利拉魯肽基于 NF-κB/NLRP3通路介導(dǎo)的焦亡途徑對小鼠動脈粥樣硬化的干預(yù)作用研究

陳金暉 陳青青 梅統(tǒng) 王偉林 張嵐 盧永明

動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）是心血管疾病的病理基礎(chǔ)，是心血管疾病相關(guān)死亡的重要原因[1]。AS特征是彈性動脈內(nèi)膜中纖維組織和脂質(zhì)的沉積，導(dǎo)致血栓形成和以血管壁增厚和硬化為特征的結(jié)構(gòu)破壞[2]。研究發(fā)現(xiàn)，動脈內(nèi)皮細胞焦亡與AS的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。細胞焦亡是近年研究發(fā)現(xiàn)的一種程序性細胞死亡新形式——細胞炎性死亡，作為固有死亡的一種形式，可參與AS的形成、發(fā)展并影響斑塊的穩(wěn)定性[4]。因此，防治AS的發(fā)生與發(fā)展，探究內(nèi)皮細胞焦亡的發(fā)生機制或可作為重要突破口。NF-κB信號通路異常是導(dǎo)致AS形成的一個重要影響因素，它涉及AS形成過程中的多種病理過程[5]。NOD樣受體蛋白3（nod-like receptor protein 3,NLRP3）炎癥小體為先天的免疫信號復(fù)合物，其激活可通過不同的信號通路促進AS[6]。胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1,GLP-1）作為一種內(nèi)源性促胰島素激素，具有良好的降糖活性。Patel等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1激動劑長期治療可改善飲食引起的血脂異常和AS。目前，關(guān)于GLP-1通過NF-κB/NLRP3通路對AS的作用機制研究少見?；诖?，本研究采用GLP-1類似物利拉魯肽干預(yù)載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠AS模型，通過基于NF-κB/NLRP3通路介導(dǎo)的焦亡途徑分析利拉魯肽干預(yù)對AS小鼠的保護作用，為AS的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡SPF級雄性ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J）及C57BL/6J正常小鼠，體質(zhì)量18～20 g，均購自杭州子源實驗動物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0004，動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0024，動物質(zhì)量合格證號：SL304725。所有動物飼養(yǎng)在12 h光/暗周期中，自由進食、進水，溫度為（20±2）℃，濕度為（50±5）%。

1.1.2 主要試劑和儀器 普通飼料（批號：D12325）和高脂飼料（批號：D12492）均購自上海睿安生物科技有限公司；利拉魯肽注射液（批號：20200509）購自諾和諾德（中國）制藥有限公司；GLP-1受體抑制劑exendin（9-39）（批號：HY-P0293）購自美國 APExBIO 公司；IL-6 ELISA 試劑盒（批號：ab178013）、IL-1β ELISA 試劑盒（批號：ab197742）、TNF-α ELISA 試劑盒（批號：ab181421）均購自美國Abcam公司；HDL-C測定試劑盒（批號：A112-1-1）、LDL-C 測定試劑盒（批號：A113-1-1）、TG測定試劑盒（批號：A110-1-1）、TC測定試劑盒（批號：A111-1-1）均購自南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒（批號：C0105）購自上海碧云天生物科技有限公司；凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC）一抗（批號：67824）、半胱天冬酶-1（Caspase-1）一抗（批號：24232）、NLRP3 一抗（批號：15101）、NF-κB p65 一抗（批號：8242）、p-NF-κB p65一抗（批號：3033）、β-actin一抗（批號：6037）及羊抗小鼠二抗（批號：7074）均購自美國Cell Signaling Technology公司；酶標儀（型號：VICTOR X）購自德國Perkin Elmer公司；光學(xué)顯微鏡（型號：Ni-E）購自日本Nikon公司；蛋白電泳儀（型號：DYCZ-40B）購自上海啟閔生物科技有限公司；凝膠成像儀（型號：GIS-630）購自杭州Miulab公司。

1.2 方法

1.2.1 AS小鼠模型的構(gòu)建與分組 取12只C57BL/6J正常小鼠作為普通飲食組，即對照組（A組）。36只ApoE-/-小鼠隨機分成高脂飲食組即AS模型組（B組）、高脂飲食＋利拉魯肽組（C組）和高脂飲食＋利拉魯肽＋GLP-1受體抑制劑 exendin（9-39）組（D 組），每組12只。A組小鼠以普通飼料喂養(yǎng)，B、C、D組小鼠以高脂飼料（1%膽固醇＋15%豬油）喂養(yǎng)，飲用水均為蒸餾水，喂養(yǎng)過程中，飲水及飼料不限量[8]。AS小鼠造模成功標準：HE染色鏡下觀察到小鼠主動脈血管壁明顯增厚，有斑塊形成，管腔狹窄，局部有鈣化顆粒物沉淀[9]。C組小鼠在喂養(yǎng)高脂飼料的同時，每天背部皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽（約0.5 ml）[10]，D組小鼠背部皮下注射0.6 mg/kg利拉魯肽＋22 mol/kg exendin（9-39）（約 0.5 ml），A 組和B組小鼠背部皮下注射0.5 ml的0.9%氯化鈉注射液。所有小鼠均飼養(yǎng)在實驗室SPF級動物房。小鼠每周稱重1次，并及時更換墊料。

1.2.2 樣本采集 各組小鼠飼養(yǎng)至18周齡后，摘眼球取血，離心取上清液，置于-20℃中保存?zhèn)溆谩Ｈ缓箢i椎脫位處死小鼠，在無菌超凈工作臺上打開小鼠胸腔、腹腔，取升主動脈根部及下端至膈的主動脈組織，用無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗。剪取距升主動脈根部約0.5 cm的動脈組織置于4%多聚甲醛中固定，用于病理學(xué)觀察；然后仔細剝離出其余主動脈組織的內(nèi)膜，液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清炎性因子水平檢測 采用ELISA試劑盒對各組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平進行檢測，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 血清中血脂水平檢測 根據(jù)試劑盒說明書操作，對各組小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TG、TC的水平進行檢測。

1.2.5 主動脈病理學(xué)觀察 取出升主動脈根部組織，脫水透明，浸蠟包埋，切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并利用Image J軟件分析各組小鼠主動脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness,IMT）及主動脈AS面積與所取血管面積比值。

1.2.6 主動脈內(nèi)膜 NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取出主動脈內(nèi)膜組織，勻漿后提取總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉加一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC、β-actin，稀釋倍數(shù)均是 1∶500），4 ℃條件下孵育過夜，洗膜后加入二抗（1∶3 000），室溫孵育 2 h，洗膜顯色曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并以β-actin為內(nèi)參蛋白，分析各蛋白的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較 與A組相比，B組和D組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高（均P＜0.05）；與B組相比，C組小鼠血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平均降低（均 P＜0.05）；與 C組相比，D組小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高（均 P＜0.05）。見表 1。

表1 4組小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較（pg/ml）

2.2 4組小鼠血清HDL-C、LDL-C、TG、TC水平比較 與A組相比，B組和D組小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均升高（均 P＜0.05），HDL-C 水平均降低（均 P＜0.05）；與B組相比，C組小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均降低（均 P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠血清LDL-C、TG、TC水平均升高（均P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05）。見表2。

表2 4組小鼠血清HDL-C、LDL-C、TG、TC 水平比較（mmol/L）

2.3 4組小鼠主動脈病理學(xué)變化比較 A組小鼠主動脈血管壁未見明顯改變；B組小鼠主動脈血管壁明顯增厚，管腔狹窄，可見大量斑塊形成，有大量炎性細胞浸潤及脂質(zhì)沉淀；C組小鼠主動脈亦可見血管壁增厚，斑塊形成，但與B組相比，增厚程度明顯減輕，斑塊面積顯著減小，僅可見少量炎性細胞浸潤；D組小鼠主動脈血管壁增厚程度、斑塊形成面積及炎性細胞浸潤數(shù)量介于B組、C組之間，見圖1（插頁）。與A組相比，B組和D組小鼠主動脈IMT均升高（均P＜0.05）；與B組相比，C組小鼠主動脈IMT水平降低（P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠主動脈IMT水平升高（P＜0.05）；見表 3。

表3 4組小鼠主動脈IMT比較（mm）

2.4 4組小鼠主動脈AS面積與所取血管面積比值比較 與A組相比，B組和D組小鼠主動脈AS面積與所取血管面積比值均升高（均P＜0.05）；與B組相比，C組小鼠主動脈AS面積與所取血管面積比值降低（P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠主動脈AS面積與所取血管面積比值升高（P＜0.05）。見表4。

表4 4組小鼠主動脈AS面積與所取血管面積比值比較（%）

2.5 4 組小鼠主動脈內(nèi)膜 NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達水平比較 與A組相比，B組和D組小鼠主動脈內(nèi)膜NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）；與B組相比，C組小鼠主動脈內(nèi)膜NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平均降低（均P＜0.05）；與C組相比，D組小鼠主動脈內(nèi)膜 NLRP3、Caspase-1、ASC、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平均升高（均P＜0.05）。見圖2。

圖2 4組小鼠主動脈內(nèi)膜NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、半胱天冬酶 -1（Caspase-1）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（ASC）、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB p65 蛋白表達水平比較（a：蛋白表達電泳圖；b：蛋白表達水平比較；與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與 C 組比較，▲P＜0.05）

3 討論

AS是心血管疾病的重要病理生理過程，涉及先天性和適應(yīng)性免疫炎癥機制參與，是當今世界心血管疾病和死亡的主要原因[11]。本研究中給予ApoE-/-小鼠高脂飲食飼養(yǎng)以構(gòu)建AS小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS小鼠主動脈在光學(xué)顯微鏡下可見血管壁明顯增厚，管腔狹窄，并有大量斑塊及炎性浸潤，主動脈IMT、主動脈AS面積與所取血管面積比值及血清中LDL-C、TG、TC水平升高，HDL-C水平降低，揭示AS小鼠模型構(gòu)建成功。

越來越多證據(jù)表明，炎癥與AS的進展密切相關(guān)。在AS的發(fā)生、發(fā)展過程中，各種炎癥細胞和炎性介質(zhì)在脂肪條紋以及纖維斑塊、動脈粥樣硬化斑塊和不穩(wěn)定斑塊的形成和破裂中發(fā)揮作用[12]。NF-κB是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的各個方面[13]。NF-κB 通路的激活將導(dǎo)致 IL-1β、IL-6和 TNF-α等促炎細胞因子的過度產(chǎn)生[14]。本研究AS模型小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，主動脈內(nèi)膜p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平升高，表明AS小鼠體內(nèi)NF-κB p65通路處于活化狀態(tài)，炎性反應(yīng)增強，造成主動脈血管病理學(xué)損傷。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體可通過募集ASC并促進Caspase-1激活來調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的焦亡[15]。一些研究已經(jīng)證明多達70種Caspase-1蛋白底物在AS和血管炎癥中起作用[16]。活化的Caspase-1可引起促細胞凋亡的促炎形式，稱為細胞焦亡，其特征是細胞溶解并將細胞質(zhì)內(nèi)含物釋放到細胞外空間[17]，從而導(dǎo)致炎癥。本研究AS小鼠主動脈內(nèi)膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平均升高，說明細胞焦亡相關(guān)蛋白在AS小鼠主動脈內(nèi)膜中大量表達，其介導(dǎo)的細胞焦亡與AS發(fā)生進程密切相關(guān)。

利拉魯肽作為GLP-1類似物，常用于糖尿病的治療，在臨床使用過程中表現(xiàn)出良好的安全性[18]。Rakipovski等[19]研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕AS病變和保護血管內(nèi)皮，而且該功能的發(fā)揮與降糖作用無關(guān)。本研究中，AS小鼠在利拉魯肽作用下，小鼠主動脈血管壁的增厚程度減輕，斑塊面積減少，僅可見少量炎性細胞浸潤，血清炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低，LDL-C、TG、TC水平降低，HDL-C水平升高，主動脈內(nèi)膜中p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達水平降低。有研究在評估利拉魯肽對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷時發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可通過抑制NF-κB激活對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生明顯的抗氧化和抗炎作用[20]。這提示利拉魯肽可能通過抑制NF-κB激活，減輕AS小鼠炎癥反應(yīng)，減少血管壁斑塊沉積。另外，利拉魯肽預(yù)處理可有效抑制TNF-α和NLRP3炎癥小體活化，抑制TNF-α和缺氧導(dǎo)致的心肌細胞焦亡，發(fā)揮心臟保護作用[21]。在研究利拉魯肽對非酒精性肝炎中發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可通過線粒體抑制NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的細胞焦亡，減慢非酒精性脂肪性肝炎的進程[22]。本研究中，利拉魯肽可明顯降低AS小鼠主動脈內(nèi)膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平；而與利拉魯肽組相比，利拉魯肽和GLP-1受體抑制劑exendin（9-39）的雙重作用下的AS小鼠的病理學(xué)變化加重，血清炎癥因子水平、血脂水平及主動脈內(nèi)膜中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平均升高，表明利拉魯肽可抑制AS小鼠主動脈內(nèi)膜中NLRP3炎癥小體活化，且GLP-1受體抑制劑可逆轉(zhuǎn)利拉魯肽對AS小鼠炎癥反應(yīng)及主動脈病理學(xué)損傷的改善作用。

綜上所述，利拉魯肽可能通過抑制NF-κB/NLRP3信號通路，減輕AS小鼠的主動脈內(nèi)膜中的炎癥反應(yīng)和細胞焦亡，改善主動脈病理學(xué)損傷。但GLP-1對AS小鼠的作用機制比較復(fù)雜，其類似物利拉魯肽的藥效作用仍需進一步研究。