補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境下骨髓間充質(zhì)干細胞生存率及凋亡率的影響?

王詩琦， 惠小珊， 張金生， 袁書章， 薛 珂

(1.河南中醫(yī)藥大學， 鄭州 450046；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院， 北京 100053；3.河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院， 鄭州 450008)

BMSCs是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，在臨床腦梗死、急性心肌梗死等心腦血管疾病臨床移植治療中取得了一定的療效。但梗死區(qū)微環(huán)境缺血缺氧對BMSCs的存活、分化等造成了不利的影響[1]。課題組針對微環(huán)境與干細胞的研究已經(jīng)取得一定進展，進一步探索缺血缺氧微環(huán)境對BMSCs的影響，通過中藥干預缺血缺氧微環(huán)境，提高BMSCs的生存率、分化率，可能對缺血缺氧性心腦血管疾病的治療有一定的價值和意義。本研究以BMSCs為研究對象，建立缺血缺氧微環(huán)境細胞模型，動態(tài)觀察不同時間點缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs的狀態(tài)，探究BMSCs在惡劣微環(huán)境下的漸變過程，再給予補腎化瘀生新方含藥血清干預，對比缺血缺氧微環(huán)境下中藥干預后BMSCs發(fā)生的變化，為中藥復方調(diào)控缺血缺氧微環(huán)境，提高干細胞生存率，降低ROS損害和凋亡率提供實驗依據(jù)。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學倫理文員會批準，倫理編號DWLL2018030051。

1 材料

1.1 動物

SPF級SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量(180±10)g，實驗動物合格證號SCXK(豫)2015-0005，由鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。在河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室內(nèi)氨濃度<20ppm，通風清潔，明暗周期各12 h，自由攝食和飲水，定期更換墊料。

1.2 藥品

補腎化瘀生新方組成：熟地黃12 g，當歸12 g，巴戟天10 g，石斛10 g，川芎 15 g，肉桂3 g，甘草3 g，上述藥物購于深圳市三九中醫(yī)藥健康產(chǎn)品有限公司。

1.3 主要試劑與儀器

High Glucose DMEM (廣州賽業(yè)公司，批號RASMX-90011)；1XPBS(北京索萊寶公司，批號P1020)；Cell Counting Kit-8(日本同仁公司，批號JAPAN(CCK-8));Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit(康為世紀，批號CW2574 S);活性氧(ROS)化學熒光法測試盒(Elabscience公司，批號E-BC-K138-F)；H35低氧工作站(英國Don Whitley 公司)；LHS-300SC 型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海精密儀器儀表有限公司);U-RFLT50型熒光裝置，CKX41 型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);BD FACSAria TM Ⅲ型流式細胞分選儀(美國BD公司)。

1.4 含藥血清制備

SPF級SD雄性大鼠20只，結(jié)合前期課題組研究基礎[2]，給藥劑量按照成人每日給藥量的18倍計算，即為12.29 g/mL/100 g。連續(xù)7 d灌胃給藥，早晚各1次，于第8天末次給藥90 min后麻醉，腹主動脈采血至離心管，室溫靜置30 min，4 ℃離心機3500 r/min離心15 min，取血清于56 ℃恒溫水浴鍋滅活30 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 BMSCs 的提取、培養(yǎng)及分離純化

SPF級SD雄性大鼠10只，采用全骨髓貼壁法脫頸處死。于體積分數(shù)為75%乙醇中浸泡5 min，無菌條件剝離兩側(cè)股骨及脛骨，在4 ℃的DMEM/F12培養(yǎng)液中除去骨周圍肌肉組織，剪去兩側(cè)骺端暴露髓腔，5 mL注射器適量吸取DMEM/F12培養(yǎng)液(含有10%FBS)緩慢反復沖洗骨髓腔，至髓腔變白反復吹打細胞懸液，使細胞均勻懸浮，15 ml注射器抽取適量完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，200目滅菌鋼篩過濾骨髓液至離心管，1280 r/min離心5 min，取3 ml細胞懸液接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后首次半量換液，后每72 h換液1次，細胞接近90%融合時取足夠數(shù)量單細胞懸液，1280 r/min離心5 min。加入FITC標記工作濃度為1∶50的抗CD105+抗體，輕緩振搖后，于37 ℃、5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min。流式分選制成細胞懸液，以1×1010接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37 ℃常溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液除去懸浮細胞，加入含10%FBS完全培養(yǎng)基，每48 h更換培養(yǎng)基。細胞傳代培養(yǎng)至P3～P5用于實驗。

2.2 缺血缺氧細胞模型制備

結(jié)合前期研究[2]及參考文獻[8-12]，采用DMEM培養(yǎng)基及94% N2、1% O2、5%CO2、37 ℃ H35低氧工作站培養(yǎng)細胞。時間設立為6 h、12 h、24 h、36 h、40 h、44 h、48 h、60 h 8個時間點，建立缺血缺氧細胞模型。

2.3 BMSCs分組與培養(yǎng)

BMSCs分為正常培養(yǎng)組(Control Group)、缺氧組(Hypoxia Group)、缺血缺氧組(hypoxia ischemia group, HI Group)、補腎化瘀生新方組(BSHYSX Group, BSHY Group)。正常組使用完全培養(yǎng)基(含10%FBS)，于37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；缺氧組使用完全培養(yǎng)基，缺血缺氧組使用DMEM培養(yǎng)基，補腎化瘀生新方組(BSHYSX Group, BSHY Group)使用補腎化瘀生新方含藥血清，于H35低氧工作站中培養(yǎng)細胞。

2.4 各時間點BMSCs生存率和凋亡率檢測

2.4.1 CCK-8法細胞生存率檢測 接種P3代BMSCs細胞1×105個/孔于96孔板中，分為正常培養(yǎng)組、缺氧組、缺血缺氧組，分別在缺血缺氧條件及正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、36 h、40 h、44 h、48 h、60 h后，每孔加入10 μlCCK-8溶液，于37 ℃常溫培養(yǎng)箱孵育2 h，酶聯(lián)免疫檢測儀480 nm處測吸光度(A)值，同時設置空白對照孔。細胞生存率(%)=(A實驗組-A空白對照)/(A對照組-A空白對照)×100%，實驗重復3次。

2.4.2 Annexin V-FITC/PI凋亡檢測 接種P3代BMSCs細胞2×105個/孔于6孔板中，分組及培養(yǎng)條件同上。在各時間點取出細胞，PBS洗滌后0.125%胰酶(不含EDTA)消化1 min，終止消化 1000 r/min 離心5 min收集細胞。加入Annexin V-FITC和PI溶液，輕柔混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl PBS輕輕混勻，流式細胞儀迅速檢測，實驗重復3次。

2.5 ROS活性氧檢測

2.5.1 ROS流式檢測 接種P3代BMSCs細胞2×105個/孔于6孔板中，分組及培養(yǎng)條件同上。在各時間點取出細胞，PBS洗滌后0.125%胰酶(不含EDTA)消化1 min，終止消化 1000 r/min 離心5 min，收集細胞、調(diào)整細胞濃度1×105個/mL，加入0.5 mlPBS重懸細胞后，加入1 ml DCFH-DA熒光探針，置37 ℃常溫培養(yǎng)箱孵育40 min后緩沖液洗滌3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的熒光探針。加入400 μl緩沖液重懸，于流式細胞儀迅速檢測，每個實驗重復3次。

2.5.2 ROS熒光檢測 接種P3代BMSCs以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，與CCK-8相同的分組方法，在各時間點取出細胞，按照說明書操作，加入1 ml DCFH-DA熒光探針，放入正常培養(yǎng)箱孵育40 min后取出，緩沖液輕柔沖洗，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，加入400 μl緩沖液，在共聚焦熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，每個實驗重復3次。

BMSCs細胞正常培養(yǎng)，待細胞分化良好且貼壁80%～85%時，更換5 ml高糖DMEM培養(yǎng)基，于1%O2、94%N2、5%CO2的低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

2.6 補腎化瘀生新方對缺血缺氧模型生存率、凋亡率及ROS的影響

在確立的缺血缺氧模型建立最佳時間點基礎上，以補腎化瘀生新方含藥血清干預細胞，CCK-8法測定細胞生存率，流式細胞儀檢測凋亡率和平均熒光強度，倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)ROS的表達，實驗步驟同前。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 各時間點BMSCs生存率和凋亡率檢測

3.1.1 BMSCs生存率變化 表1圖1示，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，各時間點缺血缺氧組與正常組、缺氧組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。40 h缺血缺氧組細胞生存率最低(24.86%)，后續(xù)細胞開始大量死亡。

表1 各組BMSCs生存率變化比較

圖1 各時間點BMSCs生存率比較

3.1.2 BMSCs凋亡率變化 表2圖2示，缺血缺氧組各時間點與正常組、缺氧組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。40 h缺血缺氧組BMSCs凋亡率最高(92.77%)，后續(xù)細胞逐漸出現(xiàn)大量死亡。

圖2 各組BMSCs凋亡變化比較

表2 各組BMSCs凋亡變化比較

3.2 各時間點BMSCs熒光強度檢測

表3圖3示，各時間點缺血缺氧組與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；各時間點缺血缺氧組與缺氧組比較(60 h除外)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察，40 h細胞內(nèi)ROS熒光強度較高、細胞量較前增多明顯。提示缺氧微環(huán)境與缺血缺氧微環(huán)境下，明顯提升了細胞內(nèi)的活性氧積累。對多種不同的細胞進行分析可以得出結(jié)論，活性氧可能誘導細胞凋亡[3，4]。

圖3 各組BMSCSs活性氧水平變化比較

表3 各組BMSCs活性氧平均熒光強度變化比較

3.3 BMSCs缺血缺氧模型建立

根據(jù)本實驗細胞生存率、凋亡率、ROS含量等平行實驗結(jié)果互相驗證，結(jié)合課題組前期研究基礎及缺血缺氧細胞模型建立的相關參考文獻[8-12]，認為40 h為BMSCSs缺血缺氧模型建立的成功最佳時間點。

3.4 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs生存率和凋亡率的影響

3.4.1 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs生存率影響 表4、圖a示，補腎化瘀含藥血清干預后，明顯提升了BMSCs在缺血缺氧微環(huán)境下的生存率，各時間點差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境中BMSCs生存率影響比較

3.4.2 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs凋亡率影響

表5圖b示，各時間點提示，補腎化瘀組凋亡率較缺血缺氧組明顯下降，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表5 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境中BMSCs凋亡率影響比較

3.5 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs活性氧的影響

表6圖c示，與缺血缺氧組比較，補腎化瘀組干預效果明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察，補腎化瘀生新方干預后細胞熒光強度明顯減弱。

表6 補腎化瘀生新方對缺血缺氧微環(huán)境中BMSCs活性氧的影響

4 討論

微環(huán)境是干細胞分化領域的重要學說之一，在局部微環(huán)境的調(diào)控下，干細胞通過旁分泌、自分泌、內(nèi)分泌等方式，干預或增強某些介導分化的關鍵基因表達，使干細胞保持持續(xù)更新的潛能。但大量研究表明，梗死區(qū)微環(huán)境缺血缺氧，短時間內(nèi)釋放大量氧自由基，形成局部氧化應激反應，破壞線粒體膜完整性，無法正常供應細胞活動所需ATP，最終造成細胞凋亡或死亡；壞死細胞聚集產(chǎn)生局部炎癥反應、壞死局部為保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定產(chǎn)生免疫應答等特異性免疫效應等，亦不利于移植后干細胞的存活和分化，無法達到預期目標[5-7]。因此，改善局部缺血缺氧微環(huán)境，提高干細胞存活率是未來干細胞研究的新方向。

缺血缺氧條件下的體內(nèi)外實驗研究多各自設立單一時間點或時間段，未能形成模型建立的統(tǒng)一標準。YONG-SEOK HAN等[8，9]研究單個時間點，通過JAK2/STAT3通道調(diào)節(jié)hMSCs增殖情況，在低氧預處理12 h后對其進行檢測；之后這些研究者又設立多個時間點，通過c-met激活BMSCs與細胞朊蛋白PrPC相結(jié)合作用挽救缺血性損傷，實驗設置在低氧下培養(yǎng)0 h、6h、12 h、24 h和48 h這5個時間點進行檢測；張妮等[10]模擬炎癥誘導缺血缺氧微環(huán)境BMSCs模型，時間點設置為6 h、12 h、24 h；一些研究從動物實驗著手，時間設置以天或周為單位[11，12]。本實驗基于缺血缺氧實驗條件，設置6 h、12 h、24 h、36 h、40 h、44 h、48 h、60 h 8個時間節(jié)點，采用3種檢測方法平行驗證以觀察BMSCs在缺血缺氧微環(huán)境下的動態(tài)漸變過程。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 h、12 h時缺氧組、缺血缺氧組細胞活力與對照組相比不減反升，可能與BMSCs處于短暫、非致死性的低氧條件下可激活細胞自噬，形成內(nèi)源性的保護蛋白、激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (extracellular signal regulated kinase,Erk)等有關，從而提高細胞的再生能力，減少細胞凋亡[13，14]。24 h開始，缺氧組、缺血缺氧組細胞活力與對照組比較明顯降低。細胞凋亡的測定，36 h開始缺氧組與缺血缺氧組細胞凋亡率明顯升高，但36 h與48 h缺血缺氧組2個時間點無顯著差異，這可能與BMSCs逐漸適應該缺血缺氧環(huán)境有關，遂加入40 h和44 h 2個時間點以作動態(tài)觀察。與正常組各時間點比較，缺血缺氧組40 h時細胞活力最低，凋亡率最高，ROS形成的細胞損傷最明顯。結(jié)合各項結(jié)果，課題組前期研究及相關細胞模型建立標準，認為40 h時BMSCs缺血缺氧模型建立成功。

圖4 CCK-8檢測中藥干預后BMSCs生存率變化比較

圖5 Annexin V-FITC/PI流式檢測中藥干預后骨髓間充質(zhì)干細胞凋亡水平變化比較

圖6 ROS檢測中藥干預后骨髓間充質(zhì)干細胞活性氧水平變化比較

補腎化瘀生新方以熟地黃、巴戟天共為君藥，起到滋腎陰、壯腎陽的功效；川芎活血行氣，當歸補血化瘀共為臣藥；肉桂、石斛共為佐藥，起到溫腎陽、滋陰斂陽之功；甘草調(diào)和諸藥，全方不僅可以調(diào)控機體整體的大環(huán)境，還可保證腎精充足，脈道通利[15]。課題組前期采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)研究補腎化瘀生新方含藥血清體內(nèi)吸收入血成分，共分析鑒定其藥物活性成分為主要吸收入血成分。本實驗研究得出，補腎化瘀生新方含藥血清干預缺血缺氧微環(huán)境下BMSCs的表達，可提升BMSCs在缺血缺氧微環(huán)境下的生存率。與缺血缺氧組對比，40 h時補腎化瘀生新組BMSCs凋亡率水平明顯降低。這一結(jié)果可能與補腎促進“腎精”的生長發(fā)育，激活損傷組織中干細胞損傷修復能力有關[16]。與缺血缺氧組比較，補腎化瘀生新組明顯降低細胞內(nèi)氧化應激水平(圖c)；48 h顯示(圖c)，中藥干預組熒光強度降低，細胞成大面積、小聚落分布，提示細胞內(nèi)ROS水平降低，可能有利于細胞的增殖[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，補腎化瘀生新方可提高BMSCs在缺血缺氧環(huán)境中生存率，降低凋亡率，對抗ROS對細胞的損傷，推測通過改良缺血缺氧微環(huán)境可作為提高BMSCs移植后存活率的又一新途徑，這一作用的具體機制仍有待進一步研究。