復(fù)方甘草酸苷片治療肝硬化患者的臨床研究

王 劍，熊曉毅，雷 娜，高會(huì)軍

(1. 渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 渭南 714026；2. 咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712000；3. 解放軍第988醫(yī)院焦作院區(qū)， 河南 焦作 454150)

中國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)，各種慢性肝病嚴(yán)重危害患者的健康和生命。肝纖維化是繼發(fā)于各種形式慢性肝損傷之后組織修復(fù)過(guò)程中的代償反應(yīng)，也是慢性肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過(guò)程。肝纖維化的實(shí)質(zhì)是各種原因?qū)е碌母涡菭罴?xì)胞活化，引起肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成大于降解，導(dǎo)致大量ECM過(guò)度沉積[1-2]。生物體內(nèi)的能量代謝將氧氣作為有氧代謝過(guò)程中的電子接受體，不可避免地產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，其與某些生理活性物質(zhì)的調(diào)控和炎癥反應(yīng)過(guò)程密切相關(guān)，但過(guò)量的ROS容易導(dǎo)致氧化應(yīng)激。研究表明，肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌、酒精肝等肝病的發(fā)生發(fā)展與自由基損傷密切相關(guān)[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為減少膠原纖維的生成和增強(qiáng)其降解, 肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的。肝星狀細(xì)胞激活轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞,并大量分泌 ECM是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心病理環(huán)節(jié)[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是引起肝纖維化的主要原因，氧化應(yīng)激引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化是肝星狀細(xì)胞活化、增殖及ECM合成的重要原因，所以氧化應(yīng)激可能是肝病的共同發(fā)病機(jī)制，而炎性反應(yīng)可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞的壞死，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[5]。復(fù)方甘草酸苷片對(duì)于肝病的防治具有積極作用，其主要組分為甘草酸苷、甘氨酸和鹽酸半胱氨酸。其中甘草酸苷是中藥甘草中提取的一個(gè)活性成分，具有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，恢復(fù)肝細(xì)胞功能，防止脂肪性變等作用，對(duì)于肝病具有很好的防治作用[6]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于復(fù)方甘草酸苷片治療肝硬化患者的臨床研究報(bào)道較少，所以本研究擬采取復(fù)方甘草酸苷片聯(lián)合常規(guī)用藥治療肝硬化，并以常規(guī)治療作為對(duì)照，觀察復(fù)方甘草酸苷片治療肝硬化的臨床療效，并探討其抗炎、抗氧化作用，旨在為肝硬化的治療提供新的思路，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)》[7]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：具有肝硬化臨床表現(xiàn)以及典型血清生物化學(xué)指標(biāo)變化；改良肝硬化 Child-Pugh分級(jí)為A～C級(jí)；影像學(xué)檢查具有門(mén)靜脈高壓征證據(jù)；肝組織學(xué)表現(xiàn)為假小葉形成以及彌漫性纖維化，經(jīng)胃鏡檢查、B超或CT檢查、病理檢查確診。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) 符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡18～65歲，性別不限；自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) 合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病者；合并嚴(yán)重心、腦、腎、肝、膽疾病者；對(duì)本研究所使用的藥物過(guò)敏者；2周內(nèi)服用抗炎類(lèi)藥物者；妊娠、哺乳期女性；3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其他肝硬化臨床研究者。

1.4脫落標(biāo)準(zhǔn) 依從性較差，不配合研究者；研究過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重出血或其他嚴(yán)重并發(fā)癥者；自愿退出研究者。

1.5一般資料 根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，入選2016年4月—2018年11月到解放軍第988醫(yī)院焦作院區(qū)消化科就診的肝硬化患者40例。將患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：觀察組20例，男12例，女8例；年齡18～65(42.1±4.9)歲；體質(zhì)指數(shù)(BMI)(24.12±2.37)kg/m2；病程1～5(2.78±0.54)年；改良肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)5例，B級(jí)7例，C級(jí)8例。對(duì)照組20例，男13例，女7例；年齡18～65(41.2±5.6)歲；BMI(24.62±3.16)kg/m2；病程1～6(2.47±0.76)年；改良肝功能Child-Pugh分級(jí)：A級(jí)3例，B級(jí)10例，C級(jí)7例。2組性別、年齡、BMI、病程和改良肝功能Child-Pugh分級(jí)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(SP20160156)。

1.6治療方法 對(duì)照組給予常規(guī)消化科基礎(chǔ)治療。采用還原型谷胱甘肽(山東綠葉制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20030001)進(jìn)行基礎(chǔ)保肝治療，并適時(shí)采用降酶、退黃等藥物進(jìn)行對(duì)癥治療；根據(jù)不同類(lèi)型的肝硬化，給予抗病毒、戒酒、干擾素、免疫抑制劑、外科介入等針對(duì)原發(fā)病的對(duì)因治療；同時(shí)囑患者適當(dāng)減少勞動(dòng)，注意勞逸結(jié)合，并適當(dāng)調(diào)整飲食習(xí)慣，例如有腹水者應(yīng)低鹽飲食，黃疸患者應(yīng)避免油膩，以減少肝臟負(fù)擔(dān)，最大限度控制存在的可控病因。觀察組在對(duì)照組干預(yù)基礎(chǔ)上給予復(fù)方甘草酸苷片(美能，日本秋山片劑株式會(huì)社，進(jìn)口藥品注冊(cè)批號(hào)：H20171325)飯后口服，3片/次，3次/d，3個(gè)月為1個(gè)療程，治療2個(gè)療程(6個(gè)月)。

1.7觀察指標(biāo)

1.7.1肝功能指標(biāo) 分別于治療前后采用全自動(dòng)生化分析儀(ECHOLCD，意大利樂(lè)高特公司)檢測(cè)2組患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBil)水平。

1.7.2改良肝功能Child-Pugh分級(jí) 分別于治療前后根據(jù)患者的一般狀況、腹水情況、血清膽紅素水平、血清白蛋白水平及凝血酶原時(shí)間進(jìn)行記分，不同狀態(tài)分別記為1分、2分和3分，并將5個(gè)指標(biāo)計(jì)分進(jìn)行相加，總分范圍為5～15分，根據(jù)總分將肝臟儲(chǔ)備功能分為A、B、C 3個(gè)等級(jí)，等級(jí)越高，預(yù)示著肝臟儲(chǔ)備功能越差，病情越嚴(yán)重。

1.7.3肝纖維化指標(biāo) 分別于治療前后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)2組患者血清中透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽(PⅢNP)和Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平。

1.7.4氧化應(yīng)激指標(biāo) 分別于治療前后，采用TBA法檢測(cè)血清中丙二醛(MDA)水平(試劑盒為BC0020，北京索萊寶科技有限公司)，采用NBT/MTS2PMS比色法檢測(cè)黃嘌呤氧化酶(XO)活性(試劑盒為JL14770-48T，上海江萊生物科技有限公司)，全部操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

1.7.5炎性指標(biāo) 分別于治療前后采集患者晨起空腹外周靜脈血4 mL，運(yùn)用離心機(jī)(KA-1000，上海安亭科學(xué)儀器廠)將樣本進(jìn)行離心，離心后取上層血清置于潔凈的EP管中，并放于- 20 ℃冰箱保存待檢。通過(guò)自動(dòng)免疫分析儀(IMMAGE，美國(guó)BECKMAN COULTER)，采用ELISA法檢測(cè)2組患者血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)(試劑盒為FK-FV0049，上海樊克生物科技有限公司)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)(試劑盒為GOY-E6388，上海谷研科技有限公司)水平，全部操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。

2 結(jié) 果

2.12組患者肝功能指標(biāo)水平比較 與治療前比較，治療后2組患者血清ALT、AST和TBil水平均明顯降低(P均<0.05)；與對(duì)照組比較，治療后觀察組血清ALT、AST和TBil水平更低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組肝硬化患者治療前后肝功能指標(biāo)比較

2.22組患者改良肝功能Child-Pugh分級(jí)比較與治療前比較，治療后2組患者改良肝功能Child-Pugh分級(jí)均明顯改善(P均<0.05)，且治療后觀察組改善更明顯(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組肝硬化患者治療前后改良肝功能Child-Pugh分級(jí)比較 例(%)

2.32組患者血清肝纖維化指標(biāo)水平比較 與治療前比較，治療后2組患者血清HA、LN、PCⅢNP、Ⅵ-C水平均明顯下降(P均<0.05)；與對(duì)照組比較，治療后觀察組血清HA、LN、PCⅢNP、Ⅵ-C水平更低(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組肝硬化患者治療前后血清肝纖維化指標(biāo)水平比較

2.42組患者血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 與治療前比較，治療后2組患者血清MDA水平和XO活性均明顯下降(P均<0.05)；與對(duì)照組比較，治療后觀察組血清MDA水平和XO活性更低(P均<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 2組肝硬化患者治療前后血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.52組患者血清炎性指標(biāo)水平比較 與治療前比較，治療后2組患者血清IL-6和IL-8水平均明顯下降(P均<0.05)；與對(duì)照組比較，治療后觀察組血清IL-6和IL-8水平更低(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 2組肝硬化患者治療前后血清炎性指標(biāo)水平比較

3 討 論

肝硬化被認(rèn)為是多種慢性肝病的終末期階段，預(yù)后差，病死率高[8]。肝纖維化是多種肝病發(fā)展為肝硬化必經(jīng)的病理過(guò)程，隨著疾病的進(jìn)展，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積和纖維化瘢痕反復(fù)發(fā)生最終導(dǎo)致肝硬化，所以控制肝纖維化是目前延緩肝硬化進(jìn)展急需解決的難題[9]。

在引起肝硬化的眾多原因中，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)起關(guān)鍵作用[10]。首先，在氧代謝過(guò)程中，氧化應(yīng)激增強(qiáng)引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化使ROS產(chǎn)生增多，導(dǎo)致ROS 氧化生物膜，即 ROS與膜磷脂的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，造成多種脂質(zhì)過(guò)氧化物形成過(guò)多，尤其是氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和XO。MDA水平升高提示機(jī)體氧化功能增強(qiáng)，自由基清除率下降，由此導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥、壞死,加重肝臟的病變。同時(shí)，大量的XO由于肝細(xì)胞受損導(dǎo)致的不同程度微循環(huán)障礙而大量生成,造成超氧化物含量增加，從而加重肝損傷，所以動(dòng)態(tài)觀察MDA水平和XO活性，對(duì)于監(jiān)測(cè)肝硬化患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平具有重要意義[11]。其次，炎性反應(yīng)在肝纖維化的啟動(dòng)和促進(jìn)過(guò)程中也起著重要作用。肝臟發(fā)生組織實(shí)性病變的同時(shí)伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并產(chǎn)生大量的促炎因子，其中最重要的是IL-6和IL-8。它們一方面通過(guò)趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等釋放其他促炎因子，介導(dǎo)局部和全身的炎癥反應(yīng)；另一方面又通過(guò)激活Kupffer細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，共同參與激活肝臟星形細(xì)胞，在清除壞死肝細(xì)胞的同時(shí)，刺激細(xì)胞外間質(zhì)合成分泌增加，加重肝細(xì)胞損傷[12]。最后，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)在肝纖維化形成過(guò)程中可以相互影響，共同誘導(dǎo)并加重肝纖維化的惡性循環(huán)。一方面，ROS等可以通過(guò)激發(fā)細(xì)胞內(nèi)NF-κB等級(jí)聯(lián)信號(hào)的傳導(dǎo)來(lái)增強(qiáng)IL-6和IL-8等促炎因子的表達(dá)，加重炎性損傷；另一方面，活化的炎性細(xì)胞又可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的ROS，導(dǎo)致更高水平的氧化應(yīng)激，兩者共同激活肝星狀細(xì)胞產(chǎn)生膠原纖維和促纖維化細(xì)胞因子，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生，加快肝硬化形成的進(jìn)程[13]。

復(fù)方甘草酸苷片對(duì)于各種肝病的防治均具有積極的作用。多項(xiàng)臨床研究表明，復(fù)方甘草酸苷片可顯著減輕患者炎性反應(yīng)，改善肝功能，降低肝纖維化指標(biāo)水平[14-15]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)方甘草酸苷片可以通過(guò)抑制NF-κB促炎信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和下游炎性分子的表達(dá)抑制肝損傷，發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用[16]。復(fù)方甘草酸苷的主要組分為甘草酸苷、甘氨酸和鹽酸半胱氨酸。有研究發(fā)現(xiàn)甘草酸苷一方面通過(guò)抑制IL-6和IL-8的表達(dá)，顯著增加肝細(xì)胞的活性，另一方面，又通過(guò)促進(jìn)超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽表達(dá)以及抑制MDA合成，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[17]。甘氨酸是內(nèi)源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，具有抗氧化性，其可抑制肝細(xì)胞表面CD14受體的表達(dá)，減輕實(shí)驗(yàn)大鼠的肝纖維化程度[18]；甘氨酸還可以通過(guò)減輕線粒體腫脹和改善線粒體膜電位，抑制活性氧ROS生成，減少ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的肝損傷[19]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合復(fù)方甘草酸苷片治療后，患者血清中MDA、XO、IL-6和IL-8水平明顯低于治療前及對(duì)照組，這與先前的研究結(jié)果相一致[20]，提示復(fù)方甘草酸苷片具有抗氧化和抗炎作用。

ALT、AST、TBil是最常用來(lái)反映肝細(xì)胞損傷的血清學(xué)指標(biāo)，它們存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞膜受損或者細(xì)胞壞死時(shí)進(jìn)入血中。其中ALT、AST是反映肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性最敏感的指標(biāo),且ALT、AST水平越高代表肝細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。肝硬化時(shí)肝細(xì)胞排泄功能降低，膽紅素排出障礙，使得血中膽紅素升高，TBil升高預(yù)示著肝細(xì)胞進(jìn)行性壞死并且預(yù)后不良[21]。因此，通過(guò)測(cè)定血清或血漿中酶的活性可以反映肝細(xì)胞受損情況及損傷程度。對(duì)于肝臟儲(chǔ)備功能的評(píng)價(jià)，目前最廣泛應(yīng)用的是改良肝功能Child-Pugh分級(jí)法，Child-Pugh 分級(jí)越高表示患者病情越嚴(yán)重，而且血清ALT、AST、TBil水平隨著肝功能Child-Pugh分級(jí)的增高而逐漸上升[22]。肝纖四項(xiàng)是反映肝纖維化程度的敏感指標(biāo)[23]。測(cè)定上述指標(biāo)對(duì)估測(cè)肝硬化的嚴(yán)重程度及預(yù)后有十分重要的臨床價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，加用復(fù)方甘草酸苷片治療可明顯降低血清ALT、AST、TBil及肝纖四項(xiàng)指標(biāo)水平，并且改善肝功能Child-Pugh分級(jí)，提示復(fù)方甘草酸苷片具有改善肝硬化患者的肝功能和肝纖維化程度的作用。

綜上所述，肝硬化患者機(jī)體處于高氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)狀態(tài)，復(fù)方甘草酸苷片可顯著改善肝硬化患者的肝功能和肝纖維化狀況，其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究為小樣本、單中心的臨床研究，有待開(kāi)展大樣本、多中心研究以進(jìn)一步明確復(fù)方甘草酸苷片治療肝硬化的療效和作用機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。