植物內(nèi)生放線菌多樣性及其活性代謝產(chǎn)物的研究進展

封 明， 劉文杰， 蘇 譽， 王 楠， 毛 瑜， 張新國* ， 張 繼

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院 甘肅省中藏藥篩選評價及深加工重點實驗室，甘肅 蘭州 730050；2.西北師范大學 生命科學學院，甘肅 蘭州 730050)

自20世紀40年代青霉素和鏈霉素相繼被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員從不同的微生物，特別是放線菌中發(fā)現(xiàn)了大量具有生物活性的代謝產(chǎn)物[1]。研究顯示，已經(jīng)有超過30 000多種天然產(chǎn)物從微生物中被分離鑒定，這其中有超過50%的活性物質(zhì)(如抗生素)源自于放線菌(70%為鏈霉菌屬)的代謝產(chǎn)物。放線菌無疑是天然活性物質(zhì)極為豐富的重要微生物資源[2]。然而，隨著放線菌分離鑒定方法的成熟及其廣泛應用，從自然環(huán)境中獲取新的放線菌正在變得越來越困難[3]。 植物內(nèi)生放線菌是植物內(nèi)生菌中重要的一員，是存在于植物各組織內(nèi)而且不會引起宿主植物產(chǎn)生明顯感染癥狀，并與植物長期共存的一類微生物[4]。研究顯示，植物內(nèi)生放線菌不僅具有促進宿主植物生長繁殖的作用，而且能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物。植物內(nèi)生放線菌作為一種遠未完全開發(fā)的微生物資源，對其進行更進一步的探索意義重大[5]。本文介紹了近年來國內(nèi)外關(guān)于植物內(nèi)生放線菌的研究現(xiàn)狀，并總結(jié)了一些重要的研究進展。

1 植物內(nèi)生放線菌的多樣性

植物內(nèi)生放線菌廣泛存在于各種植物中，在長期協(xié)同進化過程中與宿主植物形成了互利共生的關(guān)系[6]。最早被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生放線菌是能與各種非豆科植物形成根瘤并具有固氮作用的弗蘭克氏菌屬(Frankiasp.)[7]。此后，研究人員陸續(xù)在不同植物包括藻類[8]、苔蘚類[9]、蕨類[10]、地衣[11]、裸子植物[12]和被子植物[13]等中相繼發(fā)現(xiàn)了不同種類的內(nèi)生放線菌。越來越多的研究顯示，在已有研究的不同種類的植物中，都有植物內(nèi)生放線菌存在[14]。

內(nèi)生放線菌不僅廣泛分布于各類植物，而且在植物的不同組織部位如根、莖、葉等均有分布。研究證實，不同植物內(nèi)生放線菌的多樣性和群落結(jié)構(gòu)在植物不同組織部位的分布存在著顯著差異，其中以植物的根部組織分布為多[15]。Passari等[16]從7種藥用植物的不同部位中分離到42株內(nèi)生放線菌，其中從根中分離到的放線菌最多(22株，52.4%)，其次是莖(9株，21.4%)、葉(6株，14.3%)、花(3株，7.1%)和葉柄(2株，4.8%)。Gangwar等[17]對蘆薈、薄荷和圣羅勒3種藥用植物的內(nèi)生放線菌多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生放線菌最多見于根(占所有菌株的70%)，其次是莖(17.5%)和葉(12.5%)。Verma等[18]從印楝中分離出55株內(nèi)生放線菌，大多數(shù)菌株(30株，54.54%)來自根，其次是莖(13株，23.6%)和葉(12株，21.8%)。Gangwar等[19]從印度醋栗中共分離到36株內(nèi)生放線菌，有18株(50%)分布在根部，莖和葉均分離出9株放線菌，各占25%。但是也有研究顯示，根以外的組織也是內(nèi)生放線菌存在的主要部位。Kampapongsa等[20]從3種水稻樣品中分離獲得116株內(nèi)生放線菌，對植物不同部位放線菌的分析表明，從葉鞘中分離出的放線菌最多，有47株(40.5%)，從莖、葉和根中分別獲得34(29.3%)、18(15.5%)和17(14.7%)株放線菌。Vu等[21]從越南Hoa Binh省藥用植物肉桂的根、莖和葉中分離出111種放線菌，從莖中分離出的放線菌最多，有67株占60.4%，其次從根部分離出29株，葉子中分離出的內(nèi)生放線菌最少，只有15株。

植物內(nèi)生放線菌除了具有組織分布多樣性還具有明顯的地理差異性，研究表明不同地域的同一種植物其內(nèi)生放線菌種類和數(shù)量均有所不同。陳萌等[22]從四川省不同地區(qū)的川楝中共分離得到403株內(nèi)生放線菌，從廣元地區(qū)采集的樣品中分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量最多，有86株；而綿陽地區(qū)最少，只分離到12株。Musa等[23]從新疆伊犁和塔城兩個干旱地區(qū)的中草藥百里香中分離到126株內(nèi)生放線菌，其中，塔城地區(qū)可培養(yǎng)的內(nèi)生放線菌屬的多樣性(71株，56.3%)高于伊犁州(55株，43.7%)。姜龍芊等[24]從西雙版納、白茫雪山、波羅的海南岸地衣中共分離到1 123株內(nèi)生菌，鑒定菌株417株，從西雙版納地衣樣品分離出放線菌107株，從白茫雪山樣品中分離到103株放線菌，從波羅海南岸地衣樣品分離出的內(nèi)生放線菌最少，僅有65株。

廣泛分布的植物內(nèi)生放線菌種類龐雜，不僅存在明顯的分布差異，而且具有豐富的種屬多樣性，隨著研究的深入，許多不同種類的放線菌群從不同的植物中被陸續(xù)分離[25]。羅紅麗等[26]從植物百部塊根中分離出18株內(nèi)生放線菌，經(jīng)16S rRNA序列分析將其分為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、小單孢菌屬(Micromonosporasp.)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiasp.)和甲基桿菌屬(Methylobacterium)。Li等[27]從植物黃花蒿中共分離出228株植物內(nèi)生放線菌，對其中119株菌進行16S rRNA基因測序，其主要分類結(jié)果包括糖霉菌屬(Glycomycessp.)、野野村氏菌屬(Nonomuraeasp.)和原小單孢菌屬(Promicromonosporasp.)等19個屬。Shan等[28]對茶樹中放線菌的豐度和多樣性進行系統(tǒng)的研究，從中國福建省15種茶樹中共分離出46種放線菌，根據(jù)16S rRNA序列分析，將這些菌株分為鏈霉菌屬、馬杜拉放線菌屬(Madurasp.)和韓國生工菌屬(Kribbellasp.)等13個屬。Kuncharoen等[29]從泰國的14種植物中分離出37種內(nèi)生放線菌，根據(jù)其表型特征和16S rRNA基因序列，將其分為小單孢菌屬21株、鏈霉菌屬14株、植物生孢菌屬1株(Plantactinosporasp.)和多形孢菌屬1株(Polymorphosporasp.)。穆珊[30]從健康及感染黃萎病的番茄植株中分離獲得了140株放線菌，其中鏈霉菌屬109株，占77.9%；野野村氏菌屬15株，占10.7%；諾卡氏菌屬(Nocardiasp.)和小單孢菌屬4株，均占2.9%；糖霉菌屬和紅球菌屬(Rhodococcussp.)3株，均占2.1%，各有3株；馬杜拉放線菌屬僅2株，占1.4%。植物內(nèi)生放線菌多樣性見表1。

表1 植物內(nèi)生放線菌的多樣性

續(xù)表1

2 植物內(nèi)生放線菌活性代謝產(chǎn)物的研究

內(nèi)生放線菌作為一種亟待開發(fā)的重要微生物資源，絕大部分可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，是尋找新穎結(jié)構(gòu)候選化合物的重要資源。隨著越來越多活性次生代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，對內(nèi)生放線菌挖掘性研究正引起研究人員的廣泛關(guān)注[38]。本文就最近幾年有關(guān)植物內(nèi)生放線菌活性研究代謝產(chǎn)物研究進行匯總,見表2。

2.1 抗菌活性

放線菌作為重要的抗菌化合物的來源[2]，研究人員從內(nèi)生放線菌中分離獲得了許多具有潛在應用價值的抗菌活性物質(zhì)。Ameen等[39]從長葉薄荷(Menthalongifolia)、小花錦葵(Malvaparviflora)和無頭公烏(Pulicariaundulata)3種植物中均分離出了具有抑菌活性的內(nèi)生放線菌，其中2株小單孢菌(Micromonosporasp.)和1株放線桿菌(Actinobacteriabacterium)發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)的最(MIC)小抑菌濃度在80～160 μg/mL之間。魏少鵬等[40]從藥用植物小檗中分離出1株具有抗菌活性的內(nèi)生放線菌Streptomycessp. H21，并從中分離出廣譜抗生素——全霉素，其對蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽胞桿(Bacillussubtilis)、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為0.078、0.313、0.156和0.313 μg/mL。Bunbamrung等[41]從綠蘿根組織中內(nèi)生放線菌Streptomycessp. TBRC7642中分離出的化合物Sch 68631(murayaquinone)對革蘭陽性菌蠟狀芽胞桿菌和革蘭陰性菌大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)均具有抗菌活性，MIC值分別為3.13、25.00和6.25 μg/mL，顯示了進一步研究開發(fā)的潛力。

隨著抗生素的不合理應用，細菌耐藥性正成為日益嚴峻的問題，據(jù)WTO資料統(tǒng)計，每年因耐藥菌感染而死亡的人數(shù)超過70多萬[42]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)是導致大規(guī)模醫(yī)療感染并廣泛存在于動物源性食品中，嚴重危害人類健康的耐藥菌[43]。席楠等[44]從刺五加內(nèi)生放線菌StreptomycestauricusCWJ-107中分離出化合物cinerubin B，對MRSA具有良好的抗菌活性，MIC值為1 μg/mL。Gos等[45]從巴西藥用植物Vochysiadivergens中分離出10種內(nèi)生放線菌，菌株AeromicrobiumpontiLGMB491發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對MRSA的抑制活性最好，MIC值為0.04 mg/mL。Junaidah等[46]對巴西藥用植物中的內(nèi)生放線菌抑菌活性進行研究，其中生姜中分離出的內(nèi)生放線菌Streptomycessp. SUK25顯示出對MRSA的抑菌活性，MIC值為2.44 μg/mL。Vu等[47]從越南Yen Bai省肉桂中分離出內(nèi)生放線菌StreptomycescavourensisYBQ59并從中分離出8個化合物，其中化合物1-monolinolein抗菌活性最高，對MRSA(ATCC 33591)和耐甲氧西林表皮葡萄球菌ATCC 35984(MRSE)MIC值分別為8.5和14.6 μg/mL。溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)和頭狀葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)是臨床較為常見的引起化膿性感染的多重耐藥菌[48]。Sabu等[49]的研究顯示，萬古霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素對臨床分離的多重耐藥株S.capitis267和S.haemolyticus41抑制范圍分別為17、29、21 mm和18、18、24 mm，從生姜中分離出的內(nèi)生放線菌Nocardiopsissp. ZoA1發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對上述兩株耐藥菌的抑制范圍分別為25和28 mm，顯示了較好的抑菌潛力。這些研究將為進一步從內(nèi)生放線菌中發(fā)現(xiàn)抗耐藥菌藥物指明方向。

此外，研究顯示許多植物內(nèi)生放線菌的代謝產(chǎn)物還具有抑制植物病原菌的生物活性。蘋果樹腐爛病菌(Valsamali)是一種能引起蘋果樹腐爛病且分布廣泛的病原真菌。曹艷等[50]從冬青衛(wèi)矛內(nèi)生放線菌中分離得到具有抑制蘋果樹腐爛病菌的內(nèi)生放線菌，其中StreptomycesflavofuscusG1菌株中分離出的化合物4′-deacetyl-(-)-griseusin A抑制蘋果樹腐爛病菌的IC50值為14.70 μg/mL，與陽性對照嘧菌酯(azoxystrobin)的IC50值2.91 μg/mL相比，表現(xiàn)出良好的抗菌活性潛力。Wang等[51]從黃瓜根部分離出具有成為蘋果樹腐爛病生防劑潛力的內(nèi)生放線菌SaccharothrixyanglingensisHhs.0.15，進一步從中分離出化合物Fungichromin和1′-deoxyfungichromin，EC50值分別為5.24和4.92 μg/mL，其中化合物Fungichromin以 1 mg/mL連續(xù)處理感染蘋果樹腐爛病菌的試驗枝條7 d后，保護率達到81.48%。Sun等[4]從丹參分離出的內(nèi)生鏈霉菌PKU-EA00015中，分出7個新化合物strepimidazoles A～G，其中化合物strepimidazoles B和C對黃萎病菌V991(VerticilliumdahliaeV991)表現(xiàn)出最好的抑制作用，兩個化合物抑制作用分別為77%和74%，與紐莫康定B0的抑制活性相當。Supong等[52]對分離自水稻(OryzasativaL.)的內(nèi)生放線菌Streptomycessp. BCC72023進行研究，從中分離出5個化合物，所有化合物對惡性瘧原蟲K-1菌株(具有多重耐藥性)的IC50值在1.40～5.23 μg/mL范圍內(nèi)。

2.2 抗腫瘤活性

目前，腫瘤仍然是我國因病死亡人數(shù)最多的疾病，每年死亡病例高達281萬例。因此，尋找抗腫瘤新藥仍然具有非常重要的意義。盡管基于植物內(nèi)生放線菌抗腫瘤活性的研究還相對較少，但是科研人員仍然獲得了很多令人欣喜的成果。Qiu等[53]從四川省13種傳統(tǒng)藥用植物中共分離出119種內(nèi)生放線菌，對其中80株菌進行抗腫瘤活性篩選研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)87.5%的內(nèi)生放線菌具有抑制人肝癌細胞HepG2的活性。王新位等[54]從刺五加內(nèi)生放線菌Streptomycessp. CWJ-256中成功分離得到化合物efomycin G和elaiophylin，進一步研究顯示兩者對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細胞MDA-MB-231均有增殖抑制效果，IC50值分別為4.385和2.118 μmol/L。Zhang等[55]從健康大豆根部內(nèi)生放線菌Streptomycessp. neau-D50分離出的化合物3-acetonylidene-7-prenylindolin-2-one和7-isoprenylindole-3-carboxylic acid對人肺腺癌細胞系A549具有細胞毒活性，IC50值分別為3.3和5.1 μg/mL，與陽性對照阿霉素(4.2 μg/mL)相當。Igarashi等[56]從豆科植物根瘤中的內(nèi)生放線菌Micromonosporalupini分離到一種新的蒽醌衍生物lupinacidin C，對小鼠結(jié)腸癌細胞有強烈的抑制作用，IC50值為0.019 μg/mL。Conti等[57]從巴西藥用植物LychnophoraericoidesMart.的內(nèi)生放線菌Streptomycessp. RLe8中分離出化合物2,3-dihydro-2,2-dimethyl-4(1H)-quinazolinone，對結(jié)腸癌細胞系HCT-8、膠質(zhì)母細胞瘤細胞SF-295、黑素瘤細胞MDA-MB435和早幼粒細胞白血病細胞系HL-60均有強烈的細胞毒活性，IC50值分別為1.10、2.20、1.86和1.76 μg/mL。

2.3 抗蟲活性

研究發(fā)現(xiàn)很多植物內(nèi)生放線菌的次級代謝產(chǎn)物中含有抗蟲活性物質(zhì)。陶玲等[58]從紅樹林植物木欖內(nèi)生放線菌 (Streptomycesalbidoflavus)發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物中分離出不飽和脂肪酸-5,8-二烯十四酸，其對秀麗隱桿線蟲的LC50值為162.8 μg/mL，遠高于殺蟲劑甲胺磷的LC50值(3 282.46 μg/mL)，顯示出較強的抗蟲活性。Zhao等[59]從傳統(tǒng)中藥直立百部內(nèi)生菌尋找新的殺蟲次生代謝產(chǎn)物的過程中，從內(nèi)生放線菌Streptomycessp. BS-1中分離鑒定出10種具有顯著殺蟲活性的新型吡咯羧酸酯類化合物AJ(1～10)，所有化合物均對棉蚜蟲表現(xiàn)出了很強的致死性(72 h的LC50值為3.55～32.00 μg/mL)。Chen等[60]對印楝樹中分離出的85株放線菌進行殺蟲活性篩選，結(jié)果顯示有8株放線菌粗提物對桃蚜的殺蟲活性最高(60%以上)，其中放線菌Streptomycessp. G30發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對桃蚜的毒力最強，48 h的LC50和LC95值分別為1.68 mg/mL和4.37 mg/mL。Ezra[61]從附生藤本植物Monsterasp.的內(nèi)生放線菌Streptomycessp. (MSU-2110)中分離出一種新型多肽類化合物Coronamycins，該化合物對瘧原蟲具有較強抑制活性，IC50值為9.0 ng/mL。從藥用植物內(nèi)生放線菌中發(fā)現(xiàn)具有顯著活性的農(nóng)藥天然產(chǎn)物，將為害蟲防治的發(fā)展開辟新的途徑。

2.4 抗氧化活性的次級代謝物

預防衰老的重要途徑之一是抗氧化，若能消除過多的氧化自由基對于預防因自身自由基引起的老化相關(guān)疾病意義重大[62]，因此，以植物內(nèi)生放線菌為資源進行抗氧化活性研究正備受關(guān)注。Singh等[63]從植物曼陀羅中分離出一種新的內(nèi)生放線菌StreptomycescalifornicusADR1，其次級代謝產(chǎn)物具有良好的抗氧化性能，對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的抑制濃度(IC90)值為(217.24±6.77) μg/mL。凱迪亞·阿亞提等[64]從地錦草中分離出的13株內(nèi)生放線菌中有3株菌的發(fā)酵液乙酸乙酯提取物顯示出抗氧化活性，其中內(nèi)生放線菌MicrobacteriumoleivoransL57發(fā)酵液提取物在0.2 mg/mL時，對DPPH自由基清除率超過50%，內(nèi)生放線菌G4和G26的發(fā)酵液提取物對羥基自由基清除率超過50%。Wang等[65]對虎杖及其內(nèi)生鏈霉菌A0916提取物的抗氧化活性進行比較，當陽性藥抗壞血酸在128 μg/mL、DPPH抑制率為93.8%時，鏈霉菌A0916提取物和虎杖提取物抑制率分別為93.2%和92.7%。結(jié)果表明，鏈霉菌A0916提取物和虎杖提取物均具有較強的抗氧化活性。

2.5 其他生物活性

除抗菌、抗腫瘤、抗蟲和抗氧化活性外，植物內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物的其他生物活性研究也在逐漸增加[66]。Kuncharoen等[67]從芭蕉根部分離出1株內(nèi)生放線菌Micromonosporamusaesp. nov.，該放線菌能生產(chǎn)維生素——甲基萘醌。劉敏等[68]從海漆葉部分離出1株具有抗H1N1病毒的內(nèi)生放線菌T.tyrosinosolvem，其稀釋20倍的發(fā)酵液對H1N1抑制率為76.5%，與陽性對照利巴韋林(50 μg/mL)80%的抑制率相比，顯示出較強的抗病毒活性。Merzaeva等[69]從冬小麥中分離出能產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)的內(nèi)生放線菌Streptomycessp.，可促進冬小麥的生長發(fā)育。Goudjal等[70]從5種植物中分離到27株內(nèi)生放線菌并進行體外產(chǎn)IAA能力的篩選，有18株菌株能產(chǎn)生IAA，其中鏈霉菌PT2的IAA產(chǎn)量最高，對促進番茄種子萌發(fā)和根系伸長方面表現(xiàn)出顯著效果。Hassan等[71]從植物酢漿草(Oxaliscorniculata)的葉子中分離出的兩種內(nèi)生放線菌Streptomycessp. Oc-5和Acv-11具有介導納米氧化銅顆粒合成的作用。內(nèi)生放線菌作為尋找天然活性代謝產(chǎn)物的重要資源正在變得越來越引人注目。

表2 植物內(nèi)生放線菌活性代謝產(chǎn)物研究

續(xù)表2

3 植物內(nèi)生放線菌的應用與展望

植物內(nèi)生放線菌具有豐富的生物多樣性和代謝產(chǎn)物生物活性，在抗菌、抗腫瘤、抗蟲和抗氧化等方面顯示出極具潛力的開發(fā)前景，正在成為發(fā)現(xiàn)新穎先導化合物的重要資源，將為醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領域開發(fā)新型活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供重要保障。植物內(nèi)生放線菌資源豐富，從植物內(nèi)生放線菌次生代謝產(chǎn)物中篩選有效的活性物質(zhì)或新型化合物，將在很大程度上豐富人類醫(yī)藥寶庫，解決自然資源不足等問題，尤其對某些珍貴或瀕危植物內(nèi)生放線菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用來代替宿主植物本身，能有效解決相關(guān)植物資源緊缺和培養(yǎng)條件苛刻等難題，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。隨著人們對內(nèi)生放線菌及其次級代謝產(chǎn)物活性物質(zhì)研究的不斷深入，相信會有更多、活性更強的化學成分被發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物活性成分的研究無疑將具有廣闊的應用前景。

現(xiàn)階段對植物內(nèi)生放線菌的研究程度遠不如內(nèi)生真菌與內(nèi)生細菌。目前，植物內(nèi)生放線菌的分離培養(yǎng)是其研究最大的瓶頸，由于宿主植物與其內(nèi)生放線菌之間的協(xié)同生長關(guān)系復雜，研究人員很難在內(nèi)生放線菌培養(yǎng)過程中模擬。而且人工培養(yǎng)過程中難免存在丟失內(nèi)生放線菌所需要的生長因子，因此脫離宿主植物，很難在體外培養(yǎng)出內(nèi)生放線菌，或者培養(yǎng)出的是退化或變異后的內(nèi)生放線菌[25]。盡管有科研人員通過模擬微生物的生長環(huán)境設計出培養(yǎng)裝置IChips[74]，有望用于解決植物內(nèi)生放線菌的培養(yǎng)困難問題，但是植物內(nèi)生放線菌的研究仍存在諸多問題亟需解決。植物內(nèi)生放線菌作為一種重要的微生物資源，對其開發(fā)利用仍然任重而道遠。