調節(jié)性B細胞在腦梗死患者外周血中的表達及其與預后的關系①

何謙益 石曉娟 連晶瑤 劉莎莎 張 毅

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州450052）

卒中是繼心臟病和癌癥之后的第三大疾病死亡原因，并且具有最高的致殘率，約有80%的卒中患者遺留有終身殘疾［1-2］。在世界范圍內，卒中造成了患者死亡率及傷殘調整壽命年仍居高不下［3］。因此，找到有效治療卒中的新方法刻不容緩。卒中可以分為缺血性和出血性兩種，其中85%為缺血性的，又稱之為腦梗死。目前，腦梗死的概念已經由單純的血管疾病擴展到了由神經膠質細胞、神經元、血管細胞以及基質成分、免疫細胞等多種成分之間相互作用的復雜疾病。其中免疫系統(tǒng)引起的繼發(fā)性神經炎癥既可以加劇缺血性神經損傷，導致大量神經元死亡，也可以發(fā)揮促進神經修復的積極作用，近年來逐漸成為腦梗死研究領域的熱點［4］。

調節(jié)性 B 細胞（regulatory B cells，Breg）是維持免疫耐受的免疫抑制性細胞，Breg 細胞可以通過分泌 IL-10、IL-35 和 TGF-β 來抑制包括 T 細胞在內的促進炎癥性細胞的擴增進而抑制免疫反應［5］。既往研究表明，Breg 在缺血性卒中動物實驗模型中能發(fā)揮強大的免疫抑制功能并且有潛在的神經保護功能［6］。即使在腦梗死發(fā)生 24 h 后給予 Breg 細胞，也能大大降低實驗小鼠的腦梗死體積，其治療時間窗遠遠超過了目前腦梗死治療領域最有效的組織型纖溶酶原激活劑［7］。但是目前仍缺乏Breg細胞在急性腦梗死患者中的相關研究。本研究旨在檢測急性腦梗死患者外周血中Breg 細胞的表達，并且分析Breg 與患者預后的關系，為后續(xù)Breg 的臨床轉化研究提供一定的數據支持。

1 資料與方法

1.1 資料 納入2018年10月至2019年10月鄭州大學第一附屬醫(yī)院就診的癥狀發(fā)作7 d 內的首發(fā)腦梗死患者128 例（急性腦梗死組）以及同時期性別、年齡相匹配的體檢者100例（健康對照組）。所有納入研究的對象均自愿參加本研究并簽署了知情同意書。所有腦梗死患者均符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標準，并且均經過核磁共振檢查確認。納入的腦梗死患者排除標準為：①患有感染、自身免疫性疾病、癌癥或其他可能影響免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的疾??；②近期應用過類固醇、免疫抑制劑等影響外周血中免疫細胞水平的藥物；③妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。兩組納入對象一般臨床資料的比較：除急性腦梗死組高血壓患病率高于健康對照組（P=0.009）之外，其余在性別、年齡、吸煙比例、糖尿病患病率、血清三酰甘油和膽固醇水平等方面差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 急性腦梗死患者與健康對照的一般情況Tab. 1 Clinical characteristics of acute ischemic stroke patients and healthy controls

1.2 方法

1.2.1 臨床參數的采集以及患者疾病嚴重程度評價 對納入對象的臨床資料如性別、年齡、糖尿病病史、高血壓病史、房顫病史、吸煙史、冠心病病史、飲酒史等進行了采集。并在納入對象入院當天或第二天采集清晨空腹靜脈血，按我院檢驗醫(yī)學科標準，運用全自動生化分析儀檢測低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）水平。用酶聯免疫吸附法（R&D Systems Inc，Minneapolis，MN）檢測 IL-10、TGF-β 與IL-35 的含量。對所有急性腦梗死患者進行了為期90 d 的隨訪。隨訪結束時進行modified Rankin Scale（mRS）評分，mRS 評分 0～2 分為預后好，3～5分為預后差。

1.2.2 流式細胞技術檢測外周血中總B 細胞與Breg 細胞 取每位納入對象空腹清晨靜脈血5 ml用肝素鈉抗凝后采用梯度-密度離心法分離外周單個核細胞（PBMC）。向分離出來的PBMC 中加入an?ti-CD19、anti-CD24 及 anti-CD38 抗體，所有抗體均購自Biolegend公司?？贵w加入后4℃避光孵育30 min，再用 PBS 清洗細胞并用 300 μl 的 FACS Buffer 將細胞重懸，流式細胞儀（BD Biosciences）檢測總B 細胞（CD19+）與Breg細胞（CD19+CD24highCD38high）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0進行數據的統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析或者χ2檢驗比較兩組納入對象的一般臨床資料。用t檢驗分析兩組納入對象 Breg、總 B 細胞、IL-10、TGF-β 及 IL-35 水平的差異。多因素分析采用Logistic回歸分析法，受試者工作特征（ROC）曲線用于確定總Breg、IL-10、TGF-β以及IL-35 水平，預測急性腦梗死患者較好預后的截斷點水平。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組納入對象PBMC 中Breg 細胞 與健康對照組相比，急性腦梗死患者外周血中B 細胞的比例有所上升（22.05%±3.21% vs 18.21%±2.89%，P<0.001），但是 Breg 細胞比例顯著上升（7.56%±1.12%vs 1.48%±0.54%，P<0.001），詳見表2。

表2 急性腦梗死患者與健康對照外周血中的Breg比較Tab.2 Breg in PBMC of patients with acute ischemic stroke and healthy controls

2.2 兩組納入對象血清中 IL-10、TGF-β 與 IL-35 水平 與健康對照組相比，急性腦梗死組患者血清中的IL-10、TGF-β 與IL-35水平顯著上升（表3）。但是Breg 細胞的表達水平僅與血清IL-10 的含量呈正相關（圖1）。

圖1 Breg比例與TGF-β、IL-10以及IL-35水平的相關性Fig.1 Correlation between Breg percentage and TGF-β，IL-10 as well as IL-35 levels

表3 急性腦梗死患者與健康對照血清中IL-10、TGF-β 與IL-35比較Tab.3 Serum IL-10，TGF-β and IL-35 level in acute isch?emic stroke and healthy controls

2.3 急性腦梗死預后影響因素的Logistic分析 以Breg比例、血清IL-10、TGF-β、IL-35水平，年齡、性別（女=0，男=1），吸煙史（無=0，有=1），高血壓病史（無=0，有=1），糖尿病病史（無=0，有=1）等為自變量，以是否為急性腦梗死較好預后為因變量，進行Logistic回歸（表4）。結果顯示僅Breg 比例是預后的獨立影響因素（OR：3.382，95%CI：1.978～5.782）。

表4 急性腦梗死預后影響因素的Logistics分析Tab.4 Logistics analysis of factors affecting prognosis of acute ischemic stroke

2.4 Breg 比例，血清 IL-10、TGF-β 和 IL-35 水平對急性腦梗較好預后的預測價值 Breg 比例預測急性腦梗較好預后的曲線下面積為0.818（0.735～0.900），當總 Breg 比 例為 7.95% 時 ，特 異度 為83.3%，敏感度為74.0%（圖2、表5）。而血清IL-10、TGF-β和IL-35水平不能較好地預測患者預后。

圖2 Breg、TGF-β、IL-10和IL-35預測腦梗死的ROC曲線Fig.2 ROC analysis for Breg，TGF-β，IL-10 and IL-35 levels in acute ischemic stroke

表5 Breg、TGF-β、IL-10及IL-35對急性腦梗死的預測價值Tab.5 Predictive value of Breg，TGF-β，IL-10 and IL-35 in acute ischemic stroke

3 討論

腦梗死發(fā)生24 h 后，由淋巴細胞介導的特異性免疫就開始激活［8］。一般認為，B 淋巴細胞可以產生針對中樞神經系統(tǒng)抗原分子的抗體，在腦梗死發(fā)病后通過體液免疫進一步加重神經元的損傷，甚至可以導致卒中后癡呆［9］。但是，在腦梗急性期B 細胞表現出神經保護作用。動物實驗表明，B 細胞缺乏會導致小鼠梗死面積增加，死亡率增加，表現出更嚴重的卒中后炎癥反應以及更嚴重的神經功能缺失［7］。并且在急性卒中患者中，外周B 細胞數量的減少預示著較差的預后［10］。B 細胞的這種神經保護功能主要與 Breg 這一 B 細胞亞型有關［7，11-12］。在中樞神經系統(tǒng)中，Breg 可以通過分泌IL-10、IL-35 和TGF-β在多發(fā)性硬化、視神經脊髓炎、重癥肌無力等神經系統(tǒng)疾病中起重要的免疫抑制作用［13-14］。而在腦梗死動物模型中，Breg主要通過分泌IL-10來發(fā)揮神經保護作用［6］。Breg 過繼輸入腦梗死小鼠后，通過減少浸潤至缺血腦組織中的激活T細胞與單核細胞數量，減少缺血腦組織周圍炎癥因子如TNF-a 和IL-17的含量；增加調節(jié)性T細胞（Treg）的數量；以及減輕腦梗死后脾臟萎縮，增加脾臟中免疫細胞數量等多種途徑發(fā)揮神經保護作用［6］。

既往動物實驗發(fā)現，相比野生小鼠，免疫缺陷小鼠腦梗死面積更大，神經功能受損更嚴重，過繼Breg 之后免疫缺陷小鼠的腦梗死面積減少并且神經功能有所好轉，但是過繼回輸的Breg 只存在于小鼠外周血中，提示主要由外周Breg 發(fā)揮腦梗后神經保護作用［7］，所以本試驗旨在分析急性腦梗死患者外周血Breg 的比例及其臨床意義。發(fā)現在急性腦梗死患者的外周血中，B 細胞的比例輕度升高，而Breg的比例顯著升高。推測B細胞比例輕度升高的原因是腦梗死發(fā)生后B細胞較晚進入腦梗死灶發(fā)揮特異性免疫功能［4］，而進入腦梗死灶的免疫細胞會因為過度激活而導致凋亡，因此相比較其他免疫細胞，B 細胞的凋亡比例低故而整體比例上調。既往研究表明，炎癥因子如 IL-1β、IL-6、IL-21 等可以促進Breg 的分化［5］，而這些炎癥因子不僅在腦梗死灶并且在外周血中也顯著增加［15］，故而Breg 不僅凋亡比例低，增殖分化程度也增加，所以其比例顯著上調。本研究結果顯示，雖然急性腦梗死患者血清IL-10、TGF-β 和 IL-35 水平較健康對照均上升，但是Breg 水平只與血清IL-10 水平呈正相關，提示Breg可能主要通過分泌IL-10 發(fā)揮作用。為了說明Breg比例與腦梗患者較好預后之間的關系，進行Logistic回歸，結果表明Breg 細胞比例每增加1%，患者獲得較好預后的概率增加 2.5 倍（OR：3.508；95%CI：2.071～5.943），說明Breg 細胞比例越高，患者的預后越好。上述結果與既往動物實驗結果相一致。

除了Breg，其他類型的免疫細胞如調節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）、調節(jié)性樹突細胞、小膠質細胞、巨噬細胞和單核細胞都可以減輕腦梗死后炎癥反應［13］。在這些細胞中，研究最為深入的是Treg 細胞。腦梗死發(fā)生后Treg 細胞可以通過分泌TFG-β 和IL-10；表達跨膜抑制分子 CTLA-4、CD39；消耗促進淋巴細胞增殖的IL-2；分泌細胞溶解分子如顆粒酶和穿孔素等途徑發(fā)揮強大的免疫抑制功能［16］。與 Treg 細胞相比，Breg 有其獨特的優(yōu)勢：①目前關于Treg 在腦梗死中的作用尚無定論，有些研究提示Treg 對腦梗死起保護作用，而有些研究卻得出相反的結論［16］。SEIFERT 等［6］發(fā)現，Treg 細胞在減小MCAO 后梗死體積方面并沒有顯著作用。相反，Breg 細胞亞群可能在減少梗死體積以及神經炎癥方面發(fā)揮關鍵的調節(jié)作用。②Breg 也可以通過增加Treg的數量來發(fā)揮免疫抑制作用。③Treg細胞可以通過LFA-1/ICAM-1 途徑增強腦血管內皮細胞與血小板之間的相互作用，導致體內微血管血栓形成，而Treg 介導的微血管血栓形成與腦梗后期退行性改變相關［17］。而目前的研究尚未發(fā)現Breg 有促進微血管血栓形成的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現在急性腦梗死患者外周血中Breg 細胞的比例明顯較正?；颊咴龈?，且患者血清中Breg分泌的細胞因子如IL-10、TGF-β和IL-35也增高。并且Breg 的增高與患者的較好預后呈正相關。Breg有望成為治療急性腦梗死的新手段。