沉默lncRNA TPT1-AS1對非小細胞肺癌生物學行為的影響及機制研究

惠珂 霍樹芬 劉凌華 王君 田應選

非小細胞肺癌已經(jīng)成為目前嚴重威脅人類生命健康的惡性腫瘤，目前缺乏早期的診斷和有效的治療手段干預，導致大部分患者預后處于較差的水平[1]。近年來所興起的非編碼RNA為臨床上非小細胞肺癌的研究提供了新的方向，長鏈非編碼RNA(LncRNA)屬于非編碼RNA中的一類，參與機體多種生理病理過程。TPT1-AS1是近年來最新發(fā)現(xiàn)的一種位于13號染色體上的LncRNA，已有研究顯示，TPT1-AS1參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。目前臨床上對于LncRNA TPT1-AS1與非小細胞肺癌的關系研究較少，僅有賀伯偉等[3]研究中認為其在非小細胞肺癌中高表達?；谏鲜鲅芯?，在本文中分析長鏈非編碼RNA(lncRNA)TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中的表達及對沉默lncRNA TPT1-AS1非小細胞肺癌生物學行為的影響及機制，為臨床上非小細胞肺癌的診治提供新方向。

資料與方法

一、 材料

研究組織：取我院病理科留存的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，做lncRNA TPT1-AS1指標檢測。

研究細胞：人非小細胞肺癌A549細胞株購自武漢純度生物科技有限公司，貨號CD-4742-SB。本文研究通過我院倫理委員會批準。

主要試劑：TPT1-AS1過表達轉染質(zhì)粒(si-TPT1-AS1-NC)、TPT1-AS1沉默(si-TPT1-AS1)轉染質(zhì)粒，由上海吉瑪公司設計并合成；

兔抗大鼠PTEN抗體購自南京北魚生物科技有限公司；兔抗人MMP-2抗體、兔抗人MMP-9抗體購自艾美捷科技有限公司；兔抗大鼠p-PI3K抗體購自艾美捷科技有限公司；兔抗人p-AKT抗體購自深圳欣博盛生物科技有限公司；小鼠抗大鼠Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司。

二、 方法

1 lncRNA TPT1-AS1檢測 取所制備的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，一部分做切片采用免疫組化檢測lncRNA TPT1-AS1表達情況，一部分在冰箱中保存采用實時熒光定量PCR法檢測lncRNA TPT1-AS1 mRNA表達情況。

免疫組化：將所制備的非小細胞肺癌組織和癌旁組織做石蠟切片做脫蠟處理，在乙醇中浸泡5 min后使用無菌蒸餾水洗滌，將檸檬酸鈉抗原修復液加入至沸水中，做水浴處理，水浴處理20 min后冷卻，在其冷卻至室溫后使用PBS做反復清洗處理，反復清洗3次，每次清洗時間為5 min，之后將1:200比例的lncRNA TPT1-AS1抗體滴入后放置于溫度為4℃濕盒中保存，過夜，隔日復溫，使用PBS反復清洗3次，之后將1:50比例的二氨基聯(lián)苯胺加入做顯色處理，加入蒸餾水終止反應。之后使用蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯?jīng)_洗至透明，最后封片、顯微鏡觀察。依據(jù)染色細胞百分比和染色程度評估陽性情況，-為陽性細胞數(shù)<10%，+為10%≤陽性細胞數(shù)≤25%，++為25%<陽性細胞數(shù)≤75%，+++為為75%<陽性細胞數(shù)。

實時熒光定量PCR法：取在冰箱中保存的非小細胞肺癌組織和癌旁組織，采用Trizol法提取組織中總RNA，提取完成后測定所提取的RNA純度和含量，Takara逆轉錄試劑盒行逆轉錄獲得cDNA，使用RT-PCR方法檢測lncRNA TPT1-AS1 mRNA表達量，采用2-△△Ct方法計算。反應體系：上下游引物0.4 μl、cDNA模板1 μl、SYB Green 10 μl，加蒸餾水至20 μl。反應條件：95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 31s，共進行40個循環(huán)。lncRNA TPT1-AS1引物序列：上游：5’-GCTATCCTTGCCCATCTTCCTA-3′，下游：5′-GAGGCCAGTGCTCTGAAGGAAA-3′；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：上游：5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，下游：5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。

2 細胞培養(yǎng)及l(fā)ncRNA TPT1-AS1轉染 將人非小細胞肺癌A549細胞株使用含10%胎牛血清、雙抗的RPMI 1640完全培養(yǎng)基在溫度為37℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，每3d更換1次新鮮培養(yǎng)液，待細胞融合度在70%～80%時，行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的人非小細胞肺癌A549細胞，將細胞分為空白組、過表達組、沉默組。使用GenBank查找序列獲得TPT1-AS1序列，構建TPT1-AS1過表達轉染質(zhì)粒(si-TPT1-AS1-NC)、TPT1-AS1沉默(si-TPT1-AS1)轉染質(zhì)粒，由上海吉瑪公司設計并合成，參照Lipofectamine 2000說明書行轉染操作，過表達組轉染si-TPT1-AS1-NC質(zhì)粒，沉默組轉染si-TPT1-AS1質(zhì)粒，轉染24h后做后續(xù)試驗，空白組細胞不做任何處理。si-TPT1-AS1-NC序列：5′-CCTATCTGCTAAACATGTATC-3′；si-TPT1-AS1序列：5′-GGCCCTCAATTTTCAATGCATT-3′。

3 轉染效率鑒定 在轉染24h后采用實時熒光定量PCR法測定lncRNA TPT1-AS1轉染效率，方法同1.2.1中實時熒光定量PCR法。

4 細胞增殖檢測 細胞增殖情況使用MTT比色法測定，將所測定的細胞濃度進行調(diào)整，調(diào)整濃度為3×104個/mL，上述操作完成后將所測定的細胞在96孔板中接種，每孔中加入200 μL的細胞懸液培養(yǎng)24、48、72 h后(培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5% CO2)將10 μL MTT試劑加入，孵育4 h，使用酶標儀測定OD值，計算增殖率。細胞增殖率=(檢測的細胞組OD值/對照組OD值)×100%。

5 細胞凋亡檢測 細胞凋亡情況使用TUNEL法測定，將所培養(yǎng)的細胞做洗滌、DAPI染色封片后的細胞核分別呈現(xiàn)為藍色熒光、綠色熒光，其中藍色熒光表示陰性細胞數(shù)，綠色熒光表示陽性細胞數(shù)，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

6 細胞遷移檢測 細胞遷移能力使用劃痕實驗測定，將所培養(yǎng)的細胞在18孔板上進行接種，待細胞生長至80%時，使用槍頭(100 μl)做垂直劃直線操作，之后使用PBS洗滌3次，加入血清培養(yǎng)基(0.5 %)，24 h后使用倒置顯微鏡觀察細胞遷移情況。

7 細胞侵襲檢測 細胞侵襲能力使用Transwell小室測定，Transwell小室中放置所培養(yǎng)的細胞，其中下室接種100 ng/mL IL-8、上室接種細胞懸液，1 d后下室加TMP溶液TMP溶液孵育，孵育時間大約為180 min，之后使用潔凈無菌棉簽將上室微孔中的細胞擦除，PBS洗滌，洗滌操作完成后在4%多聚甲醛溶液中固定15min，蘇木晶染色、PBS清晰，使用倒置顯微鏡觀察細胞侵襲情況。

8 細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白檢測 細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達情況使用Western Blot法測定，對所培養(yǎng)的細胞做離心、蛋白提取，提取完成后使用BCA做蛋白定量測定，將所提取的50 μg蛋白加入至2×SDS凝膠緩沖液中，做電泳、轉膜、取膜、固定、封閉處理，將1:1000比例的TBST稀釋的PTEN、p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Bax一抗，在溫度為4℃的環(huán)境下孵育過夜，TBST重復做3次洗膜處理，加入1:10000 TBST稀釋的二抗，搖動孵育60 min，TBST重復做3次洗膜處理，使用DAB做顯色處理，分析蛋白表達情況。

三、 統(tǒng)計學處理

結 果

一、 非小細胞肺癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1表達情況對比

如(表1、圖1)所示，與癌旁組織相比，癌組織TPT1-AS1 mRNA表達量升高(P<0.05)。

表1 非小細胞肺癌組織、癌旁組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1表達情況對比

圖1 TPT1-AS1免疫組化圖(SP×400，比例尺：100μm)

二、 lncRNA TPT1-AS1轉染效率

如(表2)所示，與空白組相比，過表達組TPT1-AS1 mRNA表達量升高，沉默組TPT1-AS1 mRNA表達量降低(P<0.05)，說明轉染成功。

表2 lncRNA TPT1-AS1轉染效率

三、 各組細胞增殖、凋亡情況對比

如(表3、圖2)所示，與空白組相比，過表達組各時間點細胞增殖率升高，凋亡率降低(P<0.05)；與空白組相比，沉默組各時間點細胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組各時間點細胞增殖率降低，凋亡率升高(P<0.05)。

圖2 細胞凋亡TUNEL圖(×10)

表3 各組細胞增殖、凋亡情況對比

四、 各組細胞遷移、侵襲情況對比

如(表4、圖3、4)所示，與空白組相比，過表達組細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)升高(P<0.05)；與空白組相比，沉默組細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)降低(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組細胞遷移數(shù)、侵襲數(shù)降低(P<0.05)。

圖3 細胞遷移圖(×100)

圖4 細胞侵襲圖(×100)

表4 各組細胞遷移、侵襲情況對比 個]

五、 各組細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達量對比

如(表5、圖5)所示，與空白組相比，過表達組PTEN、Bax蛋白表達量降低，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量升高(P<0.05)；與空白組相比，沉默組PTEN、Bax蛋白表達量升高，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)；與過表達組相比，沉默組PTEN、Bax蛋白表達量升高，p-PI3K、p-AKT、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)。

圖5 蛋白WB圖

表5 各組細胞PTEN-PI3K-AKT信號通路蛋白表達量對比

討 論

肺癌已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率均較高的惡性腫瘤之一，肺癌類型中主要以非小細胞肺癌最為常見，非小細胞肺癌的發(fā)生不僅在一定程度上影響患者生活質(zhì)量，而且隨著疾病的進展威脅患者的生命安全[4-5]。目前臨床上認為非小細胞肺癌的發(fā)生與多種因素共同作用相關，但其具體作用機制尚不明確，且目前所應用的治療手段并不能達到理想的效果，因此積極尋找診斷和治療此病的靶點，對改善患者預后具有重要的意義。

隨著目前臨床上對lncRNA的逐漸深入研究發(fā)現(xiàn)，其可在一定程度上影響癌細胞增殖、遷移、侵襲，lncRNA TPT1-AS1屬于lncRNA的一種，首先在2016年被Wang等[6]研究在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)，其研究顯示，TPT1-AS1在Ⅲ型間變性腦膠質(zhì)瘤低風險組中高表達，與患者預后相關。之后相繼有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TPT1-AS1的表達與宮頸癌[7]、上皮性卵巢癌[8]、大腸癌[9]、前列腺癌[10]相關。目前關于lncRNA TPT1-AS1與非小細胞肺癌關系的研究較少，僅有賀伯偉等[3]在2020年的最新研究中認為lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中高表達。在本文研究中，分析lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中的表達，結果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌組織中高表達，與上述研究結果保持一致?；谏鲜鲅芯勘尘?，在本文中做lncRNA TPT1-AS1沉默處理，分析沉默lncRNA TPT1-AS1后對非小細胞肺癌細胞生物學行為的影響，結果發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA TPT1-AS1非小細胞肺癌細胞異常增殖、遷移、侵襲現(xiàn)象明顯被抑制，凋亡率明顯增加，此結果提示著，lncRNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌中高表達，沉默后可明顯改變異常的癌細胞生物學行為，其可能參與非小細胞肺癌的發(fā)生進展。

在非小細胞肺癌發(fā)生轉移的過程中會分泌大量的MMP-2、MMP-9等金屬蛋白酶家族蛋白，當MMP-2、MMP-9含量過高后會降低癌細胞與細胞外基質(zhì)的黏附作用，降解基底膠原纖維，進而增強癌細胞的侵襲、遷移力，使其進入至血液系統(tǒng)或者淋巴系統(tǒng)中，最終在肺外形成新的轉移病灶[11-12]。另外細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡為機體在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時所產(chǎn)生的一種細胞自主且有序的死亡過程，而當細胞發(fā)生癌變后其凋亡明顯被抑制，表現(xiàn)為Bax、Bcl-2等細胞凋亡蛋白失衡[13-14]。本文結果顯示，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，上述指標表達異?，F(xiàn)象明顯被改變，此結果提示著，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制非小細胞肺癌轉移。目前隨著臨床上對非小細胞肺癌的逐漸深入研究發(fā)現(xiàn)，PTEN突變?nèi)笔?、PI3K的異?；罨瘏⑴c肺癌細胞的增殖和遷移等過程，在此過程中具有重要的意義[15-16]。PTEN-PI3K-AKT信號通路參與癌細胞的增殖、遷移等異常生物學行為，在機體處于正常狀態(tài)下時，PTEN與PI3K之間處于動態(tài)平衡，在細胞正常增殖、功能的穩(wěn)定中發(fā)揮作用，但在細胞癌變后PTEN會經(jīng)抑制PI3K表達而發(fā)揮其抑制癌細胞異常增殖、遷移的作用，最終抑制疾病進一步惡化[17-18]。另外有研究顯示，激活的AKT可促進癌細胞增殖、遷移，而PTEN可對AKT產(chǎn)生負向調(diào)控作用，降低其AKT磷酸化含量，使其失活，發(fā)揮其抑制癌細胞增殖、遷移的作用[19-21]。本文中擬認為沉默lncRNA TPT1-AS1抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡的機制為調(diào)控PTEN-PI3K-AKT信號通路，并進一步驗證，結果顯示，沉默lncRNA TPT1-AS1后，PTEN表達增加，PI3K、AKT表達降低，此結果提示著，沉默lncRNA TPT1-AS1可能經(jīng)維持PTEN與PI3K之間平衡和負向調(diào)控AKT而改變MMP-2、MMP-9、Bax、Bcl-2表達，最終發(fā)揮其阻礙疾病惡化的作用。

綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1高表達，沉默lncRNA TPT1-AS1可抑制肺癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進凋亡，其機制可能與調(diào)控PTEN-PI3K-AKT信號通路相關，經(jīng)調(diào)控Bax、Bcl-2表達抑制細胞增殖，促進凋亡，經(jīng)調(diào)控MMP-2、MMP-9表達抑制細胞遷移、侵襲。