慢病毒載體介導(dǎo)的miR-342-3p對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移的影響研究

朱亞蕊 時(shí)松和 李雪

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，深入了解其生物學(xué)機(jī)制，開(kāi)發(fā)有針對(duì)性的靶向藥物對(duì)提高晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者的總體生存率具有重要意義[1]。miRNA的異常表達(dá)與NSCLC密切相關(guān)，研究報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者的血清樣本中miR-342-3p表達(dá)顯著下調(diào)，miR-342-3p的低表達(dá)與晚期TNM分期和陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。且miR-342-3p過(guò)表達(dá)，可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[3]。核酪蛋白激酶和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶底物1(nuclear ubiquitous casein and cyclindependent kinase substrate1，NUCKS1)在DNA損傷反應(yīng)和代謝中起重要作用，可以用作多種癌癥的生物標(biāo)志物；并與microRNA相關(guān)[4]。研究報(bào)道m(xù)iR-137可通過(guò)負(fù)調(diào)控NUCKS1抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，遷移，并使肺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇和順鉑敏感[5]。miR-342-3p是否通過(guò)調(diào)控NUCKS1影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移還尚不清楚。因此，本研究旨在探討miR-342-3p是否通過(guò)調(diào)控NUCKS1影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移。

資料與方法

一、一般資料

2017年5月至2020年5月經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌患者30例，其中男21例，女9例，年齡25～78歲，平均59歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放化療。通過(guò)手術(shù)切除其肺癌組織，選取癌旁健康的組織作為對(duì)照。

二、材料

人正常肺上皮細(xì)胞BES2A-2B和肺癌細(xì)胞A549、H1299購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自杭州仟諾生物科技有限公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自北京麥瑞博生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司；MTT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；Transwell小室、Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司；慢病毒載體pLent-CMV-GFP購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司。

三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

人正常肺上皮細(xì)胞BES2A-2B和肺癌細(xì)胞A549、H1299均用RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

合成miR-342-3p特異性過(guò)表達(dá)片段，將其克隆至慢病毒載體pLent-CMV-GFP中，命名為L(zhǎng)V-miR-342-3p；將LV-miR-342-3p和陰性對(duì)照空病毒載體分別轉(zhuǎn)染至A549、H1299細(xì)胞中，記為L(zhǎng)V-miR-342-3p組和LV-NC組；未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的細(xì)胞作為NC組。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)miR-342-3p和NUCKS1的表達(dá)水平

提取癌組織和細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。miR-342-3p和NUCKS1分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，miR-342-3p上游引物序列：5′-TCTCACACAGAAATCGC-3′，下游引物序列：5′-GAGCAGGCTGGAGAA-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；NUCKS1上游引物序列：5′-TGCCCAAACCCAGACTAAAG-3′，下游引物序列：5′-GACCCTTCATCCCCAGATTT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

五、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜；加入二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影，成像后用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

六、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-342-3p和NUCKS1的靶向關(guān)系

構(gòu)建NUCKS1 3′UTR的野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體NUCKS1 3′UTR-WT和NUCKS1 3′UTR-MUT，將其分別與miR-342-3p共轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中；按說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

七、MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

各組細(xì)胞分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h時(shí)，每孔分別加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，加入150 μL DMSO，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

八、Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室上室和下室分別加入200 μL細(xì)胞懸液和600 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定后，再用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在Transwell小室上層加入50 μL基質(zhì)膠Matrigel，凝固后接種細(xì)胞，之后同細(xì)胞遷移操作。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、miR-342-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

與健康組織比較，肺癌組織中miR-342-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)；與人正常肺上皮細(xì)胞BES2A-2B比較，肺癌細(xì)胞A549和H1299中miR-342-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)(見(jiàn)表1，2)。

表1 qRT-PCR檢測(cè)miR-342-3p在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)

表2 qRT-PCR檢測(cè)miR-342-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

二、NUCKS1在非小細(xì)胞肺癌組織和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

與健康組織比較，肺癌組織中NUCKS1表達(dá)水平升高(P<0.05)；與人正常肺上皮細(xì)胞BES2A-2B比較，肺癌細(xì)胞A549和H1299中NUCKS1表達(dá)水平升高(P<0.05)(見(jiàn)表3、4，圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)NUCKS1在非小細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)

表3 qRT-PCR檢測(cè)NUCKS1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)

表4 qRT-PCR檢測(cè)NUCKS1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

三、miR-342-3p與NUCKS1直接相互作用

TargetScan預(yù)測(cè)顯示miR-342-3p與NUCKS1 3′UTR含有互補(bǔ)的核苷酸序列(圖2)。與NC組比較，miR-342-3p組轉(zhuǎn)染NUCKS1 3′UTR-WT載體的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖2 miR-342-3p與NUCKS1的結(jié)合位點(diǎn)

四、miR-342-3p過(guò)表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)其miR-342-3p表達(dá)的影響

與NC組比較，LV-miR-342-3p組A549和H1299細(xì)胞中miR-342-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05)(見(jiàn)表6)。

表6 qRT-PCR檢測(cè)NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)miR-342-3p的表達(dá)水平

五、miR-342-3p負(fù)調(diào)控NUCKS1的表達(dá)，通過(guò)miR-342-3p的過(guò)表達(dá)來(lái)影響NUCKS1介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲

與NC組比較，LV-miR-342-3p組A549和H1299細(xì)胞中NUCKS1的表達(dá)水平降低，細(xì)胞活力降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)(見(jiàn)圖3，表7-10)。

圖3 Western blot檢測(cè)NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染A549和H1299細(xì)胞后NUCKS1在非小細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)

表7 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活性的影響

表8 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞活性的影響

表9 Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞系遷移和侵襲的影響

表10 Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染NC、LV-NC和LV-miR-342-3p轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞系遷移和侵襲的影響

討 論

研究報(bào)道m(xù)iRNA參與了腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，肝癌組織中的miR-342-3p表達(dá)顯著降低，與TNM分期、組織學(xué)分級(jí)和不良的生存率相關(guān)，是肝癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肺癌組織及肺癌細(xì)胞A549和H1299中miR-342-3p表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-342-3p表達(dá)水平降低，與其它研究結(jié)果一致。研究報(bào)道m(xù)iR-342-3p過(guò)表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖[7]。miR-342-3p還可抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲[8]。miR-342-3p的異位表達(dá)顯著抑制了鼻咽癌細(xì)胞的增殖，集落形成和侵襲[9]。說(shuō)明miR-342-3p在多種腫瘤中均有抑癌作用。為研究miR-342-3p對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了慢病毒介導(dǎo)的miR-342-3p過(guò)表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞A549中，結(jié)果顯示，肺癌細(xì)胞A549中miR-342-3p表達(dá)水平升高，表明轉(zhuǎn)染成功。且細(xì)胞活力降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低；表明慢病毒介導(dǎo)的miR-342-3p可抑制肺癌細(xì)胞A549和H1299增殖、遷移和侵襲。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明miR-342-3p在肺癌中同樣起抑癌作用。

研究報(bào)道m(xù)iR-342-3p可通過(guò)靶向LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[10]。說(shuō)明miR-342-3p可通過(guò)調(diào)控其靶基因影響腫瘤的進(jìn)展。為進(jìn)一步研究miR-342-3p影響肺癌的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TargetScan預(yù)測(cè)顯示miR-342-3p可能的靶向結(jié)合mRNA，結(jié)果顯示miR-342-3p與NUCKS1 3′UTR含有互補(bǔ)的核苷酸序列。研究報(bào)道NUCKS1在肝癌組織中上調(diào)表達(dá)，敲低NUCKS1可降低異種移植小鼠模型中Hep3B細(xì)胞系細(xì)胞活力并減少腫瘤形成[11]。抑制NUCKS1可降低胃癌細(xì)胞增殖和侵襲性[12]。說(shuō)明NUCKS1在肝癌和胃癌中可能起促癌作用，但其在肺癌的作用尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了肺癌組織以及肺癌細(xì)胞A549和H1299中NUCKS1表達(dá)水平，結(jié)果顯示NUCKS1表達(dá)水平升高，與在肝癌組織中表達(dá)趨勢(shì)相同，表明NUCKS1可能在肺癌中可能也充當(dāng)癌基因。此外研究報(bào)道m(xù)iR-142-3p通過(guò)靶向下調(diào)NUCKS1抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。說(shuō)明NUCKS1可受miRNA的調(diào)控進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-342-3p過(guò)表達(dá)后NUCKS1表達(dá)水平降低；且進(jìn)一步通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-342-3p可靶向調(diào)控NUCKS1。提示，miR-342-3p可能通過(guò)調(diào)控NUCKS1影響肺癌進(jìn)展。