NOX2/4在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用

王波 李萬(wàn)成

作者單位：610500 四川 成都，成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺纖維化(Pulmonary fibrosis, PF)是一種慢性、進(jìn)行性的纖維化性肺部疾病，其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶，也稱NOX家族，是在生物膜上傳遞電子的蛋白質(zhì)，其主要的生物學(xué)功能是生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)[1]。ROS是正常細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，作為第二信使而為人所知，其主要功能是調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)[2]。盡管ROS具有重要的生理功能，但當(dāng)ROS水平超過(guò)機(jī)體抗氧化能力時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致器官功能障礙[1]。正常的肺穩(wěn)態(tài)需要細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外氧化劑和抗氧化劑之間的適當(dāng)平衡，但在異常情況下，如吸煙、石棉纖維、藥物和輻射等，會(huì)刺激人體肺組織產(chǎn)生過(guò)多的ROS，使氧化劑產(chǎn)生和抗氧化防御失衡，從而導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[3]。盡管目前肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，但氧化應(yīng)激已是肺纖維化發(fā)生的一項(xiàng)重要機(jī)制。本文將對(duì)NOX2/4在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行綜述，旨在找到治療肺纖維化的新靶點(diǎn)。

ROS的產(chǎn)生、種類及功能

NOX2/4的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能

NOX包括NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，其中與器官纖維化相關(guān)的主要是NOX2和NOX4。NOX2與NOX4均包含一個(gè)同源COOH末端的黃素蛋白結(jié)構(gòu)域(由一個(gè)NADPH結(jié)合區(qū)域和一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合區(qū)域組成)以及一個(gè)疏水NH2末端結(jié)構(gòu)域(由6個(gè)跨膜側(cè)螺旋結(jié)構(gòu)組成，其中4個(gè)血紅素結(jié)合組氨酸位于第三和第五跨膜結(jié)構(gòu)域)，其主要功能是生成ROS；并且其異構(gòu)體的激活均涉及到與跨膜蛋白p22phox形成異源二聚體[1]。NOX2，也被稱為gp91phox，是由兩個(gè)大小相等但性質(zhì)截然不同的主要域組成的。氨基端部分包括6個(gè)跨膜胞內(nèi)螺旋，并由5個(gè)環(huán)連接，其中有3個(gè)環(huán)是細(xì)胞外環(huán)，有2個(gè)環(huán)是細(xì)胞內(nèi)環(huán)[8]。NOX2與跨膜蛋白p22phox組成非活性異源二聚體。NOX2/p22phox復(fù)合物的激活需要4個(gè)細(xì)胞質(zhì)亞基，即p47phox(組織者)、p67phox、p40phox和Rac1或Rac2的轉(zhuǎn)位酶；NOX2在吞噬細(xì)胞(中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中大量表達(dá)，結(jié)構(gòu)細(xì)胞(間充質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞)中也有少量表達(dá)[1]。NOX4具有組成活性，其結(jié)構(gòu)與NOX2相似[8]；NOX4的578個(gè)氨基酸序列與NOX2(gp91phox)有39%的同源性，在跨膜區(qū)域以及血紅素、FAD和NADPH的結(jié)合位點(diǎn)上具有相對(duì)高度保守的基序,NOX4與膜蛋白p22phox形成異二聚體復(fù)合物，可增強(qiáng)其ROS的生成活性。在肺中，NOX4廣泛表達(dá)于各種類型的細(xì)胞中，包括巨噬細(xì)胞以及結(jié)構(gòu)細(xì)胞(如平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞)[1]。

NOX2/4在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用

一、NOX2/4促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)沉積

肺纖維化的特征是過(guò)量的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積在肺間質(zhì)組織中，而肌成纖維細(xì)胞在ECM沉積中則起關(guān)鍵作用[9]；許多研究已經(jīng)確認(rèn)肌成纖維細(xì)胞是纖維化過(guò)程的建立和進(jìn)展的細(xì)胞，纖維化疾病中的肌成纖維細(xì)胞起源于多種細(xì)胞來(lái)源，包括靜止的成纖維細(xì)胞、循環(huán)的CD34+纖維細(xì)胞，以及各種類型的細(xì)胞(包括上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)，其轉(zhuǎn)換過(guò)程稱為上皮/內(nèi)皮-間充質(zhì)(EMT/EndMT)轉(zhuǎn)變；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)蛋白家族由多種多效生長(zhǎng)因子組成，在胚胎發(fā)生、細(xì)胞發(fā)育和分化、免疫系統(tǒng)發(fā)育、炎癥反應(yīng)功能和創(chuàng)傷修復(fù)等眾多生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由于其強(qiáng)促纖維化作用，這些分子也參與了各種人類纖維性疾病的發(fā)病機(jī)制。TGF-β廣泛參與EMT/EndMT轉(zhuǎn)變，而NOX4在此過(guò)程中則作為一個(gè)重要的下游介質(zhì)，參與激活靜止的成纖維細(xì)胞，或者將不同類型的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為激活的肌成纖維細(xì)胞；此外，TGF-β也可有效地刺激NOX4基因表達(dá)和NOX4蛋白水平[10]；因此，NOX4可通過(guò)TGF-β促進(jìn)EMT/EndMT轉(zhuǎn)變，使多種不同類型的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為激活的肌成纖維細(xì)胞，從而促進(jìn)ECM沉積。目前已有研究表明，可通過(guò)促進(jìn)蛋白酶體降解抑制NOX4，從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞分化和肺纖維化的發(fā)展[11]。此外，NOX4生成的ROS也被證明參與肌成纖維細(xì)胞的激活，而且ROS可能有助于纖維原性分子的激活，如TGF-β1；有研究證據(jù)表明NOX4生成的ROS在成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞分化前的肺纖維化的發(fā)病步驟中發(fā)揮著重要作用[12]。另外，TGF-β可誘導(dǎo)NOX4表達(dá)并依賴于smad信號(hào)，提示TGF-β與NOX4表達(dá)之間可能存在自我放大的回路，并且通過(guò)二甲雙胍激活磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)，可抑制TGF-β誘導(dǎo)的NOX4表達(dá)和ROS的產(chǎn)生，從而抑制肌成纖維細(xì)胞的激活，減輕肺纖維化[13]，表明NOX4促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的激活可能還與AMPK/smad信號(hào)通路有關(guān)。目前也有研究指出，介導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞活化的ROS可來(lái)自肺泡巨噬細(xì)胞，且依賴于NOX2和NOX4；雷公藤中純化的二萜環(huán)氧化合物TPL可通過(guò)下調(diào)放射性纖維化小鼠肺泡巨噬細(xì)胞中NOX2和NOX4的水平，減輕ROS的產(chǎn)生，從而阻斷肌成纖維細(xì)胞的活化及減輕ECM的沉積[14]。由此可見，NOX2/4在參與肌成纖維細(xì)胞的活化及細(xì)胞外基質(zhì)沉積中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

二、NOX2/4促進(jìn)肺上皮細(xì)胞損傷、凋亡

肺上皮細(xì)胞損傷在肺纖維化的早期發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用；并且肺泡上皮的損傷和異常修復(fù)是肺纖維化開始的關(guān)鍵[15]；盡管上皮細(xì)胞在受損時(shí)具有自我修復(fù)功能，但是持續(xù)的上皮細(xì)胞損傷可導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)展。因此，上皮細(xì)胞的損傷、凋亡具有重要意義，它不僅會(huì)造成肺泡-毛細(xì)血管屏障的受損，也會(huì)導(dǎo)致肺組織的異常修復(fù)而引起肺纖維化。NOX4可通過(guò)ROS介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡，并且使用選擇性抑制NOX2/4表達(dá)的化合物fulvene-5可降低TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞凋亡，從而減輕肺纖維化；而在此過(guò)程中NOX4衍生的ROS被證明是TGF-β1誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡的重要下游介質(zhì)。但ROS可能也有上游作用，可通過(guò)促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)和激活，增加肺纖維化中NOX4和TGF-β1之間的正反饋?zhàn)饔肹12]。另外，活化的肌成纖維細(xì)胞也可通過(guò)旁分泌H2O2介導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡；并且其可能通過(guò)氧化介導(dǎo)的機(jī)制，促進(jìn)上皮細(xì)胞的周期性損傷及異常修復(fù)，從而導(dǎo)致器官的進(jìn)行性纖維化[16-17]。此外，NOX4可能也有直接導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用[16]。

三、NOX2參與肺部炎癥反應(yīng)

炎癥對(duì)纖維化的影響是多重的；在感染和損傷后，炎癥細(xì)胞和損傷組織細(xì)胞分泌可溶性介質(zhì)(其中包括TGF-β)，誘發(fā)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步刺激TGF-β的產(chǎn)生和激活，導(dǎo)致持續(xù)的組織修復(fù)或器官纖維化。另外，嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞也會(huì)分泌促炎因子IL-13，而IL-13可刺激成纖維細(xì)胞活化和成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生發(fā)展[18-19]。盡管NOX4在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有不可忽視的作用，但有研究表明NOX4不通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與肺纖維化的發(fā)病機(jī)制[12，20]。目前，NOX2依賴的ROS在促進(jìn)吞噬細(xì)胞的抗菌活性和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著公認(rèn)的作用[1]。NOX2異構(gòu)體廣泛表達(dá)，且穩(wěn)定存在于肺中，炎癥狀態(tài)時(shí)其數(shù)量可明顯增多[21]。在囊性肺纖維化發(fā)病機(jī)制中，NOX2產(chǎn)生的ROS可介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的表達(dá)，參與囊性纖維化患者肺部早期炎癥反應(yīng)[22]。此外，尚有研究結(jié)果表明，結(jié)晶二氧化硅誘導(dǎo)的肺纖維化組織中NOX2的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)灌胃后小鼠矽肺模型中升高的NOX2水平可明顯降低，并且其血漿及肺泡灌洗液中的炎癥介質(zhì)水平也明顯降低，提示NOX2可能在肺部炎癥和纖維化中發(fā)揮重要作用[23]。如上文所述，NOX2需要和調(diào)控亞基p47phox、p67phox的結(jié)合才能形成有功能的NOX2；而從特發(fā)性肺纖維化患者肺泡灌洗液中分離的中性粒細(xì)胞顯示出p47phox和p67phox表達(dá)升高，提示NOX2在特發(fā)性肺纖維化患者的炎癥反應(yīng)中具有某種潛在的作用[24]。

靶向NOX2/4藥在肺纖維化治療中的應(yīng)用前景

盡管吡非尼酮與NAC都具有下調(diào)NOX4表達(dá)的作用[25]，并且我國(guó)在特發(fā)性肺纖維化的治療共識(shí)中推薦吡非尼酮聯(lián)合NAC治療肺纖維化，但吡非尼酮不良反應(yīng)多，且發(fā)生較頻繁[26]；而對(duì)于NAC，其局限性更大且療效不顯著，推測(cè)其主要原因可能有三：一、是NAC雖可降低NOX4表達(dá)，但其對(duì)NOX2的影響則較弱，導(dǎo)致其抗氧化能力弱；二、是NAC可能易使ROS 與抗氧化劑相互作用失衡而導(dǎo)致其抗氧化劑效果不明確[25-27]；三、是NAC雖具有一定的抗氧化潛力，但它是一種比谷胱甘肽和大多數(shù)其他內(nèi)源性抗氧化劑和酶弱得多的抗氧化劑，并且易水解為無(wú)抗氧化能力的胱氨酸，而且在充滿谷胱甘肽的細(xì)胞中，其NAC抗氧化能力就會(huì)失效[28]。因此，吡非尼酮與NAC在治療肺纖維化中，均具有較大的局限性。此外，目前也推薦使用尼達(dá)尼布用于肺纖維化的治療，但其不良反應(yīng)也較常見，而且與吡非尼酮一樣，用于治療重度肺功能障礙的IPF患者，療效仍未可知[26，29]，且這兩種藥物在改善患者生活質(zhì)量和治療肺纖維化方面的能力均有限[30]。因此，目前亟需尋找一種療效確切、不良反應(yīng)少、在體內(nèi)代謝穩(wěn)定抗纖維化藥物。如本文所述，NOX2/4在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了不可忽視的作用，推測(cè)NOX2/4可能是治療肺纖維化的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，因此靶向NOX2/4藥在肺纖維化治療中應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，NOX2/4通過(guò)ROS在促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞活化、ECM沉積、上皮細(xì)胞損傷、凋亡以及肺部炎癥中扮演著重要的角色；因此以NOX2/4為治療靶點(diǎn)，可能是治療肺纖維化的一個(gè)重要突破口。