi)序列差異性小、識(shí)別率低，因此，篩選可靠準(zhǔn)確的DNA條形碼至關(guān)重要。

本研究選用rbcL、matK和ycf1b序列對(duì)龍樹科4屬9種21份樣品進(jìn)行物種鑒定和聚類分析，建立龍樹科物種的分子鑒定方法，同時(shí)補(bǔ)充完善龍樹科植物DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為瀕危植物分類鑒定研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品：龍樹科植物樣品數(shù)量及來(lái)源見表1。采集樣品均為活體植株，隨機(jī)取其葉片進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

先將供試樣品進(jìn)行表面消毒，將植物葉片研磨成粉，參照DNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書上的步驟方法，提取試驗(yàn)樣品基因組DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇在植物中使用較廣泛的葉綠體基因組rbcL[6]序列、matK[7] 序列和ycf1b[8]序列作為DNA條形碼候選序列。擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件見表2。擴(kuò)增體系為25 μL：TaKaRa rTap酶11 μL，引物各0.5 μL，模版DNA 2 μL，滅菌水補(bǔ)足反應(yīng)體系至25 μL。按照反應(yīng)體系在TaKaRa PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果理想的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京思普金生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNASTAR Lasergene 軟件包中的Seqman程序?qū)y(cè)序獲得序列進(jìn)行組裝和校對(duì)，去除低質(zhì)量區(qū)和引物區(qū)，獲得rbcL、matK和ycf1b這3種DNA條形碼序列。再運(yùn)用MEGA-X軟件對(duì)候選條形碼序列進(jìn)行序列分析，用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并用自舉檢驗(yàn)法（Bootstrap 1 000 次）檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

以龍樹科21份樣品為模板，用3條目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果顯示，DNA擴(kuò)增成功率和雙向測(cè)序成功率均為100%。rbcL序列大小均為 553 bp，matK序列大小為均925 bp，ycf1b序列大小均為889 bp。rbcL序列變異位點(diǎn)較少，matK序列和ycf1b序列的變異位點(diǎn)較多，長(zhǎng)度也較長(zhǎng)，具體信息見表3。

2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析

由于rbcL序列種間差異較小，因此選用matK和ycf1b 這2種序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹（圖1）。序列聚類樹聚類結(jié)果表明，ycf1b序列可以將21份樣品的各屬物種聚成一支，除阿修羅城（Didierea trollii） 3個(gè)樣品外，各物種的多條序列也分別聚為一支。matK序列屬間物種能夠被分開，物種間不能各自聚為一支。

2.2 種間和種內(nèi)變異

21份龍樹科樣品ycf1b序列長(zhǎng)度均為889 bp，其中變異位點(diǎn)有14個(gè)。龍樹科植物種內(nèi)序列并無(wú)差異，屬、種間存在特有變異位點(diǎn)。彎曲龍屬（Decarya Choux）2份樣品D03、D09在337號(hào)和299號(hào)位分別存在特有變異位點(diǎn)G→C、T→A;亞龍木屬[Alluaudia（Drake） Drake]14份樣品在205號(hào)位存在特有變異位點(diǎn)G→T，屬內(nèi)也存在變異位點(diǎn)可以將各物種區(qū)分開來(lái);枝龍木屬（Alluaudiopsis Humbert & Choux）樣品D21在58號(hào)、316號(hào)、357號(hào)和385號(hào)位分別存在特有變異位點(diǎn)G→T、C→T、T→C、T→C;刺戟木屬（Didierea Baill）樣品D02、D15和D19在522號(hào)位存在變異位點(diǎn)G→C，可以將該屬內(nèi)2種植物進(jìn)行區(qū)分（表4）。這些關(guān)鍵變異位點(diǎn)均可以作為龍樹科種屬間鑒定的關(guān)鍵依據(jù)。

3 討論

龍樹科植物具有獨(dú)特的形態(tài)特征，莖上長(zhǎng)有大量的刺，葉的形狀也豐富多樣，有線形、梭形、卵形、心形等，少數(shù)種類形態(tài)非常相似，非專業(yè)人員難以辨別，龍樹科植物作為瀕危物種，也需要對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。本研究選用3條常用DNA條形碼片段（rbcL、matK和ycf1b）作為目的序列，對(duì)龍樹科4個(gè)屬的21份植物進(jìn)行親緣關(guān)系分析及分類鑒定。結(jié)果表明，ycf1b可將龍樹科21份植物進(jìn)行明確的系統(tǒng)分類，且各類群的ycf1b序列均具特有突變位點(diǎn)，因此ycf1b可作為龍樹科植物DNA條形碼的有效序列。

rbcL基因序列的變異水平在種間水平以上，在種間及種內(nèi)變異很小[9]，這可能是不能用于龍樹科植物的鑒定的主要原因，但rbcL同樣具有通用性強(qiáng)、易擴(kuò)增等特點(diǎn)，可作為驗(yàn)證物種基因組提取和擴(kuò)增效率的參照序列。matK進(jìn)化速度是rbcL的 2～3倍，遺傳變異大，一般用于植物科、屬水平的鑒定[10]，但在屬內(nèi)近源種只能提供極少的簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)[11]，matK序列引物通用性較差也是限制其應(yīng)用的主要原因。ycf1序列是葉綠體基因組內(nèi)的片段，由于其進(jìn)化速度快，序列變異較大，近年來(lái)已被陸續(xù)應(yīng)用于白芨屬[12]、霸王屬[13]、楊屬[14]、蘭科[11]等植物的分子鑒定中;且對(duì)于陸地植物物種，其在PCR成功率、序列位點(diǎn)變異率及物種鑒別率等方面優(yōu)于rbcL、matK等常用葉綠體DNA條形碼，因此被認(rèn)為是最具潛力的陸地植物DNA條形碼序列[8]。

ycf1b序列能對(duì)龍樹科植物親緣關(guān)系遠(yuǎn)近進(jìn)行準(zhǔn)確的量化分析，這對(duì)龍樹科物種遺傳分類學(xué)具有重要意義，不僅可以補(bǔ)充龍樹科植物的DNA條碼數(shù)據(jù)庫(kù)，還可提高鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性?？梢?，對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確的序列測(cè)定和親緣關(guān)系分析，再結(jié)合序列間的堿基位點(diǎn)差異，是龍樹科物種鑒定的有效方法，也為其他瀕危物種鑒定研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bruyns P，Oliveira-Neto M，Melo-De-Pinna G F，et al. Phylogenetic relationships in the Didiereaceae with special reference to subfamily Portulacarioideae[J]. Taxon，2014，63（5）：1053-1064.

[2]王成聰. 探究龍樹科的奧秘[J]. 園林，2014，21（1）：20-23.

[3]Rauh W. The morphology and systematic position of the Didiereaceae of madagascar[J]. Bothalia，1983，14（3/4）：839-843.

[4]Hebert P D，Cywinska A，Ball S L，et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society B：Biological Sciences，2003，270：313-321.

[5]寧淑萍，顏海飛，郝 剛，等. 植物DNA條形碼研究進(jìn)展[J]. 生物多樣性，2008，16（5）：417-425.

[6]Kress W J，Erickson D L. A two-locus global DNA barcode for land plants：the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region[J]. PLoS One，2007，2（6）：e508.

[7]Cuénoud P，Savolainen V，Chatrou L W，et al. Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL，atpB，and matK DNA sequences[J]. American Journal of Botany，2002，89（1）：132-144.

[8]Dong W P，Xu C，Li C H，et al. ycf1，the most promising plastid DNA barcode of land plants[J]. Scientific Reports，2015，5（1）：1-5.

[9]Chase M W，Soltis D E，Olmstead R G，et al. Phylogenetics of seed plants：an analysis of nucleotide sequences from the plastid gene rbcL[J]. Annals of the Missouri Botanical Garden，1993，80（3）：528-580.

[10]付 濤，王志龍，錢萍仙，等. 高等植物DNA條形碼最新研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，30（5）：887-896.

[11]Neubig K M，Whitten W M，Carlsward B S，et al. Phylogenetic utility of ycf1 in orchids：a plastid gene more variable than matK[J]. Plant Systematics and Evolution，2009，277（1/2）：75-84.

[12]吳勁松，張宇思，劉 薇，等. 白及屬藥用植物DNA條形碼的確立及其應(yīng)用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（10）：1466-1474.

[13]韓 路，王紹明，王建成. 中國(guó)霸王屬植物在世界該屬中的系統(tǒng)發(fā)育地位與形態(tài)性狀進(jìn)化研究[J]. 干旱區(qū)研究，2016，33（6）：1226-1234.

[14]趙奉彬. 中國(guó)楊屬物種DNA條形碼及分子系統(tǒng)學(xué)初步研究[D]. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2016.