三七中花色苷合成結構基因的克隆及表達分析

熊 高，王 勇，胡永媛，黃天衛(wèi)，魏富剛，高麗芳，陳中堅*

1.文山學院文山三七研究院，云南 文山 663099

2.文山苗鄉(xiāng)三七股份有限公司，云南 文山 663099

花色苷屬于類黃酮化合物，是植物的主要次級代謝產(chǎn)物之一，它不僅可保護植物免受生物和非生物脅迫[1-2]，還對人類的腦健康、抗氧化及抗炎抗癌等方面發(fā)揮作用[3-5]。因此，培育花色苷含量高的品種一直是植物育種工作中的方向之一?；ㄉ帐怯苫ㄉ赵吞擒战Y合而成的糖苷合成物，其生物合成涉及一系列負責編碼花色苷合成關鍵酶的結構基因的表達參與，這些結構基因構成了一條植物經(jīng)典的花色苷代謝路徑，是花色苷生物合成的基礎[6]。在該代謝路徑[7]中：首先，以丙二酰CoA和香豆酰CoA為原料，在查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）催化下形成4’5’7’-三羥基黃烷酮，然后經(jīng)黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）作用下形成二氫山柰酚（dihydrokaempferol，DHK）；此時，DHK可作為中間產(chǎn)物在類黃酮3’-羥化酶（flavonoid 3’-hyroxylase，F(xiàn)3’H）和類黃酮3’,5’-羥化酶（flavonoid 3’，5’-hyroxylase，F(xiàn)3’5’H）催化下進入不同的分支途徑，分別形成二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ）和二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHM）；其次，3個分支形成的物質在DFR基因編碼的二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reduetase，DFR）催化下形成原花色素，再經(jīng)花色素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）作用轉化成花色苷元，由此形成了花色苷的基本骨架。最后，經(jīng)過尿苷二磷酸-葡萄糖-類黃酮-3-葡糖基轉移酶（UDP-glucose 3-O-flavonoid glucosyltransferase，UFGT）催化生成花色苷元3-O-葡萄糖苷，再由一系列的修飾反應形成穩(wěn)定的花色苷物質。

植物中花色苷合成結構基因表達水平的改變可以直接影響花色苷的合成。以模式植物擬南芥為代表，通過對CHS、CHI、F3H、F3’H、DFR等基因座位進行突變，能影響種皮及莖、葉組織中紫色花色苷的累積[8-10]；同樣，基于RNAi的基因沉默或CRISPR/Cas9的基因敲除技術在水稻、大豆、草莓、牽?；ㄖ袑@些基因進行功能研究，也顯示了結構基因的表達水平與花色苷合成的相關性[11-16]；此外，在玫瑰花中，UFGT基因在各組織中的表達模式與花色苷累積一致，該基因的高量表達是玫瑰花顏色鮮艷的基礎[17]?？傊?，植物花色苷合成的基礎是代謝路徑中結構基因表達的結果，這些基因的改變可以調節(jié)花色苷的含量而影響植物組織或器官的顏色。

三七作為我國著名的中藥材，除含有眾所周知的皂苷成分外，也具有花色苷；花色苷含量在三七根部累積可形成紫色塊根，紫根三七在生態(tài)適應和藥效方面均優(yōu)于普通三七[18]，高花色苷含量特性的紫根三七一直是優(yōu)質三七新品種的選育目標。然而，參與三七花色苷合成的相關結構基因并未被克隆報道，尚缺乏關于對三七花色苷合成分子基礎的認識。本研究通過生物信息學分析及同源克隆技術獲得三七花色苷合成結構基因，利用qRT-PCR方法研究這些基因的時空表達模式及與紫根三七表型的關聯(lián)性，以期明確參與該性狀形成的關鍵結構基因，為進一步探究該類基因的功能機制奠定基礎，對深入理解三七花色苷合成的遺傳本質及相關種質資源創(chuàng)新具有重要意義。

1 材料與試劑

供試三七（2年生）采集于文山三七研究院和文山苗鄉(xiāng)三七科技公司建立的三七種質資源圃內(nèi)（文山州丘北縣境內(nèi)），包括花蕾期（8月初）三七的花和開花期（8月中）三七的花、花軸、葉、莖、剪口、主根、須根等各組織，以及結果期（10月）三七的紫根（文院紫七1號）和黃白根。以上組織經(jīng)去離子水清洗后，立即放于液氮中冷凍，-80 ℃保存。

2 方法

2.1 引物設計與合成

下載擬南芥、水稻、棉花等物種中已鑒定的花色苷合成結構基因序列，使用BLAST在三七基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得三七花色苷合成結構基因的預測序列，利用軟件Primer 5.0設計引物（表1），由北京擎科生物公司合成。

表1 基因克隆和定量引物信息Table 1 Primers of gene cloning and quantitative PCR

2.2 基因克隆

嚴格按照試劑盒說明書操作，分別采用植物DNA提取試劑盒提取三七葉片DNA，利用百泰克RNA提取試劑盒提取三七各組織RNA，并反轉錄為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠迷O計的特異性引物分別擴增三七花色苷合成結構基因（PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H1、PnF3’H2、PnANS、PnUFGT）ORF的全長序列，將PCR產(chǎn)物進行檢測和膠回收，與載體pMD19-T進行連接，轉化，篩選陽性單克隆測序。測序由北京擎科生物公司合成。

2.3 生物信息學分析

利用在線軟件GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結構；使用SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）和CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi）確定保守結構域。在三七基因組數(shù)據(jù)庫中截取克隆獲得的花色苷基因翻譯起始位點（ATG）上游2000 bp的啟動子序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psbugent.be/webtools/plantcare/html/）分析啟動子反應調控元件。采用MEGA7.0軟件的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）程序對不同物種的花色苷基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.4 總花色苷提取和含量測定

參考Fuleki等[19]的方法進行花色苷含量的提取和測定，略有改動。取0.5 g新鮮三七的根組織，用液氮研磨成粉末，加入5 mL鹽酸-甲醇提取液（pH 3.0），30 ℃條件下溫和震蕩抽提2 h，然后7000 r/min離心10 min，吸取上清液作為花色苷提取液，在4 ℃下避光保存?zhèn)溆?。? mL花色苷提取液，分別加pH 1.0緩沖溶液和pH 4.5的緩沖溶液9 mL，室溫條件下平衡40 min，以蒸餾水為空白對照，分別在波長530 nm[20]和700 nm波長處測定吸光度A530、A700。按以下公式進行計算：

M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的平均摩爾消光系數(shù)；L為比色皿的寬度，取1 cm；mf為取樣量。

2.5 熒光定量表達分析

根據(jù)三七花色苷合成結構基因克隆序列設計qRT-PCR引物（表1），分別以三七各組織cDNA為模板，以三七Actin 2為內(nèi)參基因，qRT-PCR檢測這些基因在不用組織中的表達水平，3次重復，基因表達水平歸一化處理，使用t檢驗進行統(tǒng)計學分析。熱圖和柱形圖分別使用R包（pheatmap）和Graphpad Prism 6進行繪制。

3 結果與分析

3.1 三七花色苷結構基因的克隆及生物信息學分析

基于植物經(jīng)典的花色苷代謝路徑，利用其他物種中鑒定的花色苷合成結構基因序列，在三七全基因組數(shù)據(jù)中進行BLAST檢索，除F3’5’H基因未檢索到，其他類型的花色苷基因均鑒定到相應的同源基因。根據(jù)預測序列設計引物，分別以三七的DNA以及花或根的cDNA為模板，克隆獲得6類共8個三七花色苷合成結構基因，分別命名為PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H1、PnF3’H2、PnANS和PnUFGT（GenBank登錄號MN520443-MN520450），僅DFR基因未克隆到，圖1-A為克隆擴增產(chǎn)物電泳圖。這8個基因的外顯子數(shù)在1～4個，其中PnCHS2為單外顯子，PnCHI外顯子數(shù)多達4個；ORF長度在600～1500 bp，最長的PnF3’H1達1575 bp，最短的PnCHI為672 bp（圖1-B）。

保守功能域分析顯示，PnCHS1/2具有查耳酮/二苯乙烯合成酶N端和C端（Chal_sti_synt_N，Chalconeand stilbene synthases，N-terminal domain；Chal_sti_synt_C，chalcone and stilbene synthases，C-terminal domain）結構域，PnCHI含有一個查耳酮異構酶（chalcone isomerase）家族結構域，PnF3H和PnANS包含一個嗎啡合成N端的非血紅素加氧酶家族（DIOX_N，non-haem dioxygenase in morphine synthesis N-terminal）結構域和一個2-酮戊二酸和二價鐵離子依賴型的加氧酶家族[2OG-Fe(Ⅱ) Oxygenase superfamily，2OG-FeII_Oxy]結構域，PnF3’H1/2具有細胞色素P450結構域，PnUFGT含有一個UDPGT結構域（圖1-B）?？傊?，本實驗鑒定到的8個三七花色苷合成結構基因均包含有植物花色苷合成相關功能域。

圖1 三七花色苷生物合成結構基因的克隆與分析Fig.1 Cloning and analysis of structure gene of anthocyanin biosynthesis in Panax notoginseng

3.2 三七花色苷結構基因系統(tǒng)進化分析

采用MEGA7.0軟件對三七、擬南芥、水稻、棉花、煙草和馬鈴薯等物種的花色苷合成結構基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示每一類型的基因都各自聚在一起，由于F3H與ANS關系最近，聚為同一支，最終形成5個分支，且每一類型的基因同源性較高（圖2），說明三七花色苷合成結構基因與各物種之間具有較高保守性，這表明它們在進化過程中可能功能保守。

不是嗎，無限無知的宇宙，似乎天然就內(nèi)在具有一種毫不猶豫的“生命指向”，在一切可能的極度艱辛中一旦有縫隙，就會“石上開花”、生命問世。沒有生命的宇宙無法證明其自身的“在”與“不在”，因此，從植物到微生物到昆蟲到動物等等，生命以它層層遞進的宏大與渺小，讓這不被思索的無限廣宇在知與不知的替換中，得到思索追溯。

圖2 三七花色苷生物合成結構基因進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of structure gene of anthocyanin biosynthesis in P.notoginseng

3.3 三七花色苷結構基因啟動子順式作用元件分析

采用PlantCARE在線軟件分析顯示，8個三七花色苷合成結構基因的啟動子序列含有多種類型的順式調控元件，其中光響應順式元件和轉錄因子MYB/MYC響應元件均存在于這些基因的啟動子區(qū)域中，且數(shù)量最多，說明這些基因的轉錄表達主要受光照和調控因子MYB/MYC的影響；另外，激素響應元件（脫落酸、生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、水楊酸和乙烯）、抗逆性相關調控元件（防御、干旱、厭氧）和種子特異性元件呈不同情況分布于不同基因上游序列中（表2）。

表2 啟動子重要順式作用元件數(shù)量分析Table 2 Analysis on number of important cis regulatory elements of promoter

3.4 三七花色苷結構基因的組織表達模式

利用qRT-PCR技術，分析三七開花期（8月）7個不同組織中8個基因的表達模式，結果顯示，這些基因的表達特征可分為2類，一是主要在花中高量表達的基因，為PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H和PnF3’H2；二是主要在根部高量表達的基因，為PnF3’H1、PnANS、PnUFGT，其中剪口中主要是PnANS和PnUFGT，主根中則以PnF3’H1為主；此外，PnF3H和PnANS在莖中以及PnF3’H2在葉中存在少量表達（圖3）。

為了解5個花特異性高表達基因在花期不同階段的表達情況，對這些基因在三七的花蕾期和開花期進行表達水平檢測，結果顯示，PnCHS1、PnCHI、PnF3H和PnF3’H24個基因主要在花蕾期中顯著高表達，而PnCHS2基因表現(xiàn)為在開花期顯著高表達（圖4）。

圖3 三七花色苷生物合成結構基因在多組織中的表達譜分析Fig.3 Expression profiling of the structure gene of anthocyanin biosynthesis in different tissues of P.notoginseng

圖4 PnCHS1、PnCHS2、PnCHI、PnF3H、PnF3’H2在不同花期的相對表達量Fig.4 Relative expressions of PnCHS1,PnCHS2,PnCHI,PnF3H and PnF3’H2 at different flowering stages

3.5 三七花色苷結構基因在紫根三七中的表達分析

對系統(tǒng)選育法選育的“文院紫1號”（根部紫色）品種[21]，和普通型黃白根三七（圖5-A）的總花色苷分析發(fā)現(xiàn)，文院紫七1號材料的總花色苷顯著增加，約有3倍（圖5-B），說明三七根系紫色主要是花色苷累積形成，這與前人的研究結果相似[20]。為了研究參與紫根性狀形成的關鍵花色苷合成結構基因，通過qRT-PCR檢測3個根部表達基因在三七紫根和黃白根中的表達，結果顯示PnF3’H1和PnUFGT在紫根中顯著上調表達（圖5-C），說明三七紫根中花色苷累積與它們的表達水平相關，PnF3’H1和PnUFGT可能是參與該性狀形成的關鍵結構基因。

4 討論

圖5 紫根與黃白根三七表型 (A)、總花色苷含量 (B) 及基因PnF3’H1、PnANS、PnUFGT表達量 (C) 的分析Fig.5 Analysis of P.notoginseng (A),total anthocyanin content (B) and expression (C) of PnF3’H1,PnANS,and PnUFGT in purple root and yellow-white root

本研究以中藥材三七為材料，克隆鑒定了6類共8個三七花色苷合成結構基因，其中三七CHS和F3’H各2個，這與其他物種中該類型基因可分 離出多個基因的情況相似[22-24]。對未克隆成功的三七DFR基因預測序列分析發(fā)現(xiàn)，其翻譯起始位點區(qū)域的GC含量高，推測可能會形成復雜的二級結構導致該基因ORF序列較難克隆。另外，在對三七全基因組數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索時，未發(fā)現(xiàn)可催化二氫山奈酚為二氫楊梅素的3’,5’-羥化酶編碼基因F3’5’H的三七同源基因，暗示三七的花色苷合成可能不涉及以二氫楊梅素為底物的途徑。

結構域是蛋白質行使功能的重要區(qū)域，被稱作蛋白質功能單元。植物中，CHS蛋白的查耳酮/二苯乙烯合成酶結構域，具有將3分子丙二酰CoA和1分子的4-對香豆酰-CoA縮合形成柚皮素查耳酮的功能[25]。CHI的查耳酮異構酶結構域，行使催化雙環(huán)柚皮素查耳酮為三環(huán)2S-二氫基黃烷酮的作用[26]。而2OG-FeII_Oxy結構域主要以亞鐵離子為活性位點輔因子，2OG為共底物，行使將二氫基黃烷酮氧化為二氫黃酮類的功能[27-28]。此外，細胞色素P450結構域，廣泛存在于含亞鐵血紅素的單加氧酶超家族中，類黃酮合成途徑里主要具有將二氫山柰酚羥基化形成二氫槲皮素[29-30]，以及UDP-葡萄糖醛酸轉移酶結構域行使了糖苷化作用[31]。通過結構功能域分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的三七花色苷相關基因，均含有參與植物花色苷合成的相關蛋白質功能單元（圖1-B）；同時，進化分析顯示這些基因的氨基酸序列與其他物種的保守性高（圖2）。以上說明三七花色苷結構基因極有可能與其他物種的已知基因具有類似功能。

在分析啟動子順式作用元件時發(fā)現(xiàn)，三七花色苷結構基因上游存在多種環(huán)境因子的作用元件，其中光信號結合元件數(shù)量最多。前人的研究顯示，在擬南芥、紫蘇、矮牽牛、葡萄等多種植物中花色苷結構基因都受到光的調控[32-35]；另外，GA、JA、ABA等激素及干旱條件下也有關于對相關結構基因誘導表達，繼而影響花色苷合成的研究[36-37]。因此，筆者推測三七花色苷合成結構基因可受外界環(huán)境信號調控來影響花色苷的合成，而光信號是最重要的環(huán)境因子之一。此外，三七花色苷結構基因啟動子中均鑒定到轉錄因子MYB/MYC結合的順式作用元件。MYB轉錄因子含有1～4個重復單元的MYB結構域，是植物中最大的轉錄因子家族之一；MYC轉錄因子屬于bHLH類轉錄因子家族，含有bHLH保守結構域。目前，MYB蛋白和bHLH蛋白作為主要的調節(jié)基因參與類黃酮物質的生物合成已在多種植物中得到研究[11,38]。說明三七中轉錄因子MYB/MYC可能會通過結合相應的順式元件來對花色苷相關基因進行轉錄調控，潛在的作用機制是未來研究的重點。

花色苷合成基因的表達特性往往與其功能密切關聯(lián)[9,11-13,15]。根據(jù)三七花色苷合成結構基因的表達模式，推測它們主要參與了三七在花和根中花色苷的合成；同時對花不同發(fā)育時期的表達檢測發(fā)現(xiàn)，相關結構基因主要在花蕾期高量表達，暗示三七花的花色苷合成主要在前期階段，與滇牡丹的情況類似[23]。另外，PnF3H和PnANS在莖中也有表達，很可能是三七紫莖（花色苷含量高）形成的關鍵結構基因，不過仍需進一步研究確認。值得注意的是，同一類基因PnF3’H1與PnF3’H2具有相反的表達模式，PnF3’H1主要參與了根部花色苷合成，而PnF3’H2在花和葉中起作用，這與葡萄中4個F3’H表現(xiàn)出不同表達模式類似[22]，暗示這些基因可能經(jīng)歷基因復制事件后發(fā)生了功能分化。此外，基因表達關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)PnF3’H1和PnUFGT在高花色苷特性的紫根中高量表達，推測它們可能是紫根中花色苷形成的關鍵結構基因，這可為進一步明確紫根中高花色苷形成的分子基礎提供了理論支撐，也為針對這2個基因開發(fā)基因特異性分子標記開展紫根性狀的分子輔助育種奠定了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突