益腎健脾方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)研究?

呂文學(xué)， 蔡余力

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科， 濟(jì)南 250014)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是以全身骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞、易并發(fā)骨折為主要臨床特征的女性常見骨代謝疾病之一[1]。近年來研究表明[2，3]，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨組織細(xì)胞生命活動(dòng)周期密切相關(guān)。同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其相關(guān)蛋白的表達(dá)異常與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。中醫(yī)理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松是由于腎精虧虛導(dǎo)致骨髓生化乏源、骨骼失養(yǎng)所致[4]。益腎健脾方是由補(bǔ)骨脂等中藥組成的用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中藥方劑，目前已在臨床中用于骨質(zhì)疏松的治療且療效明顯。然而益腎健脾方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制尚不甚明確。本文通過研究益腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥及腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，旨在從分子生物學(xué)角度闡述益腎健脾方對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。本研究已通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,批準(zhǔn)號(hào)2020-12號(hào)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)(SPF)雌性SD大鼠，6月齡，體質(zhì)量(240±20)g，購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(魯) 2019 0007。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為溫度24 ℃，濕度45%，正常光照，自由飲食，動(dòng)物飼料為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠維持飼料，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房。

1.2 藥品與試劑

益腎健脾方組成：熟地黃20 g，淫羊霍12 g，黨參15 g，川牛膝18 g，云苓15 g，白術(shù)15 g，山藥18 g，牡蠣30 g，杜仲12 g，補(bǔ)骨脂12 g，骨碎補(bǔ)21 g，龍骨30 g，丹皮12 g，甘草6 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制劑中心統(tǒng)一制備；Wnt3a(貨號(hào)AF8352)、β-catenin(貨號(hào)AF0066)、GAPDH抗體(貨號(hào)AF1186)、RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)P0013E)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號(hào)A0208)，購(gòu)自上海碧云天公司；ALP(貨號(hào)201808151)、OPG檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)201810052)，購(gòu)自南京建成生物工程公司；TrACP(貨號(hào)HY-10289)、BMP-7檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)HY-10149)，購(gòu)自北京華英生物技術(shù)研究所；RNA提取試劑盒(貨號(hào)Z3100)，美國(guó)Promega公司；ECL顯色液(貨號(hào)32209)，賽默飛世爾科技有限公司；改良番紅O-固綠軟骨染色液(貨號(hào)G1371)，北京索萊寶公司；PCR引物，購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 儀器

MB-530酶標(biāo)儀(濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司)；STM7-BSW顯微鏡(奧林巴斯銷售服務(wù)有限公司)；DYCZ-25 D雙垂直電泳儀及DYCZ-40 G轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器有限公司)；Gel Doc XR凝膠成像儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；FC5718230V離心機(jī)(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.4 去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的建立及給藥

除15只大鼠作為對(duì)照組外，其余45只大鼠參照文獻(xiàn)方法[5]建立骨質(zhì)疏松大鼠模型。根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按照40 mg/kg腹腔注射給予戊巴比妥鈉溶液麻醉，取俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剃毛器在背部?jī)蓚?cè)剃毛備皮，碘伏消毒，由脊柱旁1～2 cm、肋下1 cm處打開腹腔，找到埋于白色脂肪中的卵巢拉出并結(jié)扎，行卵巢切除術(shù)后還回腹腔并縫合肌肉和皮膚，同法摘除另一側(cè)卵巢。對(duì)照組大鼠不去除卵巢，僅去除卵巢周圍少量脂肪組織。術(shù)后3個(gè)月測(cè)定大鼠骨密度，以造模組大鼠股骨骨密度顯著低于對(duì)照組視為造模成功。造模完成后的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、益腎健脾方組、阿侖膦酸鈉組各15只。益腎健脾方組大鼠根據(jù)體質(zhì)量按照0.875 ml/100 g灌胃給予益腎健脾方(按照成人臨床使用劑量的6.3倍折算)，阿侖膦酸鈉組灌胃給予1 mg/kg的阿侖膦酸鈉，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水，每日1次，連續(xù)12周。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平檢測(cè) 大鼠眼眶后靜脈叢取血后靜置，離心取上清液，并按照檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平。

1.5.2 大鼠股骨骨密度測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[6]使用DPX-ALPHA LUNARTM1，通過雙能X射線吸收測(cè)定法(DEXA)，在Hi-res、small animal模式下檢測(cè)大鼠左側(cè)股骨骨密度。

1.5.3 大鼠股骨生物力學(xué)測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法[7]，大鼠處死后取右側(cè)股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，加載速度為2 mm/min，測(cè)定最大載荷和彈性載荷。

1.5.4 各組大鼠股骨組織病理學(xué)檢查 大鼠處死后，分離左側(cè)股骨并放入4%中性甲醛中固定48 h，脫鈣液脫鈣處理，每周更換1次脫鈣液，共脫鈣5周并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，于正中矢狀面進(jìn)行4 μm連續(xù)切片。然后分別進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色及番紅-固綠染色法染色，在顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.5.5 大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平測(cè)定 大鼠斷頭處死后迅速分離腎組織，使用試劑盒提取腎組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)腎組織Wnt3a、β-catenin及GAPDH mRNA水平。表1示，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算各檢測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.5.6 Western blot檢測(cè)大鼠腎組織中Wnt3a、β-catenin蛋白水平 取大鼠部分腎組織，玻璃勻漿器中加入RIPA蛋白裂解液勻漿，離心4 ℃，12000 r/min,10 min后取上清液，測(cè)定蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉液封閉1 h，經(jīng)Wnt3a、β-catenin及GAPDH抗體(均以1∶1000比例稀釋)孵育后，4 ℃過夜，次日PBST充分洗膜后，加入1∶2000稀釋后的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，25 ℃恒溫孵育1 h，再次使用PBST清洗3次，顯色液顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)成像后，使用軟件ImageJ 1.8.0進(jìn)行灰度值檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠股骨骨密度

表2示，與對(duì)照組比較，模型組股骨密度降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨骨密度均顯著升高(P<0.05)。

表2 各組大鼠股骨骨密度比較

2.2 各組大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平

表3示，與對(duì)照組比較，模型組血清TrACP、ALP水平升高(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠血清TrACP、ALP水平顯著降低(P<0.05)，血清BMP-7、OPG水平均顯著升高(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平比較

2.3 各組大鼠股骨骨生物力學(xué)比較

表4示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨最大載荷及彈性載荷均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠最大載荷及彈性載荷均顯著升高(P<0.05)。

表4 各組大鼠股骨骨生物力學(xué)比較

2.4 大鼠股骨病理學(xué)檢查

圖1、2示，對(duì)照組大鼠股骨結(jié)構(gòu)完整，骨小梁清晰，未見明顯病理學(xué)變化；與對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨結(jié)構(gòu)明顯損壞，骨小梁被破壞且稀疏，厚度變薄，股骨頭部位脂滴明顯增多，相互鏈接斷裂且骨髓腔變大出現(xiàn)不同程度破裂形狀大小不均勻；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨病理學(xué)變化明顯改善，骨小梁增粗且排列較整齊，骨組織結(jié)構(gòu)明顯恢復(fù)，脂滴明顯減少，可見明顯新骨形成。

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.益腎健脾方組；D.阿侖膦酸鈉組

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.益腎健脾方組；D.阿侖膦酸鈉組

2.5 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平

表5示，與對(duì)照組比較，模型組腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平降低 (P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平均明顯升高(P<0.05)。

表5 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平比較

2.6 各組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平比較

圖3示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin水平顯著升高(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的臨床常見疾病，由骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨脆性增加使得患者的骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是女性骨質(zhì)疏松癥的常見病因之一。女性在絕經(jīng)后，由于雌激素水平降低，導(dǎo)致內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂而引起骨代謝平衡被打破，骨重建速度下降，同時(shí)骨脆性增加[8]。目前，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥臨床常用雌激素、降鈣素﹑二膦酸鹽﹑鈣劑及維生素等藥物治療，然而這些藥物存在臨床效果不理想、不良反應(yīng)多，甚至可能增加患者罹患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤疾病的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，骨質(zhì)疏松實(shí)為腎虛所致。腎為先天之本，藏精主骨生髓，可解釋為腎精充足時(shí)則骨髓能夠受到滋養(yǎng)而強(qiáng)健有力，若腎精虧虛則骨骼得不到滋養(yǎng)。由此可見，骨髓的生長(zhǎng)發(fā)育、強(qiáng)勁衰弱與腎精盛衰密切相關(guān)。早在多部中醫(yī)學(xué)古典著作中已有大量關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的記載[10-14]，如《素問·痿論篇》[15，16]記載：“內(nèi)伐則熱舍于腎，腎者水臟也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿。”隨著年齡的增長(zhǎng)，老年女性精血不能互相轉(zhuǎn)化，故腎虧脾虛是原發(fā)性骨質(zhì)疏松的基本病理。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育等生理活動(dòng)重要的信號(hào)通路之一。近年來研究表明[17]，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與骨質(zhì)疏松、腫瘤、神經(jīng)損傷等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。有研究證實(shí)[18]，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常會(huì)導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化和增殖能力降低，促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生；姚琦等[19]研究表明，獨(dú)活可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)去卵巢導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用；劉湘琳等[20]研究表明，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠增加去勢(shì)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥大鼠的股骨骨密度,提高椎體最大負(fù)荷和彈性模量等生物力學(xué)性能。

益腎健脾方是由骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂等中藥組成的中藥成方制劑，在前期絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的臨床應(yīng)用中已取得顯著療效。方中補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)為君藥可補(bǔ)腎壯陽、健脾補(bǔ)胃；臣以淫羊藿、熟地、山藥、煅龍骨、川牛膝、牡蠣、杜仲補(bǔ)腎滋陰益精，補(bǔ)益肝腎；配以云苓、黨參、白術(shù)、丹皮歸脾腎經(jīng)，健脾益氣，利水消腫，加強(qiáng)活血化瘀之力共為佐藥；甘草性平，調(diào)和諸藥，諸藥配伍共奏補(bǔ)腎壯骨、活血通絡(luò)之功。

本實(shí)驗(yàn)通過采用雙側(cè)卵巢摘除法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，研究益腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用及對(duì)腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。骨密度及最大載荷、彈性載荷等骨生物力學(xué)指標(biāo)是反映骨硬度及脆度的直接指標(biāo)，骨密度及骨生物力學(xué)指標(biāo)的下降提示骨折風(fēng)險(xiǎn)的升高；血清TrACP、ALP、BMP-7、OPG水平是反映骨代謝的指標(biāo)，TrACP是骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物，ALP是成骨細(xì)胞功能及分化的評(píng)價(jià)指標(biāo)，BMP-7是骨形成最早的信號(hào)分子，由骨骼及腎臟產(chǎn)生，能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨及軟骨細(xì)胞，OPG水平升高是骨形成增加而骨吸收減少的重要標(biāo)志[21，22]。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，益腎健脾方組及阿侖膦酸鈉組大鼠股骨骨密度、最大載荷、彈性載荷、血清BMP-7、OPG水平顯著升高，血清TrACP、ALP水平顯著降低，大鼠股骨組織病理學(xué)明顯改善。同時(shí)，益腎健脾方組大鼠腎組織Wnt3a、β-catenin mRNA水平、Wnt3a、β-catenin蛋白水平較模型組顯著升高，提示益腎健脾方對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的保護(hù)作用，可能是通過調(diào)節(jié)腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而發(fā)揮其骨保護(hù)及修復(fù)作用。

綜上所述，益腎健脾方能夠提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，升高血清BMP-7、OPG水平，降低TrACP、ALP水平，改善大鼠股骨組織病理學(xué)變化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。