1株褐藻膠降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

劉海超， 張 健， 劉 芳， 王共明， 王藝欣， 趙云蘋， 鐘靜詩(shī)

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 200000；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006)

藻類是我國(guó)重要的海洋經(jīng)濟(jì)體系之一，褐藻膠是一種廣泛存在于褐藻細(xì)胞壁中的酸性陰離子海洋結(jié)構(gòu)多糖，含量約占干重的30%～60%[1]。此外，褐藻酸鹽也存在于一些紅藻中[2]，可由固氮菌[3]、 假單胞菌[4]等幾種細(xì)菌產(chǎn)生。由于其具有良好的增稠、乳化、穩(wěn)定等功能，已日益在生物材料、化妝品以及醫(yī)藥等[5-7]行業(yè)廣泛開發(fā)和應(yīng)用。褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸(M)及其C-5-差向異構(gòu)體α-L-古羅糖醛酸(G)為基礎(chǔ)，通過1,4-糖苷鍵連接的嵌段式線性高分子聚合物，存在3種聚合方式：同聚β-D-甘露糖醛酸(poly M)、同聚α-L-古羅糖醛酸(poly G)以及兩種單體交替排列聚合[8]。由褐藻膠降解而來的褐藻膠寡糖(Alginate oligosaccharide，AOS)因具有多種生物活性已成為近年來研究熱點(diǎn)。褐藻膠的降解方法主要有物理降解法、化學(xué)降解法和生物降解法。物理降解法主要有超聲波法、熱液法、輻射法等；化學(xué)法主要有氧化降解法、酸降解法、堿降解法等。生物降解法中褐藻膠裂解酶是降解褐藻膠的關(guān)鍵，與物理和化學(xué)法相比褐藻膠裂解酶具有催化效率高，底物專一性強(qiáng)，環(huán)保節(jié)能，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物活性高等優(yōu)點(diǎn)[9]，因此成為褐藻膠寡糖制備的主要方法。褐藻膠裂解酶可從多種來源分離得到，如海洋軟體動(dòng)物、海洋藻類及陸地真菌、細(xì)菌等[10]。但目前仍沒有統(tǒng)一的褐藻膠降解工程菌，因篩選的大部分可降解褐藻膠菌株普遍存在產(chǎn)酶量低，酶活力不穩(wěn)定、易失活等問題。達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)要求。因此開發(fā)具有高酶活力褐藻膠降解菌株一直是重點(diǎn)研究方向，對(duì)于海洋資源的高值化利用具有重要意義。本研究從海洋生物中分離篩選出一株具有高酶活力褐藻膠降解菌株B12，具有良好的酶活力穩(wěn)定性，并研究其降解褐藻膠的最佳產(chǎn)酶條件，以期提高其酶活力，為褐藻膠生物酶解工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 仿刺參(Apostichopusjaponicus)購(gòu)自煙臺(tái)市八角海鮮市場(chǎng)；口蝦蛄(Oratosquillaoratoria)、櫛孔扇貝(Chlamysfarre)購(gòu)自煙臺(tái)市鳳臺(tái)小區(qū)市場(chǎng)；蝦醬購(gòu)自濱州市無棣縣埕口鎮(zhèn)；九孔鮑(Haliotisdiversicolor)購(gòu)自煙臺(tái)市開發(fā)區(qū)星頤廣場(chǎng)某超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 固體初篩培養(yǎng)基(g/L)：海藻酸鈉5，酵母膏1，蛋白胨5，瓊脂20，NaCl 30，三級(jí)純水配制,裝入500 mL三角瓶中，自然pH值(約為6.2),121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌。種子液培養(yǎng)基與液體復(fù)篩培養(yǎng)基均無瓊脂，其他組分與固體初篩培養(yǎng)基組分相同。

1.1.3 主要試劑 API 20E腸桿菌科G-桿菌鑒定試劑盒購(gòu)自梅里埃生物科技有限公司；Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；海藻酸鈉(CP)、酵母膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、3,5-二硝基水楊酸、四水合酒石酸鉀鈉、十二水合磷酸氫二鈉、亞硫酸氫鈉、結(jié)晶酚購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；叔丁醇、戊二醛25%水溶液購(gòu)自西隴化工股份有限公司，以上試劑未作特殊說明均為分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀(1510，美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；離心機(jī)(5453 Mini Spin Plus，德國(guó)Eppendorf AG)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M，湖南湘儀儀器有限公司)；pH計(jì)(s210，瑞士Mettler-Toledo)；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(GR60DA，廈門致微儀器有限公司)；生化培養(yǎng)箱(BSP-100F，沙鷹科學(xué)儀器(上海)有限公司)；震蕩培養(yǎng)箱(MQL-61R，上海旻泉儀器有限公司)；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(HH-4，常州國(guó)華電器有限公司)；層析實(shí)驗(yàn)冷柜(YC-800，北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)酶菌種篩選 蝦醬用磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4)按照1∶10(m/v)比例均質(zhì)后選擇不同稀釋度涂布到固體初篩培養(yǎng)基；仿刺參、口蝦蛄、櫛孔扇貝、九孔鮑體表經(jīng)75%酒精擦拭處理，取仿刺參和口蝦蛄腸道，櫛孔扇貝和九孔鮑內(nèi)臟，用PBS按照1∶10(m/v)比例均質(zhì)后選擇不同稀釋度涂布到固體初篩培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，篩選有透明圈或者培養(yǎng)基凹陷明顯的菌落繼續(xù)劃線培養(yǎng)分離純化。純化后挑取1個(gè)菌落接種到種子液培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，按照3%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定褐藻膠降解酶的酶活力。純化菌種液用30%(體積分?jǐn)?shù))甘油于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[11]測(cè)定菌株酶活力，酶活力定義單位(U)：每分鐘釋放1 μg還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。酶活力計(jì)算公式：

式中：m為還原糖量(mg)(根據(jù)OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得)；N為稀釋倍數(shù)(酶液為離心的發(fā)酵液)；T為反應(yīng)時(shí)間(20 min)；V為酶液體積(0.2 mL)。

1.2.3 菌株生物量及其生長(zhǎng)曲線測(cè)定 菌株于液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，每隔6 h取200 μL發(fā)酵液于600 nm下測(cè)其吸光值，記錄生物量，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量測(cè)定 Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 菌種鑒定 將菌株B12純菌落用無菌水從固體平板培養(yǎng)基中沖洗至離心管中，8 000 r/min離心5 min，重復(fù)3次，送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rDNA基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線程序BLAST進(jìn)行分析，序列登錄號(hào)為M9Z5VBYP014，與已知微生物進(jìn)行16S rDNA基因序列比對(duì)，選擇下載較高相似性的序列利用MEGAX軟件并采用鄰接法(Neighbour-joining，NJ)構(gòu)建發(fā)育樹，Bootstrap重復(fù)1 000次檢驗(yàn)發(fā)育樹穩(wěn)定性。

1.2.6 菌株生理生化特征及電鏡觀察 采用API 20E腸桿菌科G-桿菌試劑盒研究菌株B12生理性狀，對(duì)該菌株進(jìn)行固定、脫水、干燥前處理用于電鏡觀察菌株形態(tài)。

1.2.7 產(chǎn)酶條件研究 發(fā)酵條件是決定發(fā)酵效率高低的重要因素，對(duì)菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化有利于提高褐藻膠降解效率。通過單因素試驗(yàn)對(duì)影響產(chǎn)酶的5個(gè)培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基初始pH值、NaCl質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度、接種量和裝液量)的最優(yōu)參數(shù)進(jìn)行探究，各因素水平見表1，酶活力及生物量測(cè)量采用1.2.2及1.2.3方法，每一步優(yōu)化結(jié)果均用于后續(xù)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)平行，重復(fù)3次。將培養(yǎng)液裝入250 mL錐形瓶中，28 ℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)酶活力，取菌懸液測(cè)生物量，研究各因素對(duì)B12菌株生長(zhǎng)及其產(chǎn)酶條件的影響。

表1 單因素水平分布

1.2.8 酶活力穩(wěn)定性的研究 將B12菌株的粗酶液分別置于4 ℃冷藏保存和最適產(chǎn)酶溫度28 ℃恒溫保存，每隔20 min檢測(cè)其酶活力，觀察該菌株的酶活力穩(wěn)定性。

1.2.9 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件研究 基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)[12]。全面考察培養(yǎng)基初始pH值、NaCl質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量對(duì)菌株B12產(chǎn)酶活力的影響。根據(jù) Box-Behnken設(shè)計(jì)，進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得出最佳酶解條件。試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選

以海藻酸鈉為唯一碳源的固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌種初篩，挑選代謝海藻酸鈉使培養(yǎng)基表面產(chǎn)生凹陷或透明圈的不同形態(tài)菌落62個(gè)至新培養(yǎng)基中劃線純化培養(yǎng)。純化后的菌株DNS法測(cè)其酶活力，結(jié)果見表3，獲得的菌株B12酶活力為66.13 U/mL。

表3 DNS法檢測(cè)酶活力

2.2 發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量

菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測(cè)定培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量，以未接菌培養(yǎng)基為0基線，蛋白質(zhì)變化分布于坐標(biāo)軸上下兩側(cè)，如圖1所示，部分菌株發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量低于未接菌的空白培養(yǎng)基，推測(cè)為該菌株利用了培養(yǎng)基中的蛋白胨、酵母膏為其生長(zhǎng)代謝提供能量，故消耗了發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量。另外大部分菌株發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量高于空白組發(fā)酵液，說明該部分菌株可能產(chǎn)生褐藻膠裂解酶分泌到胞外培養(yǎng)基中，使其蛋白質(zhì)含量增加。與表3對(duì)比，菌株蛋白質(zhì)產(chǎn)生量與其酶活力高低不成正比，分析可能是產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不都是褐藻膠裂解酶，且不同裂解酶反應(yīng)速率存在差異。

圖1 發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量Fig.1 Protein content in fermentation broth

2.3 菌株16S rDNA鑒定結(jié)果分析

經(jīng)測(cè)序結(jié)果可知，菌株B12的16S rDNA基因序列1 455 bp，通過NCBI中的BLAST程序比對(duì)發(fā)現(xiàn)與弧菌屬的多個(gè)菌株序列相似性為99%，將其歸屬弧菌屬。系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，該菌株與MN938231.1Vibrioowensiistrain 3-8親緣關(guān)系最近。周敏[13]也從海洋動(dòng)物中篩選到弧菌屬高酶活力褐藻膠降解菌株，郭恩文等[14]從褐藻中篩得1株海洋弧菌(Vibriosp.QY107)，且該菌株為雙功能褐藻膠降解酶，降解產(chǎn)物為褐藻膠三糖。

2.4 菌株生理生化特征

菌株B12的生理生化鑒定結(jié)果如表4所示，該菌株為革蘭陰性菌，菌落白色，光滑，不易挑取，B12電鏡結(jié)果如圖3所示，呈粗糙長(zhǎng)桿狀，直徑約5 μm。

圖2 基于16S rDNA序列的弧菌屬系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Vibrio sp. based on 16S rDNA sequence

表4 菌株B12生理生化鑒定結(jié)果

圖3 菌株B12電鏡掃描結(jié)果Fig.3 SEM results of strain B12

2.5 菌株B12單因素試驗(yàn)

2.5.1 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株B12生長(zhǎng)及酶活力影響 pH值可影響微生物細(xì)胞膜電荷的變化，進(jìn)而影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響生命活動(dòng)中酶的活性。研究了B12菌株在不同pH值下的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況，如圖4所示。菌株B12在pH值4～5范圍內(nèi)隨著pH值的增加生物量快速增加，pH值5～6范圍內(nèi)生物量增加減緩，pH值為6時(shí)，生物量和酶活力都達(dá)到最高值，酶活力為67.44 U/mL。隨著pH值的繼續(xù)增加，生物量及其酶活力逐漸降低。由結(jié)果可知，微酸環(huán)境有利于菌株B12的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。這與多數(shù)產(chǎn)褐藻膠降解酶菌株適于中性環(huán)境pH值6～9[15-17]相符。

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of initial pH of culture medium on growth and enzyme production of the strain

2.5.2 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株B12生長(zhǎng)及酶活力影響 培養(yǎng)基中的NaCl通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓來維持細(xì)胞的活性。如圖5所示，NaCl質(zhì)量濃度在10～20 g/L范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，菌株B12酶活力和生物量均有顯著增加，并在NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)達(dá)到最大，酶活力為68.91 U/mL。隨著NaCl質(zhì)量濃度繼續(xù)增加，菌株生長(zhǎng)及酶活力受到抑制而逐漸降低，與多數(shù)從海洋中篩選得到的褐藻膠降解菌株最適NaCl質(zhì)量濃度為20～30 g/L[18-19]相符?？赡苁怯捎诟哔|(zhì)量濃度NaCl使處于高滲環(huán)境中的細(xì)胞失水收縮，影響微生物的正常生理功能，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)繁殖受到抑制。而在低滲環(huán)境中，由于細(xì)菌有細(xì)胞壁保護(hù)，對(duì)其影響較小，且菌株B12為海洋動(dòng)物中篩得，故NaCl質(zhì)量濃度在20～30 g/L較適宜生長(zhǎng)。

圖5 NaCl質(zhì)量濃度對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on the growth and enzyme production of the strain

2.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株B12生長(zhǎng)及酶活力影響 溫度會(huì)影響微生物細(xì)胞膜的流動(dòng)性，影響細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)的交換和吸收，進(jìn)而影響菌株的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)，溫度對(duì)酶活力具有一定影響，從而影響微生物的生理代謝等功能。如圖6所示，隨著溫度的升高，菌株生長(zhǎng)迅速，酶活力不斷提高，28 ℃時(shí)，酶活力和生物量達(dá)到最大，最高酶活力為79.14 U/mL。隨著溫度的繼續(xù)升高，菌株生物量增長(zhǎng)減緩且呈下降趨勢(shì)，酶活力顯著下降。分析原因可能是菌株B12來源于海洋環(huán)境，溫度過高影響其酶活力，且與多數(shù)已研究的褐藻膠降解菌株產(chǎn)酶最適溫度在30～50 ℃之間相符[20-23]。溫度繼續(xù)升高對(duì)菌株生長(zhǎng)量影響較小，分析可能原因是此溫度范圍在該菌株的耐受范圍內(nèi)，因此可正常生長(zhǎng)繁殖。

圖6 溫度對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth and enzyme production of the strain

2.5.4 接種量對(duì)菌株B12生長(zhǎng)及酶活力影響 研究了接種量分別為1%、2%、3%、4%和5%對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響。如圖7所示，隨著接種量的增加，菌株酶活力先增加后下降，且在接種量為2%時(shí)達(dá)到最大，最大酶活力為53.74 U/mL。接種量超過2%之后，隨著濃度的增加，該菌株生物量表現(xiàn)為放緩趨勢(shì)。分析原因：一是菌株可能達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期，接種量增加，使得在有限空間內(nèi)菌株生長(zhǎng)快速達(dá)到飽和狀態(tài)并有加速進(jìn)入衰退期的趨勢(shì)，使其酶活力下降[24]；二是接種量增加菌株生長(zhǎng)迅速，菌株代謝產(chǎn)物不斷增加，改變其生長(zhǎng)環(huán)境，不利于菌株產(chǎn)酶[25-26]。

圖7 接種量對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the growth and enzyme production of the strain

2.5.5 裝液量對(duì)菌株B12生長(zhǎng)及酶活力影響 裝液量也是影響菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的重要因素，裝液量過少在搖瓶培養(yǎng)過程中導(dǎo)致水分蒸發(fā)快，影響菌株生長(zhǎng)；裝液量過多使培養(yǎng)基中溶氧量降低，影響菌株生理活性[27]。裝液量對(duì)菌株的生長(zhǎng)及酶活力情況如圖8所示，隨著裝液量的增加，菌株B12的生長(zhǎng)及酶活力呈先上升后下降趨勢(shì)，250 mL錐形瓶中裝液量為60 mL時(shí)，菌株生長(zhǎng)及酶活力達(dá)到最大為61.51 U/mL。裝液量20～ 60 mL時(shí)，酶活力增加緩慢，60～100 mL時(shí)，酶活力迅速下降，說明菌株B12為好氧菌且對(duì)氧氣要求嚴(yán)格。

圖8 裝液量對(duì)菌株B12生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of liquid loading on the growth and enzyme production of strains

2.6 菌株B12酶活力穩(wěn)定性

觀察菌株B12的粗酶液在冷藏(4 ℃)和最適溫度(28 ℃)下的酶活力穩(wěn)定性。結(jié)果如圖9所示，前40 min內(nèi)隨著時(shí)間的增加，酶活力趨于平緩，穩(wěn)定性較好，40～60 min時(shí)，酶活力顯著降低，60～100 min時(shí)酶活力下降變緩，100～120 min酶活力持續(xù)緩慢降低。4 ℃和28 ℃保存40 min后酶活力分別達(dá)到初始酶活力的97.3%和93.1%，與龐敏[11]所測(cè)菌株酶活力穩(wěn)定性趨勢(shì)一致，40 min內(nèi)最適溫度下，酶活力下降緩慢，說明菌株B12所產(chǎn)褐藻膠降解酶酶活力穩(wěn)定性較好。120 min后酶活力分別為初始酶活力的57%和52.7%，兩溫度下剩余酶活力相差不大，120 min內(nèi)，4 ℃冷藏保存相比于28 ℃恒溫保存酶活力損失略低，需進(jìn)一步探究最適的酶活力保存溫度。

圖9 菌株B12酶活力穩(wěn)定性曲線Fig.9 Enzyme activity stability curve

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.7.1 回歸模型建立及其顯著性檢驗(yàn) 采用Design Expert中Box-Benhnken(BBD)設(shè)計(jì)5因素3水平的試驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。對(duì)表中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二元多次回歸模擬方程：酶活力(U/mL)=95.10+1.37A+0.32B+2.16C-0.82D+0.68E-0.017AB+0.067AC+0.53AD+1.04AE-0.45BC-0.31BD+7.500(E-003)BE-0.74CD-0.74CE+1.07DE-19.59A2-8.90B2-10.89C2-10.62D2-5.59E2。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化模型與試驗(yàn)結(jié)果

表6 回歸模型方差分析

2.7.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析 響應(yīng)面中等高線可直接反應(yīng)兩因素交互作用的強(qiáng)弱，等高線呈橢圓形、等高線密集度越高表明兩因素交互作用越顯著，反之，交互作用越不顯著。響應(yīng)面中3D曲面圖形可反應(yīng)響應(yīng)值隨各影響因素及影響因素間的變化趨勢(shì)。圖10(a)、(c)和(d)中等高線圖呈橢圓形，說明培養(yǎng)基初始pH值與接種量、裝液量與接種量、培養(yǎng)溫度與裝液量間的交互作用顯著。其中圖10(d)的等高線等值線最為密集，說明培養(yǎng)溫度與裝液量間的交互作用極大，圖10(a)3D曲面顯示，pH值的變化曲面弧度相比較接種量的變化趨勢(shì)更陡，說明培養(yǎng)基初始pH值對(duì)酶活力的影響較接種量顯著。圖10(b)3D曲線圖形顯示，培養(yǎng)溫度變化曲面較培養(yǎng)基初始pH值平緩，說明培養(yǎng)溫度沒有培養(yǎng)基初始pH值對(duì)響應(yīng)值的作用顯著。其余各因素間等高線偏圓形(圖略)，說明交互作用不顯著。

圖10 各因素交互作用影響Fig.10 The interaction of various factorsa：培養(yǎng)基初始pH值與接種量；b：培養(yǎng)基初始pH值與溫度；c：裝液量與接種量；d：溫度與裝液量a：Initial pH of medium and inoculum quantity；b：Initial pH of medium and temperature；c：The amount of liquid loading and inoculat；d：Temperature and liquid volume

2.7.3 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析 響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH值6.52，NaCl質(zhì)量濃度20.1 g/L，培養(yǎng)溫度28.2 ℃，接種量2.1%，裝液量59.5 mL。將上述模型根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行參數(shù)修正，調(diào)整為培養(yǎng)基初始pH值6.5，NaCl質(zhì)量濃度20 g/L，培養(yǎng)溫度28 ℃，接種量2%，裝液量59.5 mL。進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，酶活力均值91.68 U/mL，與預(yù)測(cè)值90.62 U/mL接近，說明優(yōu)化模型準(zhǔn)確可靠，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值擬合較好，回歸方程可信度較好。

2.8 優(yōu)化前后菌株B12生長(zhǎng)及酶活力曲線

對(duì)菌株B12發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線進(jìn)行比較，結(jié)果如圖11所示，優(yōu)化后相較于優(yōu)化前，菌株生物量顯著提高，生長(zhǎng)曲線延滯期縮短6 h，酶活力顯著提高，酶活力最高值達(dá)91.54 U/mL。起始產(chǎn)酶時(shí)間由優(yōu)化前的12 h縮短至6 h，酶活力提高了1.38倍。

圖11 優(yōu)化前后菌株B12生長(zhǎng)和酶活力曲線Fig.11 The growth and enzyme production curve of the strain before and after optimization

3 討 論

利用生物法降解褐藻多糖生產(chǎn)具有天然活性褐藻膠寡糖的關(guān)鍵是篩選高酶活力褐藻膠降解菌株。近年來，褐藻膠降解菌株的篩選、褐藻膠裂解酶的開發(fā)依然是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，已報(bào)道的多糖降解菌株最適溫度多在30～50 ℃之間，熱穩(wěn)定性較差[28]，Yagi等[19]篩選出希瓦氏菌(Shewanella)產(chǎn)褐藻膠裂解酶60 ℃左右?guī)缀鯖]有酶活力。Yang等[29]在沿海土壤中分離得到1株微球菌(Microbulbifer)，其酶活力最適溫度為40 ℃，最適pH為9。多數(shù)海洋褐藻膠裂解酶喜好中性偏堿環(huán)境，部分適宜微酸環(huán)境，如嚴(yán)芬等[30]以透明圈法初篩，DNS法復(fù)篩，從海洋生物中分離出1株假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)，其最適培養(yǎng)基初始pH為5.5，優(yōu)化后酶活力提高到71.94 U/mL。

本研究以海藻酸鈉為唯一碳源配制選擇性培養(yǎng)基，從多種海洋生物及其制品中取樣，篩選得到62株具有褐藻膠降解能力的菌株，經(jīng)發(fā)酵復(fù)篩，以DNS法測(cè)酶活力，得到來源于口蝦蛄腸道菌株B12。通過16S rDNA序列分析、生理生化試驗(yàn)、電鏡掃描鑒定菌株B12為弧菌屬。通過蛋白質(zhì)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)不同褐藻膠裂解酶降解速率不同，利用響應(yīng)面法得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基初始pH值6.52，NaCl質(zhì)量濃度20.1 g/L，培養(yǎng)溫度28.2 ℃，接種量2.1%，裝液量59.5 mL。優(yōu)化后菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，酶活力達(dá)91.68 U/mL，較優(yōu)化前提高38.5%。優(yōu)化后菌株產(chǎn)酶時(shí)間縮短了6 h。本研究中菌株B12所產(chǎn)褐藻膠裂解酶量不是最多，但酶活力最高，因此有進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì)的意義，為褐藻膠降解、褐藻膠寡糖制備的工程菌、褐藻膠裂解酶等的開發(fā)應(yīng)用提供參考。