山茱萸萜類甲羥戊酸合成途徑關(guān)鍵酶CoHMGS基因的克隆與分析

侯典云，王瑤瑤#，劉曉冉，張佳琪，馬占強(qiáng)，胥華偉，王笑塵

1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471023

2.洛陽市道地藥材繁育與創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023

3.南陽市山茱萸研究所，河南 南陽 474550

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥果肉，是我國傳統(tǒng)名貴藥材，具有補(bǔ)益肝腎、收澀固脫等功效[1]。山茱萸的主要成分有環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)類、黃酮類、三萜類、苯丙素類等，還包含多種對人體有益的其他物質(zhì)[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為山茱萸具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗炎癥[5]、護(hù)肝[6]、降血糖[7]等生物學(xué)活性，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。

植物體內(nèi)的萜類有2條合成途徑：1條是甲羥戊酸途徑，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用；另1條是發(fā)現(xiàn)較晚的甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑，定位在質(zhì)體[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（HMGS）是甲羥戊酸途徑的關(guān)鍵酶，作用于該途徑的第2步反應(yīng)，催化一分子乙酰乙酰輔酶A和一分子乙酰輔酶A縮合生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A[9]，接著進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)生成相應(yīng)的萜類物質(zhì)。HMGS對萜類物質(zhì)的生物合成至關(guān)重要，備受關(guān)注，近年來在銀杏[10]、牛樟芝[11]、桑黃[12]、陸英[13]、靈芝[14]和丹參[15]等藥用植物上均有研究，但在山茱萸中未見報道。

在山茱萸轉(zhuǎn)錄組中，通過分析目前只發(fā)現(xiàn)了c102453_g2[16]這1個HMGS基因，利用primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CoHMGS基因，通過生物信息學(xué)分析軟件初步探討CoHMGS編碼蛋白質(zhì)的特征信息，為進(jìn)一步研究山茱萸體內(nèi)甲羥戊酸生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

植物材料經(jīng)河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院侯典云教授鑒定為山茱萸C.officinalisSieb.et Zucc.植株。采集山茱萸樹上完整無病蟲害且生長狀態(tài)基本一致的葉片和果實(shí)若干，摘下后立即用蒸餾水沖洗干凈，放進(jìn)事先準(zhǔn)備的1.5 mL離心管內(nèi)，置于液氮速凍，最后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒（北京天根有限公司，編號：DP441）；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×Long Taq Master Mix、零背景pTOPO-TA克隆載體購自艾德萊生物科技公司；DNA純化回收試劑盒（南京諾維贊有限公司）；感受態(tài)的大腸桿菌DH10B（自制）。

2 方法

2.1 引物合成

根據(jù)c102453_g2序列設(shè)計山茱萸HMGS基因的擴(kuò)增引物，引物具體序列為CoHMGS-F：5’-GGAGCTAGTGACAGAAAGA-3’和CoHMGS- R：5’-CTGGCAGAATGAGGAACA-3’。

2.2 山茱萸RNA的提取和cDNA的合成

山茱萸葉片用液氮研磨，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書操作，獲得山茱萸總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop檢測RNA的提取質(zhì)量和濃度。

2.3 CoHMGS基因克隆與測序

以山茱萸總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，設(shè)置25 μL PCR擴(kuò)增體系：1 μL CoHMGS-F引物、1 μL CoHMGS-R引物、1.5 μL cDNA、12.5 μL 2×Long Taq Master Mix、9 μL ddH2O；CoHMGS基因PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，切膠純化回收目的片段，連接到pTOPO-T載體上形成重組質(zhì)粒，再通過熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH10B中，加入無菌液體LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)60 min左右，濃縮菌液涂布于氨芐抗性的LB平板，選取單菌落搖菌6 h以上，菌液PCR挑選條帶正確的菌液送公司測序。

2.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫對CoHMGS基因進(jìn)行Blast和保守結(jié)構(gòu)域分析，通過Cell-Ploc 2.0在線預(yù)測CoHMGS基因編碼蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體位置，利用ExPASY analysis分析CoHMGS基因編碼氨基酸的特征，使用TMHMM Server推測蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)信息，用MEGA 5.0軟件對山茱萸HMGS編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 CoHMGS基因克隆與測序

圖1 CoHMGS的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of CoHMGS

CoHMGS基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增獲得一條單一亮帶（圖1）?；厥占兓?，然后連接到克隆載體pTOPO-T上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10B，經(jīng)菌落PCR鑒定，挑選陽性菌液送公司測序，獲得長度為1645 bp的序列，經(jīng)比對確認(rèn)為CoHMGS的cDNA序列。

3.2 CoHMGS保守結(jié)構(gòu)域分析

對測序得到的DNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示山茱萸CoHMGS基因序列和喜樹、人參、三七和杜仲等植物的HMGS基因序列相似程度均在90%以上。結(jié)果表明，山茱萸CoHMGS蛋白屬于PLNO2577超家族，是羥甲基戊二酰輔酶A合酶（圖2）。

3.3 CoHMGS亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用相應(yīng)工具確定CoHMGS的開放閱讀框和編碼的氨基酸序列。通過Cell-Ploc 2.0在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示：CoHMGS基因編碼蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖3）。

圖2 CoHMGS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains of CoHMGS protein

圖3 CoHMGS蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測Fig.3 Prediction of CoHMGS protein subcellular location

3.4 山茱萸CoHMGS編碼蛋白的特性分析

ExPASy在線分析結(jié)果表明CoHMGS編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為51 875.8，分子式為C2304H3555N605O705S27，理論等電點(diǎn)6.13；絲氨酸數(shù)量最多，占比9.8%，負(fù)電荷氨基酸共52個，正電荷氨基酸共46個，蛋白整體帶負(fù)電荷；預(yù)測是不穩(wěn)定親水性蛋白。TMHMM Server在線分析結(jié)果顯示：山茱萸CoHMGS蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個膜外蛋白（圖4）。

3.5 山茱萸CoHMGS蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPMA在線預(yù)測山茱萸CoHMGS蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖5），包括α-螺旋占43.62%，無規(guī)則卷曲占40.64%，自由延伸占12.55%，β-轉(zhuǎn)角占3.19%。由SWISS-MODEL預(yù)測得到該蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型（圖6）。

3.6 山茱萸CoHMGS氨基酸序列同源分析

圖4 CoHMGS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 CoHMGS protein transmembrane domain prediction

圖5 CoHMGS蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of CoHMGS protein

圖6 CoHMGS蛋白三級結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of CoHMGS protein

多序列比對分析結(jié)果表明山茱萸CoHMGS序列與山梨獼猴桃Actinidia rufaPlanch.的HMGS序列一致性為90.45%、中華獼猴桃Actinidia chinensisPlanch.為90.02%、三七Panax notoginseng(Burkill) F.H.Chen ex C.H.為90.43%、茶Camellia sinensis(L.) O.Ktze.為90.23%、喜樹Camptotheca acuminateDecne.為88.75%、人參Panax ginsengC.A.Meye.為90.21%、榴蓮Durio zibethinusMurr.為90.32%、可可樹Theobroma cacaoL.為89.46%、阿育魏實(shí)Trachyspermum ammi(L.) Sprague.為88.82%、杜仲Eucommia ulmoidesOliver.為90.39%。使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建山茱萸CoHMGS與其近緣物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7），說明山茱萸HMGS與喜樹、杜仲、山梨獼猴桃和中華獼猴桃的同源性較近，三七、人參等植物的HMGS與山茱萸同源性較遠(yuǎn)。

4 討論

圖7 CoHMGS蛋白的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 NJ phylogenetic tree of CoHMGS protein

近年來，隨著研究的深入，許多萜類物質(zhì)及其 衍生物的活性被解析，成為治療諸多疾病的關(guān)鍵成分之一，如能夠有效治療腫瘤的紫杉醇，被譽(yù)為天然抗癌藥物，是一種二萜生物堿類化合物[17]；可以抑制瘧疾的青蒿素，是目前為止發(fā)現(xiàn)的治療瘧疾耐藥性最好的藥物，屬于倍半萜內(nèi)酯化合物[18]；明顯減輕心絞痛，長期服用無明顯不良反應(yīng)，有效緩解冠心病癥狀的丹參酮[19]等。這些天然的中藥活性物質(zhì)成分安全，對人體危害性小，是不可多得的健康藥物，但是植物的次生代謝產(chǎn)物往往具有種類豐富、產(chǎn)量偏低的特點(diǎn)。因此，通過解析萜類物質(zhì)的生物合成途徑，從分子水平定向改造植物來提高特定次生代謝產(chǎn)物含量是十分必要的。

甲羥戊酸途徑（MVA pathway）是植物生成萜類物質(zhì)的重要途徑，主要生成倍半萜和三萜類物質(zhì)[20]。HMGS廣泛存在于高等植物體內(nèi)，是MVA途徑中的第2種酶，在有些植物體內(nèi)HMGS有多個家族成員，Alex等[21]于2000年發(fā)現(xiàn)了存在于芥菜中的4個HMGS基因，隨后有研究者發(fā)現(xiàn)在巴西橡膠樹內(nèi)存在2個HMGS基因[22]。研究表明，HMGS基因在植物的不同部位以及發(fā)育的不同時期的表達(dá)具有明顯的差異性，并且作為MVA途徑中的關(guān)鍵酶，影響多種植物發(fā)育模式的改變和次生代謝產(chǎn)物的生成[23]。將HMGS在雷公藤懸浮細(xì)胞中的差異表達(dá)，結(jié)果表明：過表達(dá)TmHMGS可提高M(jìn)VA途徑和MEP途徑下游基因的表達(dá)量和二萜類化合物雷公藤甲素的含量，RNA干擾會降低MVA途徑和MEP途徑下游的基因表達(dá)量[24]。外源激素處理銀杏葉片，發(fā)現(xiàn)在合適的激素濃度和處理時間下水楊酸、茉莉酸甲酯、乙烯都能不同程度地提高GbHMGS的表達(dá)量，同時也提高了銀杏葉片中萜烯三內(nèi)酯的總含量[10]。通過在番茄幼苗中過表達(dá)芥菜HMGS基因（BjHMGS1），可以明顯地提高萜類物質(zhì)合成途徑MVA途徑中HMGS上下游基因的表達(dá)量，并且也會影響MEP途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中萜類物質(zhì)（類胡蘿卜素、角鯊烯）、α-生育酚以及一些植物甾醇的含量[25]。上述研究均表明HMGS基因在植物體內(nèi)合成萜類物質(zhì)的重要性。

山茱萸作為重要的中藥材，其經(jīng)濟(jì)價值、生長習(xí)性和活性因子等方面得到了很大程度的開發(fā)，以山茱萸作為主要成分的中成藥和保健品種類豐富，然而從分子水平上探究山茱萸活性成分生物合成途經(jīng)的研究較少。本研究在高通量轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，首次克隆出山茱萸HMGS基因的全長cDNA序列，并對山茱萸HMGS蛋白的基本特征和功能分析預(yù)測，為進(jìn)一步揭示山茱萸萜類物質(zhì)生物合成途徑的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突