抗生素治療對胚胎反復(fù)著床失敗合并子宮內(nèi)膜炎患者妊娠結(jié)局的影響

李潔，肖卓妮，李雪瑤，丁錦麗，趙璟，管楓，楊亦青，楊菁*

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430000；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科，武漢 430000)

近年來，隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技術(shù)的發(fā)展，輔助生殖技術(shù)臨床妊娠率有了較大的提高，胚胎能否著床成功是妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中有15%～20%左右的患者出現(xiàn)反復(fù)著床失敗(recurrent implantation failure，RIF)，他們承受著生理、心理及經(jīng)濟(jì)的巨大負(fù)擔(dān)。RIF病因涉及到卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量、植入胚胎數(shù)量、子宮內(nèi)膜容受性，以及母胎界面免疫因素等方面，如何提高RIF患者胚胎著床率為臨床亟需解決的熱點問題，近年來有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎在RIF患者中發(fā)生率較高并逐漸引起關(guān)注。

慢性內(nèi)膜炎(Chronic endometritis，CE)是子宮內(nèi)膜間質(zhì)內(nèi)異常漿細(xì)胞滲出導(dǎo)致的局部的持續(xù)炎性疾病，患者通常無明顯臨床癥狀或者僅伴有輕微下腹不適、白帶增多，盆腔隱痛或痛經(jīng)等。雖然CE臨床無明顯癥狀，但嚴(yán)重影響了女性生殖健康。有研究報道在不孕患者中CE發(fā)生率為 2.8%～56.8%[1-2]，在RIF患者中的發(fā)生率則達(dá)到14%～30.3%[3-4]，這些研究結(jié)果提示CE與妊娠結(jié)局密切相關(guān)。本研究主要觀察CD138標(biāo)記漿細(xì)胞在RIF患者子宮內(nèi)膜中浸潤的情況，對合并CE的RIF患者進(jìn)行抗生素治療后再次評估漿細(xì)胞表達(dá)，并評估行凍融胚胎移植(FET)患者的妊娠結(jié)局，旨在探討抗生素治療對RIF合并CE患者行FET后妊娠結(jié)局的影響。

資料和方法

一、研究對象

選取2018年1月至2019年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖中心行IVF/ICSI-ET助孕的RIF患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)40歲以下，至少經(jīng)歷2次新鮮或FET周期，且累計移植≥4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎仍未獲臨床妊娠[5]；(2)夫婦雙方染色體核型均正常，(3)女方彩超提示子宮形態(tài)及內(nèi)膜厚度正常，無內(nèi)分泌疾病，無血液高凝傾向。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)子宮解剖結(jié)構(gòu)異常；(2)患有自身免疫性疾病；(3)患者BMI>29 kg/m2或<18 kg/m2。

本研究已經(jīng)通過了我院倫理委員會的倫理審查，納入患者均簽署了知情同意書。

二、研究方法

1.子宮內(nèi)膜標(biāo)本收集：所有患者在黃體中期經(jīng)陰道B超確定子宮內(nèi)膜為分泌期形態(tài)，使用一次性子宮內(nèi)膜取樣器(江蘇嘉鼎誠醫(yī)療器械)收集少量子宮腔內(nèi)膜組織，經(jīng)鹽酸緩沖液(PBS)漂洗，于10%中性甲醛固定后行蘇木精伊紅(HE)染色、常規(guī)組織病理學(xué)檢查及CD138免疫組化檢查。

2.CE診斷：根據(jù)CD138免疫組化染色結(jié)果判定，以高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)≥5個CD138+標(biāo)記的漿細(xì)胞為陽性[6]，計數(shù)30個高倍鏡視野。若陽性視野數(shù)≥3個為強陽性，陽性視野數(shù)1～2個為弱陽，鏡下僅見到1～4個CD138+標(biāo)記的漿細(xì)胞或未見到漿細(xì)胞浸潤，為非CE組，即對照組。

3.CE治療：對于CE陽性患者給予口服鹽酸多西環(huán)素(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè))100 mg 2次/日 ×14 d 和甲硝唑(金日制藥)500 mg 3次/日×14 d，療程結(jié)束后再次在黃體中期取內(nèi)膜行CD138免疫組化檢測判斷治療效果。

4.分組：根據(jù)抗生素治療后患者CE轉(zhuǎn)歸情況分為CE持續(xù)陽性組(n=5)、CE弱陽組(n=27)、CE轉(zhuǎn)陰組(n=82)及非CE組(n=217)組，除持續(xù)強陽性組外，其余3組進(jìn)行胚胎移植。

5.胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備：(1)GnRH-a 降調(diào)節(jié)+激素替代周期：月經(jīng)第2～3 天肌肉注射 GnRH-a醋酸亮丙瑞林微球注射液(抑那通，武田，日本)3.75 mg，28 d后給予戊酸雌二醇片(補佳樂，拜耳，德國)，4～6 mg/d，根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整用藥劑量及用藥時間，內(nèi)膜厚度在 7 mm 及以上后給予患者肌肉注射黃體酮油劑40 mg/d(浙江仙琚)轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，第 4天或第6天行卵裂期胚胎移植或囊胚移植。

6.胚胎移植及黃體支持：按照玻璃化解凍常規(guī)對胚胎進(jìn)行解凍、復(fù)蘇。卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎為：卵裂球數(shù)量為 7～12 個，細(xì)胞大小符合發(fā)育階段，碎片<10%，無多核化現(xiàn)象；優(yōu)質(zhì)囊胚評分在3BB 以上[7]。常規(guī)在 B 超引導(dǎo)下行優(yōu)質(zhì)胚胎移植，卵裂期每次移植不超過2枚胚胎，囊胚建議單囊胚移植。移植后每天給予黃體酮油劑40 mg/d肌肉注射及口服地屈孕酮片(達(dá)芙通，雅培，荷蘭)10 mg，2次/日，進(jìn)行黃體支持至孕10周左右。

7.妊娠判斷：卵裂期胚胎移植12 d或囊胚移植10 d后查血HCG，HCG≥10 U/L為HCG陽性，移植30 d后經(jīng)陰道超聲檢查見孕囊為臨床妊娠，陰道超聲檢查發(fā)現(xiàn)異位妊娠或患者HCG升高但宮內(nèi)未見孕囊為異位妊娠，孕28周之前的胚胎丟失記為流產(chǎn)。

8.觀察指標(biāo)：(1)患者一般情況包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、竇卵泡計數(shù)(AFC)、抗苗勒管激素(AMH)、不孕年限、不孕類型、既往移植周期數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、移植胚胎個數(shù)；(2)移植周期妊娠結(jié)局包括HCG陽性率、臨床妊娠率、著床率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率。HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/凍融周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/凍融周期數(shù)×100%；著床率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=胚胎丟失周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩數(shù)/凍融胚胎移植周期數(shù)×100%

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、RIF患者中CE的檢出及治療情況

在2018年1月至2019年12月期間，我們共納入觀察 331 例RIF患者，經(jīng)CD138免疫組化染色進(jìn)行CE確診，發(fā)現(xiàn)114例患者合并CE，檢出率為34.44%(114/331)，其中CE呈強陽性患者占 25.98%(86/331)，CE呈弱陽性患者占8.46%(28/331)；CE陰性者共217例，占65.56%(217/331)。

114例CE陽性患者經(jīng)抗生素治療后再次在黃體期取子宮內(nèi)膜行CD138免疫組化檢測結(jié)果顯示5例患者持續(xù)強陽性，27例患者為弱陽性，82例患者轉(zhuǎn)為陰性。其中86例RIF合并CE強陽性患者有59例轉(zhuǎn)為CE陰性，占 68.60%(59/86)；有22例患者CE轉(zhuǎn)為弱陽性，占25.58 %(22/86)；CE持續(xù)強陽患者為5例，占5.81%(5/86)。28例RIF合并CE弱陽性患者經(jīng)抗生素治療后有23例轉(zhuǎn)為CE陰性，占 82.14%(23/28)；有5例患者持續(xù)呈弱陽性，占17.86%(5/28)。根據(jù)治療及檢查情況將除持續(xù)強陽性外的患者分為3組，詳細(xì)分組流程見圖1。

圖1 RIF患者分組流程

二、3組患者的臨床基本資料

分析3組患者基礎(chǔ)資料顯示，3組患者的年齡、BMI、AFC、AMH、不孕類型、既往移植周期數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者基本資料比較[M(P25，P75)，n(%)]

三、3組患者胚胎移植情況及妊娠結(jié)局

統(tǒng)計結(jié)果顯示，3組患者行FET的周期移植胚胎個數(shù)及移植日內(nèi)膜厚度均無顯著性差異(P>0.05)；妊娠結(jié)局比較中，與CE弱陽組比較，CE轉(zhuǎn)陰組的HCG陽性率、臨床妊娠率、著床率及活產(chǎn)率均顯著升高(P<0.01)，非CE組的HCG陽性率及著床率均顯著升高(P<0.05)；非CE組臨床妊娠率及活產(chǎn)率高于CE弱陽組，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CE轉(zhuǎn)陰組與非CE組相比，HCG陽性率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均顯著升高(P<0.05)，而臨床著床率和活產(chǎn)率無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 三組患者凍胚移植臨床妊娠結(jié)局比較[M(P25，P75)，%]

討 論

RIF一直是輔助生殖臨床工作的熱點問題，近年來臨床上為改善原因不明RIF的妊娠結(jié)局，而逐步完善的治療策略有個體化促排方案、實驗室質(zhì)量控制、移植方法的改進(jìn)、以及免疫調(diào)節(jié)藥物的使用[8]、宮腔內(nèi)注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)[9]、自體外周血單核細(xì)胞(autologous peripheral blood mononuclear cells，PBMC)[10]或淋巴細(xì)胞主動免疫治療、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)灌注[11-12]、子宮內(nèi)膜容受性芯片檢測[13]等等，但仍然有患者面臨反復(fù)著床失敗的困擾。最近有報道顯示CE通過改變子宮內(nèi)膜容受性影響胚胎著床，研究者認(rèn)為女性子宮內(nèi)膜間質(zhì)本身存在一定量的漿細(xì)胞，但異常表達(dá)的漿細(xì)胞可能導(dǎo)致CE，從而影響胚胎植入，其機(jī)制可能為微生物感染宮腔釋放致病原，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞異常表達(dá)趨化因子和粘附因子，擾亂子宮內(nèi)膜微環(huán)境。且外周血B細(xì)胞進(jìn)入子宮內(nèi)膜基質(zhì)，一部分B細(xì)胞在基質(zhì)內(nèi)分化為漿細(xì)胞，另一部分B細(xì)胞遷移進(jìn)入子宮內(nèi)膜上皮和腺腔中，使子宮內(nèi)膜窗口期發(fā)育延遲且子宮內(nèi)膜容受態(tài)性相關(guān)基因及因子表達(dá)下降，降低子宮內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎著床失敗[14]。此外有多項研究報道CE與IVE-ET妊娠結(jié)局密切相關(guān)[3，15-16]。

目前CE的診斷方法主要包括宮腔鏡檢查[17]、病理學(xué)HE染色結(jié)合CD138免疫組化法[18]、病原學(xué)培養(yǎng)[19]或測序[20]。CE在宮腔鏡下表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫、散在的直徑小于1 mm的微小息肉、不規(guī)則的子宮內(nèi)膜增厚以及伴發(fā)局部點狀或彌漫性子宮內(nèi)膜充血。病理檢查可發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)中存在異常漿細(xì)胞，但常規(guī)的HE染色是根據(jù)形態(tài)學(xué)尋找漿細(xì)胞，容易漏掉圓形漿細(xì)胞和紡錘形漿細(xì)胞，并且存在一定程度的主觀判斷偏差，影響CE的診斷。跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖配體蛋白聚糖1即CD138是漿細(xì)胞特異性標(biāo)志物之一，有效彌補HE染色形態(tài)學(xué)檢查的不足，可將子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細(xì)胞的檢出率由6%上升至52%[21]。子宮內(nèi)膜病原學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)主要致病菌為鏈球菌屬、大腸桿菌屬、糞腸桿菌屬，其次為支原體[14]。這些檢查方法為CE診斷提供了有益幫助，尤其CD138免疫組化法具有較高的靈敏度且便于開展，已廣泛應(yīng)用于臨床上。

目前國內(nèi)外對于應(yīng)用CD138免疫組化的方法診斷CE的標(biāo)準(zhǔn)尚未完全統(tǒng)一，Bouet等[3]認(rèn)為每10個高倍鏡下子宮內(nèi)膜間質(zhì)中存在至少5個漿細(xì)胞可診斷為CE，其在RIF中檢出率為14%，Cicinelli等[19]認(rèn)為只要每張切片上有一個漿細(xì)胞出現(xiàn)，就可診斷為CE，其檢出率為56.8%，Kitaya等[14]發(fā)現(xiàn)在278例具有正常生育功能的女性中，48.6%的女性子宮內(nèi)膜間質(zhì)中也存在一個以上的漿細(xì)胞，但多小于5個，而327例RIF中58.4%的患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)中有漿細(xì)胞的存在，其中大于5個的有35.5%，提出需計算子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細(xì)胞密度大于等于0.25 情況下，可診斷CE，其發(fā)生率為34%。因此，以鏡下見到CD138陽性漿細(xì)胞數(shù)還是子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細(xì)胞密度作為CE診斷標(biāo)準(zhǔn)，暫無共識，并且，內(nèi)膜間質(zhì)中CD138陽性的漿細(xì)胞有多少個需要進(jìn)行治療，目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究參考Zargar等[6]研究方法，以高倍鏡視野下發(fā)現(xiàn)≥5個CD138+標(biāo)記的漿細(xì)胞為陽性，且計數(shù)30個高倍鏡視野，≥5個CD138+標(biāo)記的漿細(xì)胞視野數(shù)≥3個為強陽性，≥5個CD138+標(biāo)記的漿細(xì)胞視野數(shù)1～2個為弱陽性，鏡下僅見到1～4個CD138標(biāo)記的漿細(xì)胞或未見到漿細(xì)胞浸潤，為陰性及非CE。本文CE強陽性、弱陽性及非CE，其在RIF中發(fā)生率分別為25.98%，8.46%，65.56%。

CE主要是因為宮腔內(nèi)微生物感染所引起，臨床上主要根據(jù)宮腔內(nèi)細(xì)菌培養(yǎng)或微生物檢測結(jié)果來進(jìn)行針對性治療，控制原發(fā)感染。然而，由于宮腔液體及子宮內(nèi)膜細(xì)菌培養(yǎng)或微生物檢測存在較大的局限性，目前臨床對于RIF合并CE多采用經(jīng)驗性抗生素治療。多西環(huán)素抗菌譜廣泛，對支原體、革蘭氏陽性球菌和陰性桿菌均有效，多項研究認(rèn)為多西環(huán)素是治療CE的一線藥物，已被用于臨床，并取得較好療效推薦使用[4，22-23]。因此，本研究采用多西環(huán)素及針對厭氧菌的甲硝唑聯(lián)用治療CE，療程結(jié)束后再次行黃體期子宮內(nèi)膜CD138免疫組化檢測結(jié)果顯示5例患者持續(xù)強陽性，27例患者轉(zhuǎn)為弱陽，82例患者轉(zhuǎn)陰，轉(zhuǎn)陰率為71.93%(82/114)。5例持續(xù)強陽性患者未行胚胎移植，27例弱陽患者、82例CE轉(zhuǎn)陰患者、以及217例非CE患者再次行凍融胚胎移植的臨床結(jié)局分析顯示，經(jīng)過治療后CE轉(zhuǎn)陰組HCG臨床妊娠率及活產(chǎn)率得到明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但CE轉(zhuǎn)陰組早期流產(chǎn)率較高，因此對于RIF仍需考慮胚胎因素，可行胚胎移植前遺傳學(xué)檢測。

綜上，CE是導(dǎo)致RIF的重要因素，建議完善相關(guān)檢查，病理學(xué)檢查結(jié)合CD138免疫檢測可提高檢出率。同時本研究發(fā)現(xiàn)，CE陽性患者給予抗生素治療后轉(zhuǎn)陰可改善RIF患者臨床妊娠結(jié)局，倡議多中心大樣本研究CE鏡下診斷標(biāo)準(zhǔn)的確立，避免遺漏或過度治療。對于持續(xù)陽性者可考慮行子宮內(nèi)膜菌群培養(yǎng)或DNA測序技術(shù)，以查明感染的病原微生物類別，有助于臨床抗生素的精準(zhǔn)使用。