• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-591靶向ABCC3對肺癌細胞吉西他濱耐藥性的影響

    2021-09-26 02:21:32林輝雄林海鋒王小泉王聞通瓊海市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科瓊海571400
    中國免疫學雜志 2021年17期
    關(guān)鍵詞:吉西熒光素酶抑制率

    林輝雄 林海鋒 逯 妍 王小泉 王聞通 (瓊海市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,瓊海571400)

    肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見原因[1]。目前,肺癌的標準治療策略包括手術(shù)切除、化學療法和放射療法,化學療法仍是晚期肺癌的常用治療方案之一[2]。吉西他濱作為一線治療藥物已被用于肺癌治療,但耐藥性限制其臨床應用,耐藥性的確切機制尚未闡明,耐藥性相關(guān)基因仍需進一步探索[3]。微小RNA(microRNA,miRNA)是內(nèi)源性非編碼RNA,是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因素[4]。miR-591 在多種生物學和病理學過程中起重要作用,備受關(guān)注。研究表明,miR-591 在乳腺癌組織中表達下調(diào),過表達miR-591 抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲[5]。miR-591在肝癌細胞中呈低表達,可緩解肝癌細胞耐藥性[6]。ABCC3 是ATP-結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運蛋白家族成員,ABC 轉(zhuǎn)運蛋白在腫瘤細胞中高表達,可主動釋放多種抗腫瘤藥物,導致多藥耐藥[7]。ABCC3 在腦膠質(zhì)瘤中表達升高,在非小細胞肺癌耐藥細胞中高表達,干擾ABCC3表達可抑制膀胱癌細胞的集落形成,增強癌細胞對順鉑的敏感性[7-9]。但miR-591在肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞中的表達及其對肺癌細胞吉西他濱耐藥性的影響,以及miR-591 是否通過靶向調(diào)控ABCC3 表達影響肺癌細胞吉西他濱耐藥性尚未明確。因此,本研究建立肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR,并觀察miR-591 對其增殖、凋亡的影響,并結(jié)合ABCC3探索其分子機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料 肺癌細胞株A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心;吉西他濱(99.8%)購自中國食品藥品檢定研究院;RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco 公司;吉西他濱購自美國Sigma-Aldrich公司;CCK-8 檢測試劑盒購自日本Dojindo 公司;雙熒光素酶試劑盒購自美國Promega 公司;Annexin VFITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司;RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;BCA 蛋白測定試劑盒購自美國Pierce 公司;ABCC3、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B 細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)一抗購自美國CST公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng)與耐藥細胞株(A549/GR)構(gòu)建 采用含10%FBS、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549 細胞,37℃、5%CO2的潮濕條件下培養(yǎng)。參考 WEI 等[10]方法構(gòu)建A549/GR 細胞株,將對吉西他濱敏感的A549 親本細胞連續(xù)暴露于濃度逐漸增加的吉西他濱中,初始濃度為10 nmol/L,6個月后增加至10 μmol/L。

    1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染與處理 肺癌A549細胞或吉西他濱耐藥細胞株A549/GR 接種于6 孔板,待細胞生長至70%融合,按照說明書,采用Lipofectamine2000將miR-591、si-ABCC3、pcDNA-ABCC3及相應陰性對照轉(zhuǎn)染至細胞,吉西他濱(0.1 μmol/L)處理48 h。

    1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 細胞以5×103個/孔接種于96 孔板,37℃下采用不同濃度吉西他濱(0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL)處理A549、A549/GR細胞48 h,或收集轉(zhuǎn)染后的A549/GR細胞,10 μ/l孔加入CCK-8 溶液,37℃、5%CO2孵育2 h,酶標儀檢測450 nm處吸光度(OD)值,計算細胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。

    1.2.4 qRT-PCR 檢測 miR-591 和 ABCC3 mRNA 表達 采用 TRIzol 提取 A549 和 A549/GR 細胞總RNA,采用PrimeScripte RT 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄,SYBR?Premix Ex Taq 試劑盒進行 qPCR 反應,以GAPDH 為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算基因相對表達。引物序列:miR-591 F:5'-GAGGTAGACCATGGGTTCTCA-3',R:5'-AGCCAGGGAGTCCACAGTTA-3';U6 F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';ABCC3 F:5'-CCTTTGCCAACTTTCTCTGC-3',R:5'-AGGGCACTCAGCTGTCTCAT-3';GAPDH F:5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3',R:5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'。

    1.2.5 TargetScan 預測和雙熒光素酶報告實驗 TargetScan 網(wǎng)站(http://www. targetscan. org/)預測 miR-591 靶基因,ABCC3 3'UTR 中預測 miR-591的假定結(jié)合位點。分別構(gòu)建野生(WT)和突變(MUT)-ABCC3 質(zhì)粒,采用Lipofectamine2000 試劑共轉(zhuǎn) 染 WT-ABCC3 或 MUT-ABCC3 與 miR-591 模 擬 物或miR 陰性對照(NC),轉(zhuǎn)染后48 h,雙熒光素酶報告分析試劑盒評估熒光素酶活性。

    1.2.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 A549/GR 細胞在 Binding Buffer 緩沖液中稀釋至 1×105個/ml,取100 μl 細胞懸液加入 5 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI工作液,室溫避光孵育15 min,BD FACSCalibur 流式細胞儀分析染色細胞。

    1.2.7 Western blot 檢 測 ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達 采用冷磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次,與含有蛋白酶抑制劑混合物的冷RIPA 緩沖液孵育,冰上裂解30 min,4℃ 離心15 min。采用BCA 蛋白測定試劑盒測定上清中蛋白濃度,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%)分離等量蛋白(20 μg),轉(zhuǎn)至PVDF膜,加入ABCC3、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)4℃ 孵育過夜,加入相應二抗室溫孵育2 h,采用增強的化學發(fā)光檢測劑顯影,ImageJ軟件定量分析。

    1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度吉西他濱對肺癌A549 細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR抑制率的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示,與A549細胞相比,0.01、0.1、1、2、5、10 μmo/lL 吉西他濱顯著降低A549/GR 細胞增殖抑制率;吉西他濱作用的A549/GR 細胞IC50顯著高于A549細胞(P<0.05,表1)。

    表1 不同濃度吉西他濱對肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞抑制率的影響(,n=9)Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells(,n=9)

    表1 不同濃度吉西他濱對肺癌細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞抑制率的影響(,n=9)Tab.1 Effects of different concentrations of gemcitabine on lung cancer cells and lung cancer gemcitabine-resistant cells(,n=9)

    Note:Compared with A549,1)P<0.05.

    Groups Gem concentration(μmol/L)1 2 5 IC50 1.21±0.14 47.58±4.131)33.663 0.000 A549 A549/GR t P 0.01 11.02±1.17 6.34±0.631)10.566 0.000 0.1 28.46±2.84 10.25±0.911)18.391 0.000 41.33±4.15 15.44±1.231)17.944 0.000 52.69±5.18 24.36±1.571)15.702 0.000 66.32±6.22 31.42±1.741)16.210 0.000 10 79.68±6.22 36.14±2.181)16.033 0.000

    2.2 miR-591和ABCC3 在肺癌A549 細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 中的表達 qRT-PCR 和Western blot 檢測結(jié)果顯示,與A549 細胞相比,A549/GR 細胞中miR-591 表達明顯減少,ABCC3 mRNA和ABCC3蛋白表達顯著增加(P<0.05,圖1)。

    圖1 肺癌A549細胞和肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中miR-591、ABCC3表達Fig.1 Expressions of miR-591 and ABCC3 in lung cancer cells A549 and lung cancer gemcitabine-resistant cells A549/GR

    2.3 miR-591靶向調(diào)控ABCC3表達 TargetScan 預測發(fā)現(xiàn),miR-591 與ABCC3 3'UTR 區(qū)堿基可形成互補配對(圖2A)。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,與miR-NC 組相比,miR-591 明顯降低 WT-ABCC3 細胞熒光素酶相對活性(P<0.05),而對MUT-ABCC3 細胞熒光素酶相對活性無顯著影響(圖2B)。Western blot檢測結(jié)果表明,與miR-NC 組相比,轉(zhuǎn)染miR-591明顯降低ABCC3 蛋白表達;與anti-miR-NC 組相比,轉(zhuǎn)染anti-miR-591 顯著提高ABCC3 蛋白表達(P<0.05,圖2C)。

    圖2 miR-591靶向調(diào)控ABCC3表達Fig.2 miR-591 targeting regulates ABCC3 expression

    2.4 miR-591 過表達聯(lián)合吉西他濱(0.1 μmol/L)對A549/GR細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響與 Con 組相比,Gem+miR-NC 組、Gem+miR-591 組A549 細胞和 A549/GR 細胞中 miR-591 表達明顯降低,抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白表達顯著提高,CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯降低;與Gem+miR-NC組相比,Gem+miR-591 組 A549 細胞和 A549/GR 細胞miR-591表達、抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達明顯提高,CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平顯著降低(P<0.05,圖3、表2)。

    表2 miR-591 過表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響(,n=9,%)Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells(,n=9,%)

    表2 miR-591 過表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響(,n=9,%)Tab.2 Effects of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells(,n=9,%)

    Note:Compared with Con,1)P<0.05;compared with Gem+miR-NC,2)P<0.05.

    Groups Con Gem+miRNC Gem+miR-591 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 Apoptosis rate 6.22±0.61 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 Apoptosis rate 7.36±0.74 7.25±0.761)7.15±0.7229.65±2.411)19.32±1.331)33.58±3.351)2)22.69±2.231)2)52.66±5.171)2)31.54±3.111)2)329.000 0.000 F P 714.438 0.000 394.187 0.000 578.333 0.000

    圖3 miR-591 過表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響Fig.3 Effect of miR-591 overexpression combined with gemcitabine on proliferation and apoptosis of A549/GR cells and A549 cells

    2.5 干擾ABCC3 表達聯(lián)合吉西他濱(0.1 μmol/L)對A549/GR細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響與 Con 組 相 比 ,Gem+si-NC 組 、Gem+si-ABCC3 組A549/GR 細胞和A549 細胞抑制率、凋亡率、ABCC3、p21、Bax蛋白水平明顯提高,CyclinD1、Bcl-2蛋白表達顯著降低;與Gem+si-NC 組相比,Gem+si-ABCC3 組 A549/GR 細胞和 A549 細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平明顯提高,ABCC3、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05,圖4、表3)。

    表3 干擾ABCC3 表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響(,n=9,%)Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells(,n=9,%)

    表3 干擾ABCC3 表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響(,n=9,%)Tab.3 Effects of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells(,n=9,%)

    Note:Compared with Con,1)P<0.05;compared with Gem+si-NC,2)P<0.05.

    Groups Con Gem+si-NC Gem+si-ABCC3 A549/GR Inhibition rate 0.00±0.01 9.87±0.991)Apoptosis rate 6.24±0.61 6.58±0.66 A549 Inhibition rate 0.00±0.02 27.14±2.651)Apoptosis rate 7.14±0.71 18.69±1.331)31.25±3.121)2)19.45±1.881)2)48.33±4.271)2)27.31±2.411)2)342.207 0.000 F P 643.036 0.000 352.630 0.000 627.429 0.000

    圖4 干擾ABCC3 表達聯(lián)合吉西他濱對A549/GR 細胞和A549細胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Effect of interfering with ABCC3 expression com?bined with gemcitabine on proliferation and apop?tosis of A549/GR cells and A549 cells

    2.6 ABCC3 過表達逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達對肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 吉西他濱耐藥性的作用 與 Gem+miR-NC 組 相 比 ,Gem+miR-591 組A549/GR 細胞 ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白表達明顯減少,細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax 蛋白水平顯著提高(P<0.05),與Gem+miR-591+pcDNA 組相比,Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 組 A549/GR 細 胞ABCC3、CyclinD1、Bcl-2 蛋白水平明顯升高,細胞抑制率、凋亡率、p21、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05,表4、圖5)。

    表4 ABCC3 過表達逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中的作用(,n=9,%)Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR(,n=9,%)

    表4 ABCC3 過表達逆轉(zhuǎn)miR-591 過表達在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR中的作用(,n=9,%)Tab.4 ABCC3 overexpression reversed miR-591 overex?pression on lung cancer gemcitabine resistant cells A549/GR(,n=9,%)

    Note:Compared with Gem+miR-NC,1)P<0.05;compared with Gem+miR-591+pcDNA,2)P<0.05.

    Apoptosis rate 6.935±0.71 21.36±2.141)23.65±2.33 13.28±1.332)172.497 0.000 Groups Gem+miR-NC Gem+miR-591 Gem+miR-591+pcDNA Gem+miR-591+pcDNA-ABCC3 F P Inhibition rate 10.65±1.13 35.58±3.481)37.19±3.71 19.25±1.282)207.463 0.000

    3 討論

    吉西他濱作為一線化療藥物,廣泛用于多種癌癥治療,包括肺癌治療[11-12]。盡管患者治療開始時對吉西他濱反應良好,但部分患者最終會產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥,導致治療失敗,并最終導致死亡[13]。因此,吉西他濱耐藥性分子機制的進一步研究將促進新型治療方法開發(fā)并改善患者預后。本研究在體外建立肺癌吉西他濱耐藥細胞株A549/GR,發(fā)現(xiàn)不同濃度吉西他濱處理的A549/GR 細胞增殖抑制率明顯低于A549 親本細胞,IC50顯著高于A549 細胞,說明耐藥A549/GR 細胞對吉西他濱敏感性顯著降低。本研究考察 miR-591 和 ABCC3 在 A549/GR 細胞中的表達,及其對細胞耐藥性的影響,有助于克服肺癌吉西他濱耐藥的靶向療法開發(fā)。

    肺癌耐藥發(fā)病機制中,miRNA 失調(diào)起關(guān)鍵作用[14]。已確定多種miRNA 失調(diào)與肺癌化療耐藥性有關(guān),如 miR-324-5p、miR-140-5p、miR-326 等[15-17]。既往研究表明,miR-591 在惡性胸膜間皮瘤組織中明顯下調(diào),是惡性胸膜間皮瘤中一種有效的腫瘤抑制因子[18]。miR-591 與乳腺癌放療抵抗性密切相關(guān)[19]。耐紫杉醇的卵巢癌細胞中,miR-591 顯著下調(diào),恢復miR-591 表達可使耐藥性卵巢癌細胞對紫杉醇重新敏感,并可能通過抑制其靶基因ZEB1 降低癌細胞遷移和增殖,但其在肺癌吉西他濱耐藥細胞中的表達和機制尚未闡明[20]。本研究中,與A549細胞相比,A549/GR細胞中miR-591表達明顯減少,提示miR-591 影響肺癌細胞對吉西他濱的敏感性。功能實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-591 過表達可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖,并誘導細胞凋亡,從而降低肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性,與HUH等[20]報道結(jié)論相符。

    轉(zhuǎn)運蛋白ABC 家族表達增加與化療失敗有關(guān),ABCC3 與多種耐藥性和較差的臨床反應聯(lián)系密切[21]。懸浮狀態(tài)使乳腺癌細胞MDA-MB-231耐藥性增強,也可誘導ABCC3 表達增加,而ABCC3 沉默顯著降低懸浮MDA-MB-231細胞耐藥性[22]。人膀胱癌組織中ABCC3 mRNA 和蛋白水平顯著高于正常組織,過表達ABCC3 可促進細胞增殖、耐藥和需氧糖酵解,并與膀胱癌患者不良預后有關(guān)[23]。敲除乳腺癌化療患者ABCC3,化療藥物在乳腺癌細胞中的保留和細胞凋亡明顯增加,敏感性更高。本實驗A549/GR細胞中ABCC3 mRNA 和ABCC3 蛋白表達顯著增加,與既往報道一致[9]。干擾ABCC3 表達可抑制吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖,并促進其凋亡,增強肺癌細胞對吉西他濱的敏感性,減輕其耐藥程度。進一步研究發(fā)現(xiàn),miR-591 可靶向調(diào)控ABCC3表達。ABCC3過表達逆轉(zhuǎn)miR-591過表達對吉西他濱作用的A549/GR 細胞增殖、凋亡、CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響。說明miR-591 逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性可能通過靶向調(diào)控ABCC3表達實現(xiàn)。

    綜上所述,miR-591 在肺癌吉西他濱耐藥細胞A549/GR 中表達下調(diào),過表達miR-591 可抑制吉西他濱誘導的A549/GR 細胞增殖,并促進其凋亡,減輕肺癌細胞對吉西他濱的耐藥性,機制與靶向調(diào)控ABCC3 表達有關(guān),為吉西他濱治療肺癌的耐藥性提供了新見解。

    猜你喜歡
    吉西熒光素酶抑制率
    中藥單體對黃嘌呤氧化酶的抑制作用
    黑龍江科學(2023年8期)2023-06-04 08:40:58
    血栓彈力圖評估PCI后氯吡格雷不敏感患者抗血小板藥物的療效
    NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗證
    不同雙熒光素酶方法對檢測胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    重組雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細胞螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶表達
    日本莢蒾葉片中乙酰膽堿酯酶抑制物的提取工藝優(yōu)化*
    非小細胞肺癌晚期患者應用吉西他濱治療的護理體會
    重組人血小板生成素預防吉西他濱化療相關(guān)血小板減少癥的臨床觀察
    癌癥進展(2016年10期)2016-03-20 13:15:48
    人多巴胺D2基因啟動子區(qū)—350A/G多態(tài)位點熒光素酶表達載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測
    惡性腫瘤患者應用吉西他濱化療對凝血功能的影響
    22中文网久久字幕| 亚洲美女视频黄频| 国产精品蜜桃在线观看| 永久免费av网站大全| 免费黄色在线免费观看| www.色视频.com| 青春草视频在线免费观看| 最近手机中文字幕大全| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲无线观看免费| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲欧美成人精品一区二区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 综合色丁香网| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品日本国产第一区| 久久久久久伊人网av| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲av综合色区一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜av观看不卡| av有码第一页| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲内射少妇av| 国产成人精品久久久久久| 国产色婷婷99| 水蜜桃什么品种好| 国产视频首页在线观看| 国产精品无大码| 国产精品不卡视频一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 中文天堂在线官网| 亚洲av成人精品一区久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美bdsm另类| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲美女搞黄在线观看| 国精品久久久久久国模美| 美女大奶头黄色视频| 自线自在国产av| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费高清在线观看视频在线观看| 另类亚洲欧美激情| 国产成人aa在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 91精品国产九色| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一级黄片播放器| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜视频国产福利| 欧美xxxx性猛交bbbb| 多毛熟女@视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| kizo精华| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 制服人妻中文乱码| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品无大码| 亚洲第一区二区三区不卡| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | av卡一久久| 精品久久久久久久久av| 亚洲国产av影院在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| www.av在线官网国产| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 激情五月婷婷亚洲| 女人精品久久久久毛片| 最新的欧美精品一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 十八禁网站网址无遮挡| 国产探花极品一区二区| 考比视频在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 99久国产av精品国产电影| 中文字幕av电影在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩伦理黄色片| 伊人久久国产一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产成人av激情在线播放 | 久久久久久久久大av| 久久人妻熟女aⅴ| 国产又色又爽无遮挡免| 国产深夜福利视频在线观看| 一本久久精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 制服诱惑二区| 免费av不卡在线播放| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品久久午夜乱码| xxx大片免费视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美人与善性xxx| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲情色 制服丝袜| 日本色播在线视频| 两个人的视频大全免费| 91精品三级在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 色视频在线一区二区三区| 99热网站在线观看| 亚洲精品视频女| 满18在线观看网站| www.av在线官网国产| 欧美97在线视频| 国产精品一二三区在线看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久久久久久大av| 国产极品天堂在线| 国产成人精品福利久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 插阴视频在线观看视频| 亚洲伊人久久精品综合| 久久久午夜欧美精品| 亚洲,欧美,日韩| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 五月开心婷婷网| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线观看国产h片| 少妇人妻久久综合中文| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男女无遮挡免费网站观看| 麻豆乱淫一区二区| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品夜色国产| 高清欧美精品videossex| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 18禁在线播放成人免费| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黑人高潮一二区| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩伦理黄色片| 日本午夜av视频| 少妇丰满av| 国产精品成人在线| a级毛片在线看网站| 精品熟女少妇av免费看| 色网站视频免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日本欧美视频一区| 中文字幕制服av| 人妻少妇偷人精品九色| 99久国产av精品国产电影| 能在线免费看毛片的网站| 美女福利国产在线| 日日爽夜夜爽网站| 国产综合精华液| 久久青草综合色| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲综合色惰| 日本与韩国留学比较| 国产永久视频网站| 国产av精品麻豆| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲无线观看免费| 一区在线观看完整版| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 性高湖久久久久久久久免费观看| 人妻 亚洲 视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久久久国产电影| 婷婷成人精品国产| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利视频精品| 国产综合精华液| 成人影院久久| 最近最新中文字幕免费大全7| 中文欧美无线码| 国产黄色免费在线视频| 亚洲精品,欧美精品| 中文欧美无线码| 国产精品成人在线| av播播在线观看一区| 一级,二级,三级黄色视频| 一个人看视频在线观看www免费| 免费看不卡的av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 国产成人午夜福利电影在线观看| 少妇的逼水好多| 免费看不卡的av| 性高湖久久久久久久久免费观看| videosex国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久鲁丝午夜福利片| 看免费成人av毛片| 精品酒店卫生间| 在线天堂最新版资源| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看 | 欧美日韩在线观看h| 成人国产麻豆网| 亚洲av男天堂| 少妇的逼好多水| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 天堂8中文在线网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99久国产av精品国产电影| 国产精品99久久99久久久不卡 | 99九九线精品视频在线观看视频| 大片免费播放器 马上看| 热99国产精品久久久久久7| 国内精品宾馆在线| 免费日韩欧美在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产精品免费大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 日本与韩国留学比较| 寂寞人妻少妇视频99o| 涩涩av久久男人的天堂| 国产视频内射| 亚洲五月色婷婷综合| 妹子高潮喷水视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 少妇 在线观看| 国产精品一二三区在线看| 九色亚洲精品在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲国产精品一区三区| 国产精品女同一区二区软件| 九色成人免费人妻av| 国产高清国产精品国产三级| 校园人妻丝袜中文字幕| 嫩草影院入口| 插阴视频在线观看视频| 欧美日韩av久久| 97精品久久久久久久久久精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 在线免费观看不下载黄p国产| 免费日韩欧美在线观看| a级毛片黄视频| 最近的中文字幕免费完整| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美丝袜亚洲另类| a级毛色黄片| 成年av动漫网址| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 两个人免费观看高清视频| 免费观看在线日韩| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 色5月婷婷丁香| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线播放无遮挡| 欧美+日韩+精品| 久久久久久久久久人人人人人人| 男女免费视频国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产av影院在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久久久视频综合| 精品久久久久久久久av| 天堂8中文在线网| 国产免费福利视频在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 99九九在线精品视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品第二区| 我要看黄色一级片免费的| 国模一区二区三区四区视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 久久午夜综合久久蜜桃| 日本欧美国产在线视频| 老司机亚洲免费影院| 国产精品99久久99久久久不卡 | 免费观看在线日韩| 久久久久久伊人网av| 日韩大片免费观看网站| 制服诱惑二区| 中国美白少妇内射xxxbb| 成人综合一区亚洲| 久久久精品区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 免费大片黄手机在线观看| av网站免费在线观看视频| 免费大片18禁| 国产成人aa在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 成人毛片60女人毛片免费| 中国三级夫妇交换| 美女cb高潮喷水在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日韩人妻高清精品专区| 久久综合国产亚洲精品| 三上悠亚av全集在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 十分钟在线观看高清视频www| 能在线免费看毛片的网站| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 不卡视频在线观看欧美| 大话2 男鬼变身卡| 五月伊人婷婷丁香| 视频中文字幕在线观看| 老司机影院成人| 老熟女久久久| 日韩成人伦理影院| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产黄色免费在线视频| 伊人亚洲综合成人网| 国产永久视频网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 少妇人妻久久综合中文| 中文字幕av电影在线播放| 老女人水多毛片| 蜜桃在线观看..| 免费看光身美女| 国产成人精品在线电影| 免费看光身美女| 色94色欧美一区二区| 久久久久久久久久成人| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人手机av| 亚洲av国产av综合av卡| 丰满饥渴人妻一区二区三| 岛国毛片在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件| 高清不卡的av网站| 精品亚洲成国产av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产 一区精品| 色视频在线一区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲精品日本国产第一区| 综合色丁香网| 黑人猛操日本美女一级片| 九色亚洲精品在线播放| 国产色婷婷99| 日韩人妻高清精品专区| av在线播放精品| 亚洲av在线观看美女高潮| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品aⅴ在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 观看av在线不卡| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久精品区二区三区| 黄色配什么色好看| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 新久久久久国产一级毛片| 久久免费观看电影| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲丝袜综合中文字幕| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲国产精品999| 日韩大片免费观看网站| 欧美3d第一页| 日本黄大片高清| 99九九线精品视频在线观看视频| 午夜精品国产一区二区电影| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 久久久国产一区二区| 亚洲国产最新在线播放| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 人妻人人澡人人爽人人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲天堂av无毛| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久婷婷青草| 欧美日韩在线观看h| 一区二区三区四区激情视频| tube8黄色片| 男女边摸边吃奶| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲综合色惰| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人免费观看mmmm| 欧美一级a爱片免费观看看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产日韩欧美在线精品| √禁漫天堂资源中文www| 免费人成在线观看视频色| 国产男人的电影天堂91| 午夜免费观看性视频| 在线观看三级黄色| 考比视频在线观看| 久久影院123| h视频一区二区三区| 九色成人免费人妻av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品三级大全| 免费看不卡的av| 国产高清国产精品国产三级| 国产成人一区二区在线| 久久青草综合色| av有码第一页| 午夜老司机福利剧场| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品国产av成人精品| a级片在线免费高清观看视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产国语对白av| 亚洲国产精品专区欧美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 一本大道久久a久久精品| a级片在线免费高清观看视频| 久久久久久伊人网av| 丰满饥渴人妻一区二区三| 黄色配什么色好看| 搡老乐熟女国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久久久久久久久久久大奶| av电影中文网址| 中国美白少妇内射xxxbb| 少妇人妻久久综合中文| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久久久久免费av| 中国国产av一级| 成人综合一区亚洲| 五月伊人婷婷丁香| 高清欧美精品videossex| 女性生殖器流出的白浆| 中国国产av一级| 欧美精品高潮呻吟av久久| 午夜av观看不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成年人免费黄色播放视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av男天堂| 欧美亚洲日本最大视频资源| 丰满少妇做爰视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| videosex国产| 亚洲国产欧美在线一区| 一级黄片播放器| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 丰满迷人的少妇在线观看| tube8黄色片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产精品一二三区在线看| 制服丝袜香蕉在线| 国产成人a∨麻豆精品| 热99久久久久精品小说推荐| 七月丁香在线播放| 热re99久久精品国产66热6| 91久久精品电影网| 亚洲精品国产av成人精品| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 精品少妇久久久久久888优播| 国产淫语在线视频| 日日撸夜夜添| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲第一av免费看| 亚洲成色77777| 黄片无遮挡物在线观看| 99热网站在线观看| 成人影院久久| 亚洲欧美清纯卡通| 99热全是精品| 在线观看免费视频网站a站| 99re6热这里在线精品视频| 色94色欧美一区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲av.av天堂| 成人影院久久| 自线自在国产av| 午夜av观看不卡| 三级国产精品片| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久精品性色| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人精品婷婷| 另类精品久久| 高清午夜精品一区二区三区| 97在线视频观看| 欧美成人午夜免费资源| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美日韩亚洲高清精品| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 人妻系列 视频| av播播在线观看一区| 国产亚洲一区二区精品| 久久99精品国语久久久| 韩国av在线不卡| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 免费日韩欧美在线观看| 全区人妻精品视频| 人妻人人澡人人爽人人| 最近中文字幕2019免费版| 丰满少妇做爰视频| 全区人妻精品视频| 99久久精品国产国产毛片| 大陆偷拍与自拍| 午夜福利影视在线免费观看| 熟女电影av网| 一本一本综合久久| 国产成人精品无人区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费高清在线观看日韩| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 人妻人人澡人人爽人人| 99国产综合亚洲精品| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产色婷婷99| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产永久视频网站| 51国产日韩欧美| 一级,二级,三级黄色视频| 最近手机中文字幕大全| 欧美最新免费一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品三级大全| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 午夜久久久在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产淫语在线视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 制服丝袜香蕉在线| 婷婷成人精品国产| 国产男人的电影天堂91| 九草在线视频观看| 国产 精品1| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99久久精品一区二区三区| 国产成人免费无遮挡视频| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 在线观看国产h片| 波野结衣二区三区在线| 99热全是精品| 中国三级夫妇交换| 99国产精品免费福利视频| 老司机亚洲免费影院| 美女主播在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 少妇 在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品不卡视频一区二区| 一区二区三区免费毛片| 亚洲av中文av极速乱| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄片播放在线免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品 国内视频| 51国产日韩欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 热re99久久精品国产66热6| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 大香蕉97超碰在线| 中文天堂在线官网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本与韩国留学比较| 如何舔出高潮| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久国产欧美日韩av| 国产视频首页在线观看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲成人一二三区av| 一边亲一边摸免费视频| 久久女婷五月综合色啪小说| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 色吧在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国内精品宾馆在线| 男人操女人黄网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | a级片在线免费高清观看视频| 久久国内精品自在自线图片| 少妇被粗大猛烈的视频| 两个人免费观看高清视频| 人妻人人澡人人爽人人| 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩一区二区视频免费看| 一级毛片我不卡| 91国产中文字幕| 久久婷婷青草| 最后的刺客免费高清国语| 街头女战士在线观看网站|