miR-200通過靶向PD-L1抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的研究

艾孜子·阿不來提 艾力江·多力坤 陳康

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的常見病理類型，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)達(dá)晚期[1]。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲在腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用。因此，尋找到抑制NSCLC遷移、侵襲的靶點(diǎn)對于提高患者的預(yù)后尤為重要。microRNAs(miRs)是長度22nt 的內(nèi)源性非編碼RNA，與靶基因相互作用后調(diào)控轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)。有報(bào)道稱，miR-200作為抑癌基因，可抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，促進(jìn)凋亡[2-4]。戚永超等研究發(fā)現(xiàn)[5]，肺癌患者血清中miR-200水平低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。但miR-200與NSCLC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的關(guān)系尚不清楚。程序性死亡受體配體-1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)屬于負(fù)性協(xié)同刺激分子，在免疫應(yīng)答中起到負(fù)性調(diào)控作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞PD-L1高表達(dá)患者預(yù)后良好，復(fù)發(fā)率低[7]。PD-L1還可以協(xié)助腫瘤逃避監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等[8]。張宇軒等研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1下調(diào)后可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[9]。團(tuán)隊(duì)前期通過在線網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，miR-200與PD-L1存在一定的互補(bǔ)堿基對，但兩者是否存在靶向關(guān)系尚不清楚?；谏鲜鲅芯?，本研究將miR-200 轉(zhuǎn)染到NSCLC細(xì)胞A549，探討miR-200對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響及機(jī)制，以期為NSCLC的治療提供靶點(diǎn)。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

肺癌細(xì)胞株A549，正常肺成纖維細(xì)胞HLF-1(上海生命科學(xué)研究所)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基( Dulbecco′smodified Eagle medium,DMEM)培養(yǎng)液、雙抗、胰蛋白酶(Biosciences，美國)；miR-NC、miR-200-mimic、si-NC、si-PD-L1、pEGFP、pEGFP-PD-L1、anti-miR-200、anti-miR-NC、MUT-PD-L1和 WT- PD-L1(上海生工生物有限公司)；LipofectAMINE 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(BioVision公司，美國)；兔抗人PD-L1、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔單克隆二抗(Sigma公司，美國)；Transwell小室(上海鈺森生物有限公司)；MTT檢測試劑盒、RNA提取試劑盒(武漢博士德生物公司)；PCR試劑盒(Sigma公司，美國)；蛋白印記試劑盒(Kapa Biosystems，美國)；酶標(biāo)儀(上海儀電分析儀器有限公司)；ABI 7900PCR擴(kuò)增儀(上海儀電分析儀器有限公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549，HLF-1細(xì)胞，培養(yǎng)基中加入含 10% FBS 和青、鏈霉素各 100U/L，培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2，濕度飽和。定期更換培養(yǎng)基、傳代。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染：使用Lipofeetamine 2000試劑將miR-NC、miR-200-mimic、si-NC、si-PD-L1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證 miR-200通過下調(diào)PD-L1調(diào)控A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，將miR-200-mimic、pEGFP-PD-L1同時(shí)轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，進(jìn)而觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。具體分組如下：NC組(未進(jìn)行任何處理的A549細(xì)胞)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-200組(轉(zhuǎn)染miR-200-mimic)、si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-PD-L1組(轉(zhuǎn)染si-PD-L1)、miR-200+pEGFP組(轉(zhuǎn)染miR-200-mimic+pEGFP)及miR-200+pEGFP-PD-L1組(轉(zhuǎn)染miR-200-mimic+pEGFP-PD-L1)。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)檢測細(xì)胞miR-200、PD-L1 mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，將合格的總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。合成目標(biāo)引物序列(北京華大基因公司)(見表1)，配置反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex TaqTM(2×)12.5μL+上下游引物10μM各1μL，加反應(yīng)水至總體積為25μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s，共40個(gè)循環(huán)，75 ℃讀取熒光，構(gòu)建溶解曲線。2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)引物mRNA的相對表達(dá)量。

表1 目標(biāo)引物序列和大小

3 熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-200與PD-L1的靶向關(guān)系 按照試劑盒步驟將PD-L1野生型或突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體與miR-NC、miR-200-mimic共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后去除培養(yǎng)液。PBS洗滌3遍，加入細(xì)胞裂解液。4 ℃振蕩10 min，40 ℃ 1 000 r/min離心3 min，取上清進(jìn)行發(fā)光測定。

4 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 分別消化、收集各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×106/L的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中0, 48, 72及 96 h，終止前每孔加入20 mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，上機(jī)前吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 mL DMSO，水平搖床搖動(dòng)30min，在酶標(biāo)儀(490 nm波長)上測量吸光度 OD值，并繪制細(xì)胞活力曲線。

5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力 采用無Matrigel基質(zhì)膠和有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室分別進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：上室每孔加入200 μl無血清細(xì)胞懸浮液，密度為6×104個(gè)/孔，下室加入600 μl含20%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定10 min，0.5 %結(jié)晶紫染色10 min。洗滌，光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。侵襲實(shí)驗(yàn)：使用4 ℃的無血清DMEM 1 ∶6稀釋基質(zhì)膠，每個(gè)transwell小室中加40 μL Matrigel基質(zhì)膠，37 ℃放置30 min。取出小室吸取多余的液體，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

6 Western blot法檢測細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá) 加2mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min，40 ℃ 500×g離心5 min，吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μl待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1 h，逐次大鼠抗人PD-L1(1 ∶100)、β-actin單克隆抗體(1 ∶100)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶100，武漢博士德生物有限公司)。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度，結(jié)果以PD-L1與β-actin條帶光密度值比值表示相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、A549，HLF-1細(xì)胞miR-200、PD-L1的表達(dá)

與正常肺成纖維細(xì)胞HLF-1相比，人肺癌A549細(xì)胞miR-200表達(dá)水平降低，PD-L1基因、蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(見圖1)。

圖1 細(xì)胞miR-200、PD-L1的表達(dá)水平與HLF-1比較，*P<0.05

二、A549細(xì)胞miR-200與PD-L1的靶向關(guān)系

通過生物學(xué)信息軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-200與WT- 3′UTR-PD-L1存在一定數(shù)量的互補(bǔ)堿基對。熒光素酶實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染miR-200-mimic+WT-PD-L1的A549細(xì)胞熒光素酶活性低于轉(zhuǎn)染miR-NC+WT-PD-L1組(P<0.05)；與miR-NC+MUT-PD-L1組相比，轉(zhuǎn)染miR-200-mimic+MUT-PD-L1的A549細(xì)胞熒光素酶活性下降不明顯。miR-200組細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)水平明顯低于miR-NC組(P<0.05)；anti-miR-200組細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)水平明顯高于anti-miR-NC組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 miR-200與PD-L1的靶向關(guān)系與miR-NC組比較，*P<0.05； 與anti-miR-NC組，#P<0.05

三、過表達(dá)miR-200對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-200組細(xì)胞miR-200水平顯著高于NC組、miR-NC組(P<0. 05)。48 和 72 h 時(shí)，miR-200組細(xì)胞活力明顯低于NC組、miR-NC組(P<0. 05)。miR-200組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量明顯低于NC組、miR-NC組(P<0.05)(見圖3、4)。

圖3 過表達(dá)miR-200對細(xì)胞增殖的影響與miR-200組比較，*P<0.05

圖4 過表達(dá)miR-200對細(xì)胞遷移和侵襲的影響(20×)與miR-200組比較，*P<0.05

四、抑制PD-L1表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-PD-L1組細(xì)胞PD-L1 mRNA、蛋白水平顯著低于NC組、si-NC 組(P<0.05)。48 和 72 h 時(shí)，si-PD-L1組細(xì)胞活力明顯低于NC組、si-NC組(P<0.05)。si-PD-L1組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量明顯低于NC組、si-NC組(P<0.05)(見圖5)。

圖5 抑制PD-L1表達(dá)對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響A、B 各組PD-L1蛋白水平；C 增殖能力檢測；D 遷移能力檢測；E 侵襲能力檢測; 與si-PD-L1組比較，*P<0.05

五、過表達(dá)PD-L1可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-200對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用

miR-200+ pcDNA-PD-L1組細(xì)胞PD-L1蛋白、mRNA均高于miR-200+pcDNA組、miR-200組(P<0.05)。miR-200+ pcDNA-PD-L1組細(xì)胞48、72 h時(shí)細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量高于miR-200+pcDNA組、miR-200組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖6)。

圖6 過表達(dá)PD-L1可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-200對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用A:各組PD-L1蛋白水平；B:遷移能力檢測；C:侵襲能力檢測;D:增殖能力檢測. 與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-200+pcDNA組比較，#P<0.05

討 論

肺癌近年來發(fā)病率逐漸增加，且呈年輕化趨勢。腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移在肺癌預(yù)后不良及復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要的作用。因此，如何抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及轉(zhuǎn)移成為目前研究的熱點(diǎn)。

miRNA屬于高度保守的一種非編碼RNA，正常狀態(tài)下，miRNA的表達(dá)、降解過程遵循一定的規(guī)律，miRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致人類多種疾病的發(fā)生。miR-200作為最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，廣泛參與了多種腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，如王培云等研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b、miR-200c可靶向調(diào)節(jié)肝細(xì)胞生長因子(HGF)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[10]。李娟等研究結(jié)果顯示，miR-200b可上調(diào)調(diào)控PDCD4，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為能力[11]。為明確 miR- 200對NSCLC細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的影響，在本實(shí)驗(yàn)中，首先觀察了肺癌細(xì)胞株及人胚肺成纖維細(xì)胞中miR-200表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-200在肺癌細(xì)胞中低表達(dá)。隨后將miR-200-mimic轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞株，檢測了細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-200細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力明顯減弱，提示miR-200具有抑制NSCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的功能，這與其他腫瘤的相關(guān)研究基本一致。腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲是腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，肺癌作為一種惡性腫瘤，容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移，本次研究結(jié)果提示miR-200可能作為一種潛在的肺癌治療靶點(diǎn)。

PD-L1可介導(dǎo)多種腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，而人體正常細(xì)胞幾乎不表達(dá)[12-13]。大量研究表明，PD-L1與前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后、耐藥、復(fù)發(fā)等有關(guān)[14-16]。PD-L1活性的失活是抑制腫瘤發(fā)生免疫逃避的重要途徑。然而, miR-200和 PD-L1的靶向關(guān)系及其對肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響目前尚不清楚。因此本研究開展了以下實(shí)驗(yàn)探討上述問題。本實(shí)驗(yàn)首先觀察了不同細(xì)胞株P(guān)D-L1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示A549細(xì)胞PD-L1基因、蛋白表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制PD-L1表達(dá)后細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力減弱。PD-L1與其受體免疫細(xì)胞表面程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death-1, PD-1)結(jié)合后可抑制細(xì)胞的免疫功能，“幫助”細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的惡性生物學(xué)行為。本次研究結(jié)果證實(shí)了上述理論的正確性，同時(shí)提示針對PD-L1的抑制劑有望成為肺癌治療的靶向藥物。隨后，熒光素酶實(shí)驗(yàn)及PD-L1蛋白測定結(jié)果顯示，miR-200與PD-L1存在負(fù)性靶向調(diào)控的關(guān)系。最后團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，過表達(dá)PD-L1可逆轉(zhuǎn)miR-200對腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制功能，這更進(jìn)一步證實(shí)miR-200可靶向調(diào)控PD-L1。但miR-200如何調(diào)控PD-L1的表達(dá)，具體通道尚需深入的探討。

綜上所述，過表達(dá)miR-200可抑制A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，這一過程與負(fù)性靶向調(diào)控PD-L1有關(guān)。但本次研究存在一定的局限性，如未對相關(guān)的相關(guān)信號通路進(jìn)行研究，這也是下一步研究的重點(diǎn)。