基于固相凝集法的IgG抗-A/B檢測方法的建立和評價(jià)

張 強(qiáng) 施晶晶 張 敏 （東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院輸血科，南京210009）

ABO 新生兒溶血?。ˋBO hemolytic disease of the newborn，ABO-HDN）是最常見的由于母胎血型不合引發(fā)的胎兒或新生兒同種免疫性溶血性疾病，一般見于含有IgG 抗-A/B 的O 型血孕婦所產(chǎn)的非O型血新生兒［1-2］。IgG 類抗體可穿過胎盤屏障，與含有A 或B 抗原的胎兒紅細(xì)胞特異性結(jié)合，通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解破壞，引發(fā)胎兒或新生兒貧血、高膽紅素血癥等，嚴(yán)重者需要換血［3］。研究證實(shí)，孕婦體內(nèi) IgG 抗-A/B 效價(jià)是 ABO-HDN 發(fā)生的重要因素，臨床上用于檢測孕婦IgG 抗-A/B 抗體效價(jià)的方法主要為試管法和微柱凝膠法［4-5］。由于血清中同時(shí)存在 IgM 和 IgG 2 類血型抗體，2 種方法均需先采用巰基乙醇（2-Mercaptoetha?nol，2-ME）滅活 IgM 類抗體，再檢測 IgG 抗體，檢測時(shí)間長，操作復(fù)雜，且2-ME 毒性較大，嚴(yán)重?fù)p傷環(huán)境和人體。因此，本研究擬建立一種以固相凝集法為基礎(chǔ)的IgG 抗-A/B 效價(jià)檢測方法，滿足檢驗(yàn)要求的同時(shí)顯著提高檢測效率，避免試劑對環(huán)境和工作人員的傷害。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2019 年1 月至7 月我院門診和住院待產(chǎn)的 O 型血孕婦 40 例，年齡 23～45 歲，2019 年江蘇省血液中心健康獻(xiàn)血人員63 例（A、B、AB型各20例，O型3例），微柱凝膠法檢測IgG-抗A/B效價(jià)為1∶64、1∶512、1∶1 024的標(biāo)本各1例。

1.2 儀器與試劑 微柱凝膠檢測系統(tǒng)（37℃恒溫孵育器、微柱凝膠卡及其配套試劑，伯樂）；96 孔U形板（上海晶安）；醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋有限公司）；低離子溶液（伯樂）；巰基乙醇（長春博訊）；抗人球蛋白（抗IgG）檢測試劑盒（上海血液生物有限公司）；Rh-D（IgG）血液定型試劑（單克隆抗體，北京金豪）；磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）、1%O型指示紅細(xì)胞懸液為課題組自制。

1.2 方法

1.2.1 血型抗原和指示紅細(xì)胞制備 血型抗原制備：分別取A、B 血型健康志愿者唾液10 ml，1 000 g離心10 min，取上清，沸水浴煮沸10 min，滅活唾液酶，1 000 g離心10 min，收集上清。凝集抑制試驗(yàn)證實(shí)上清中存在A/B 血型物質(zhì)，確定效價(jià)，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?；指示紅細(xì)胞制備：取3 人份O 型血獻(xiàn)血人員細(xì)胞，鹽水洗滌3 次，稀釋為1%O 型紅細(xì)胞懸液，取 2 ml 紅細(xì)胞懸液，加入 15 μl IgG 抗-D，37℃孵育30 min，制備1%O型指示紅細(xì)胞。

1.2.2 固相凝集法建立 采用磷酸鹽緩沖液將A、B 血型抗原稀釋至最佳濃度，包被96 孔U 形板（200 μ/l 孔），4℃ 過夜；洗滌 3 次，反應(yīng)孔中加入200 μl 倍比稀釋的患者血清（1∶100、1∶200……1∶1 600）和陰性對照血清，密封，37℃ 孵育30 min；洗滌5次，依次加入100 μl抗人IgG抗體及100 μl指示紅細(xì)胞，混勻，200 g離心5 min，觀察結(jié)果，指示紅細(xì)胞平鋪于反應(yīng)孔底部形成細(xì)胞層為陽性，指示紅細(xì)胞聚集于反應(yīng)孔底部中央為陰性，以達(dá)到1+的最高稀釋度作為待測血清的抗體效價(jià)。

1.2.3 特異性檢驗(yàn) 采用包被A 抗原的96 孔U 形板檢測A 及AB 型健康獻(xiàn)血人員（無IgG 抗-A）血清各 20 例，包被 B 抗原的 96 孔 U 形板檢測 B 及 AB 型健康獻(xiàn)血人員（無IgG 抗-B）血清各20 例，同時(shí)加入IgG 抗-A 和 IgG 抗-B 陽 性 的 O 型血孕婦血清 作 為 陽性對照。

1.2.4 批內(nèi)與批間差異檢測 選擇微柱凝膠法檢測的低、中、高（IgG 抗-A 1∶64、1∶256、1∶1 024和IgG抗-B 1∶64、1∶256和1∶1 024）3個(gè)不同抗體效價(jià)水平的標(biāo)本采用建議的方法進(jìn)行檢測，各標(biāo)本連續(xù)檢測20次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；對3個(gè)不同水平的標(biāo)本連續(xù)檢測20 d，1次/d，計(jì)算批間變異系數(shù)（CV）。

1.2.5 固相凝集檢測法臨床應(yīng)用 分別采用固相凝集法和試管法檢測40 例O 型血孕婦IgG 抗-A/B效價(jià)（20 例 IgG 抗-A、20 例 IgG 抗-B），比較 2 種檢驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)中，抗體效價(jià)倒數(shù)經(jīng)log轉(zhuǎn)換，計(jì)算其均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）。2種方法比較試驗(yàn)中，抗體效價(jià)測定值以幾何均數(shù)G（+1 SD，-1 SD）表示，不同方法檢測結(jié)果差異比較采用配對t檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血型抗原最佳包被濃度確定 制備好的血型抗原按1∶100、1∶200……1∶1 600 倍比稀釋，以本研究建立的方法分別檢測低、中、高效價(jià)標(biāo)本，選擇可同時(shí)檢測出3個(gè)水平抗體的抗原最適稀釋度作為包被濃度，確定包被濃度為1∶400。

2.2 特異性 采用包被A 抗原的96 孔U 形板檢測無IgG抗-A的健康獻(xiàn)血人員血清，結(jié)果均為陰性；采用包被B抗原的96孔U 形板檢測無IgG 抗-B的健康獻(xiàn)血人員血清，結(jié)果均為陰性，陽性對照血清均為陽性。說明包被最佳濃度血型抗原的96 孔U 形板可特異性檢測到相應(yīng)抗體的血清，與非特異性抗體不發(fā)生反應(yīng)，本研究建立的固相凝集方法特異性良好。

2.3 重復(fù)性驗(yàn)證 3 個(gè)不同抗體效價(jià)水平的血樣經(jīng)連續(xù)檢測，效價(jià)倒數(shù)經(jīng)log轉(zhuǎn)換，計(jì)算其、s及CV，得到 IgG 抗-A 的批內(nèi)差異為 2.19%～6.90%（<10%），批間差異為4.47%～8.15%（<10%）；IgG 抗-B的批內(nèi)差異為3.03%～6.10%（<10%），批間差異為3.17%～8.80%（<10%）。見表1。

表1 固相凝集法檢測IgG抗-A/ B的批內(nèi)及批間差異Tab.1 Intra-and inter-assay coefficients of variations for IgG-A/ B antibody titer detected by Solid Phase Agglutination

2.4 不同檢測方法比較 分別采用固相凝集法和試管法檢測40 例O 型血孕婦抗體效價(jià)（20 例IgG抗-A、20 例 IgG 抗-B），配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，固相凝集法檢測IgG 抗-A/B 的靈敏度高于試管法，IgG 抗-A/B 測定值分別為試管法的5.86 倍和9.19 倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。Pearson 相關(guān)分析顯示，2 種方法的檢測結(jié)果高度相關(guān)，IgG 抗-A 檢測相關(guān)系數(shù)為0.700，IgG抗-B檢測相關(guān)系數(shù)為0.638，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表3）。

表2 固相凝集法與試管法檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison of Solid Phase Agglutination and Tube Test

表3 固相凝集法與試管法相關(guān)性分析Tab.3 Pearson correlation analysis of Solid Phase Agglu?tination and Tube Test

3 討論

本研究采用唾液血型物質(zhì)作為包被抗原，成功建立了IgG 抗-A/B 檢測的固相凝集檢測方法，并進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)和初步應(yīng)用，本方法特異性高，重復(fù)性好，檢測結(jié)果與經(jīng)典方法高度相關(guān)。

目前臨床常用孕婦抗體效價(jià)檢測方法主要為試管法和微柱凝膠法。試管法是檢測血型抗體效價(jià)的經(jīng)典方法，操作復(fù)雜，未被完全滅活的IgM 抗體和IgA 抗體干擾可引發(fā)鹽水凝集導(dǎo)致假陽性，現(xiàn)已不常用。微柱凝膠法利用分子篩作用，將凝集紅細(xì)胞與游離紅細(xì)胞分開，靈敏度較高，但存在明顯不足，未滅活完全的IgM 抗體、高白細(xì)胞、冷凝集及異常蛋白等均會引發(fā)假陽性［6-8］。近年固相凝集法檢測血小板抗體及血小板交叉配型的試劑盒已成功應(yīng)用于臨床，且具有較高特異性和敏感性［9-10］。本研究采用特異性單抗（抗人IgG）作為二抗及IgG 抗-D致敏的O 型紅細(xì)胞作為指示紅細(xì)胞，檢驗(yàn)過程不受IgM 類血型抗體干擾，無需滅活I(lǐng)gM 類抗體，顯著縮短檢測時(shí)間（相比于試管法和微柱凝膠法可節(jié)省30～60 min），明顯提高檢測效率［11］。同時(shí)該法避免使用2-ME 等有毒試劑，使工作人員免受毒性試劑損傷，且靈敏度高于試管法，其IgG 抗-A/B 的測定值分別為試管法的5.86 倍和9.19 倍。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，2 種方法檢測IgG 抗-A/B 的結(jié)果顯著相關(guān)。另外，本研究以分泌型人唾液中的血型物質(zhì)作為包被抗原，其僅與含有相應(yīng)IgG 抗體的血清反應(yīng)，不與陰性對照血清發(fā)生交叉反應(yīng)，保證該方法特異性良好。重復(fù)性試驗(yàn)顯示，該方法檢測IgG 抗-A/B 的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均<10%，具有較好的重復(fù)性和精密度。

綜上所述，本研究建立方法特異性和靈敏度較高，重復(fù)性好，無毒性試劑污染，且操作簡便省時(shí)，為檢測孕婦血清IgG抗-A/B抗體效價(jià)提供了可靠手段。