苦參堿固體脂質(zhì)納米粒的制備及其體外透皮研究

付麗娜，趙 寧，李偉澤，韓文霞，李 健，楊 婷，楊黎彬

西安醫(yī)學院藥學院，陜西 西安 710021

苦參堿（matrine）是來源于豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAir.的一種生物堿類天然藥物， 具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、抗心律失常、抑制中樞神經(jīng)和調(diào)節(jié)免疫力等藥理作用[1-7]。目前在臨床上廣泛應用的苦參堿制劑主要有注射劑、膠囊劑、片劑和栓劑等[8]。但是，傳統(tǒng)苦參堿制劑普遍存在半衰期短、需多次給藥，易造成肝腎聚集中毒等問題；并且由于苦參堿的苦味強烈持久，患者用藥依從性差[9-10]。這些限制了苦參堿口服制劑與注射制劑的廣泛應用，因此，開發(fā)苦參堿的外用緩釋給藥系統(tǒng)具有重要意義。固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是粒徑為納米級別的一種新型實體骨架的微粒給藥系統(tǒng)，可作為大分子、小分子藥物的載體，具有良好的促進藥物透皮吸收作用和皮膚貯庫效應，能夠增加藥物的穩(wěn)定性，可提高藥物對皮膚黏膜的穿透性而提高其生物利用度，且藥物泄露問題較少，可通過透皮、口服、注射與肺部等多途徑給藥，同時其成本低與利于大規(guī)模的生產(chǎn)，是微乳、脂質(zhì)體、聚合物納米粒等的替代品[11-13]，因此SLN具有良好的應用前景。據(jù)此，本實驗研究了以微乳-低溫固化法制備苦參堿固體脂質(zhì)納米粒（matrine solid lipid nanoparticles，MA-SLN）的成型工藝及其相關藥劑學性能，并通過體外透皮給藥考察了MA-SLN透皮給藥的釋藥行為，從而為苦參堿提供了一種基于納米微粒的新型外用緩釋給藥系統(tǒng)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Verios 460掃描電子顯微鏡（SEM），美國FEI公司；JEM-2100F透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會社；X’Pert PRO X-射線衍射儀（XRD），荷蘭帕納科公司；ZEN-3600激光粒度儀，英國馬爾文公司；Quintix224-1 CN Sartorius分析天平，賽多斯科學儀器北京有限公司；Stare系統(tǒng)DSC差式掃描量熱儀（DSC），瑞士梅特勒-托利多公司；Allegra 64R Centrifuge離心機，美國Beckman公司。

1.2 藥材與試劑

苦參堿對照品，中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)110805-201803；苦參堿，質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號XC20190410，西安小草植物科技有限責任公司；大豆卵磷脂，上海太偉藥業(yè)有限公司；硫酸魚精蛋白，質(zhì)量分數(shù)99%，Sigma公司；單硬脂酸甘油酯，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司；普朗尼克F-68，天津市科密歐化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，批號20191003，購自西安交通大學醫(yī)學部。所有動物實驗遵循陜西省有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 MA-SLN的制備

采用微乳-低溫固化法[14-15]制備MA-SLN。稱取苦參堿50 mg，適量單硬脂酸甘油脂和大豆卵磷脂，并加入5 mL無水乙醇作為油相；另取0.2 g普朗尼克F-68，加入一定量純化水作為水相；油相與水相分別置于65 ℃水浴中，使溶解；并于一定轉(zhuǎn)速條件下將水相緩慢加入油相，攪拌乳化，再高速勻質(zhì)4 min后將乳化體系分散到冷水中，300 r/min條件下攪拌固化20 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得MA-SLN。同法不加苦參堿，制備空白脂質(zhì)納米粒（blank solid lipid nanoparticles，B-SLN）。

2.2 苦參堿檢測方法的建立

2.2.1 供試品溶液的制備 取一定量MA-SLN于2 mL的離心管中，加入同體積10 μg/mL魚精蛋白溶液，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，即得。

2.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（85∶15）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量為20 μL；檢測波長220 nm。

2.2.3 線性關系考察 精密稱取苦參堿對照品，加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度分別為20、30、60、100、200、400 μg/mL的對照品溶液，分別標為1～6號，取上述各對照品溶液過0.22 μm微孔濾膜，取濾液20 μL用HPLC按照“2.2.2”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標（X），進行線性回歸，計算得回歸方程為Y＝6.649 2X＋100.99，r2＝0.999 8，表明苦參堿在20～400 μg/mL時質(zhì)量濃度與峰面積線性關系良好。

2.2.4 專屬性考察 取苦參堿對照品溶液，B-SLN和MA-SLN，其中B-SLN和MA-SLN按照2.2.1項下方法處理，并按“2.2.2”項下色譜條件檢測，結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果顯示，該色譜條件下，色譜峰分離度好，同時峰形穩(wěn)定，無干擾。

圖1 苦參堿對照品 (A)、B-SLN (B) 和MA-SLN (C) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of matrine reference substance (A),B-SLN (B) and MA-SLN (C)

2.2.5 精密度試驗 取1、3、6號對照品溶液，按“2.2.2”項色譜條件測定峰面積，每天0、2、4、6、8、10 h進樣，連續(xù)進樣3 d，測定峰面積，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果其日間和日內(nèi)精密度RSD分別為1.63%和1.87%。

2.2.6 重復性試驗 精密量取同一批次MA-SLN 6份，按照“2.2.1”項下處理后，按“2.2.2”項下色譜條件進樣測定峰面積，計算苦參堿質(zhì)量濃度，RSD值為1.76%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 將同一批次供試品溶液室溫下放置，分別于0、3、6、12、24、48 h取20 μL注入HPLC測定，苦參堿峰面積的RSD為0.92%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收率試驗 取9份B-SLN 0.5 mL，置于2 mL離心管內(nèi)，分別加入80、100、120 μg/mL 苦參堿對照品溶液0.5 mL，再按2.2.1項下方法加10 μg/mL魚精蛋白溶液1 mL，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，按照“2.2.2”項下色譜條件測定，測得平均加樣回收率為99.77%，RSD為1.87%。

2.3 MA-SLN處方篩選

2.3.1 MA-SLN包封率測定 采用魚精蛋白凝聚法測定包封率[16]，精密吸取MA-SLN樣品0.8 mL，置于2 mL離心管，加10 μg/mL魚精蛋白溶液0.8 mL，混勻，靜置3 min，于10 ℃、13 000 r/min條件下離心60 min，取上清液1 mL置于10 mL量瓶中，定容，過0.22 μm微孔濾膜，取20 μL按照“2.2.2”項下色譜條件測定苦參堿的量，計算包封率。

2.3.2 粒徑和ζ電位的測定 取MA-SLN用蒸餾水稀釋至10倍，使溶液呈現(xiàn)半透明乳光色，用激光粒度儀測定其粒徑與ζ電位。

2.3.3 評價指標的確定 包封率、粒徑和ζ電位為SLN質(zhì)量控制的重要指標。因此，本實驗以包封率、粒徑和ζ電位為MA-SLN處方篩選的評價指標。其中，包封率是納米粒質(zhì)量控制的一個重要的因素，也是提高藥物治療效果，減少藥物劑量降低不良反應的關鍵因素。因此，設定包封率在0～100%內(nèi)，每增大10%，加1分，滿分10分，占比60%；SLN的粒徑一般為50～1000 nm，粒徑越小，納米粒的透皮吸收效果越好，根據(jù)實驗過程中不同工藝所測MA-SLN的粒徑范圍，設定以490 nm為基數(shù)，減小40 nm，加1分，滿分10分，占比20%；ζ電位在一定程度上反應粒子的荷電情況，對維持體系的穩(wěn)定性有很大影響，當微粒表面電位的絕對值大于30 mV時，微粒間由于存在較大的靜電斥力而有利于制劑穩(wěn)定性的提高并使粒徑保持均勻，因本實驗所制備的MA-SLN帶負電荷，因此設定，ζ電位在-60～0 mV，比0 mV小6 mV，加1分，滿分10分，占比20%。將評分進行綜合加權處理，并以處理后的綜合得分為評價指標。

2.3.4 正交試驗設計與結(jié)果 根據(jù)前期單因素中各因素對實驗結(jié)果的影響，選擇單硬脂酸甘油酯（A）、卵磷脂（B）的用量和油水兩相比例（C）進行處方優(yōu)化考察，以綜合得分為評價指標，采用L9(34)表進行正交設計實驗，正交試驗的因素水平、實驗設計與結(jié)果見表1，方差分析見表2。由表1、2可知，各因素對MA-SLN包封率和粒徑的綜合的影響大小依次為A＞B＞C，單硬脂酸甘油酯（A）和卵磷脂（B）對MA-SLN包封率和粒徑有顯著影響，根據(jù)正交表直觀分析，選擇最佳工藝條件為A2B3C2，即MA-SLN的最佳制備處方為苦參堿50 mg、單硬脂酸甘油酯0.15 g、大豆磷脂0.3 g、普朗尼克F-68 0.2 g、油相5 mL和水相體積10 mL，制得的MA-SLN的包封率較高、粒徑小、ζ電位合適。

表1 L9(34)正交試驗設計及結(jié)果 ( ±s,n = 3)Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test ( ±s,n = 3)

表1 L9(34)正交試驗設計及結(jié)果 ( ±s,n = 3)Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test ( ±s,n = 3)

試驗號 A/g B/g C D (誤差) 包封率/% 包封率得分 粒徑/nm 粒徑得分 ζ電位/mV ζ電位得分 綜合得分1 0.10 (1) 0.10 (1) 1∶1 (1) (1) 52.07±1.36 5.00 361.23±8.49 4.00 -29.97±1.87 5.33 4.87 2 0.10 (1) 0.20 (2) 1∶2 (2) (2) 52.40±1.23 5.00 210.23±6.92 7.67 -39.17±1.17 7.00 5.93 3 0.10 (1) 0.30 (3) 1∶3 (3) (3) 51.93±1.42 5.00 219.70±9.83 7.33 -40.83±1.83 7.33 5.93 4 0.15 (2) 0.10 (1) 1∶2 (2) (3) 58.60±4.07 5.33 207.97±9.85 7.67 -37.67±1.12 7.00 6.13 5 0.15 (2) 0.20 (2) 1∶3 (3) (1) 58.70±3.58 5.67 198.33±8.85 8.00 -39.60±2.29 7.33 6.47 6 0.15 (2) 0.30 (3) 1∶1 (1) (2) 58.50±3.12 5.67 193.67±7.09 8.00 -38.73±1.65 7.00 6.40 7 0.20 (3) 0.10 (1) 1∶3 (3) (2) 43.67±2.43 4.00 319.87±7.01 5.00 -30.77±1.69 5.67 4.53 8 0.20 (3) 0.20 (2) 1∶1 (1) (3) 49.87±2.12 4.67 256.63±8.95 6.33 -33.20±1.90 6.00 5.22 9 0.20 (3) 0.30 (3) 1∶2 (2) (1) 59.23±2.21 5.67 234.43±9.40 7.00 -36.46±1.78 6.33 6.07 K1 16.73 15.53 16.49 17.41 K2 19.00 17.62 18.13 16.86 K3 15.82 18.40 16.93 17.28 R 3.18 2.87 1.64 0.55 優(yōu)選方案 A2 B3 C2

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance

2.4 MA-SLN制備工藝優(yōu)化

工藝優(yōu)化的評價指標和評判方法同“2.3.3”項。研究表明，乳化體系的形成過程中需要充分的乳化速度和乳化時間才能保證乳化劑的效用[17]。因此，本實驗用單因素實驗法考察了不同攪拌時間、攪拌速度與不同稀釋相體積對MA-SLN包封率、粒徑和ζ電位的影響，按照“2.3.3”項將實驗結(jié)果進行加權處理得出綜合評分，最后根據(jù)綜合評分篩選出最優(yōu)成型工藝。

2.4.1 不同攪拌速度對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項下確定的最優(yōu)處方，在攪拌時間30 min，分散相體積30 mL的條件下，考察不同攪拌速度的MA-SLN綜合評分的影響。結(jié)果見表3。

2.4.2 不同攪拌時間對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項下確定的最優(yōu)處方，在攪拌速度1000 r/min，分散相體積30 mL的條件下，考察不同攪拌時間的MA-SLN的綜合評分的影響。結(jié)果見表4。

表3 攪拌速度對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of stirring speed on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表3 攪拌速度對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 3 Effect of stirring speed on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

攪拌速度/(r·min-1) 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 600 43.77±1.30 4.00 387.70±5.22 3.00 -18.07±1.42 3.33 3.67 800 51.67±0.96 5.00 361.23±7.49 4.00 -29.33±0.93 5.33 4.87 1000 56.77±3.65 5.33 215.47±5.76 7.33 -41.20±1.28 7.33 6.13 1200 53.83±1.27 5.00 208.10±4.83 7.67 -42.40±0.95 7.67 6.07 1400 51.83±1.65 5.00 211.60±6.74 7.67 -38.17±1.56 7.00 5.93

2.4.3 不同分散相體積對MA-SLN包封率、粒徑、ζ電位的影響 按照“2.3.4”項下確定的最優(yōu)處方，在攪拌速度1000 r/min，攪拌時間30 min的條件下，考察不同分散相體積的MA-SLN的綜合評分的影響。結(jié)果見表5。

表4 攪拌時間對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of stirring time on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表4 攪拌時間對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 4 Effect of stirring time on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

攪拌時間/min 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 10 26.13±0.67 2.00 396.53±6.16 3.00 -16.95±2.33 3.33 2.47 20 37.63±1.71 3.00 338.07±9.12 4.33 -29.60±2.05 5.33 3.73 30 58.27±4.85 5.33 213.27±8.89 7.67 -42.27±1.50 7.67 6.27 40 49.83±2.27 4.67 258.17±10.40 6.33 -31.80±2.01 5.67 5.20 50 44.86±1.70 4.00 343.53±5.03 4.00 -25.80±2.40 4.67 4.13

表5 分散相體積對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of dispersed phase volume on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

表5 分散相體積對MA-SLN綜合評分的影響 ( ±s,n = 3)Table 5 Effect of dispersed phase volume on MA-SLN comprehensive score ( ±s,n = 3)

分散相體積/mL 包封率/% 包封率評分 粒徑/nm 粒徑評分 ζ電位/mV ζ電位評分 綜合評分 15 25.03±1.50 2.00 418.07±9.01 2.33 -16.27±1.29 3.00 2.27 25 37.23±1.79 3.00 327.57±8.92 4.67 -28.53±2.06 5.33 3.80 35 51.26±2.46 4.67 248.60±7.13 6.67 -37.83±1.47 7.00 5.53 45 57.33±4.67 5.33 197.20±4.35 8.00 -37.23±1.46 6.67 6.13 55 51.67±0.97 5.00 274.53±7.69 6.00 -34.90±1.48 6.33 5.47

由表4、5可知，當攪拌速度低于800 r/min時，由于無法為乳化體系的形成提供足夠的能量因而MA-SLN成型與性能不佳，而攪拌速度過高（大于1000 r/min）會由于速度過大而增加微粒的動能、增大碰撞合并機率而影響微粒制劑的成型。乳化體系的形成是油相由整體逐漸變?yōu)槲⒘５臐u進過程，因此需要一定的時間，當攪拌時間低于30 min時導致乳化不足而粒徑過大，且微粒的形狀不規(guī)整；而攪拌時間過長，高于30 min則由于增大微粒碰撞、合并機率而影響成型與粒徑。研究表明，稀釋相體積對MA-SLN的粒徑影響較大，其原因是當稀釋相體積過小時，單位體積內(nèi)微粒的濃度增大，因此增大了微粒的碰撞機率增加聚集程度而使粒徑變大；稀釋相體積過大時，如大于45 mL時，則由于微粒稀釋程度較大，得到的分散液固體含量過低，增加藥物泄露且后續(xù)處理困難。因此，綜合分析得到最佳制備工藝為攪拌速度為1000 r/min、攪拌時間為30 min與稀釋相相體積為45 mL。

2.5 MA-SLN制備工藝和處方的確定

按照上述處方和工藝考察結(jié)果制備MA-SLN。稱取苦參堿50 mg，單硬脂酸甘油脂0.15 g和大豆卵磷脂0.3 g，并加入5 mL無水乙醇作為油相；另取0.2 g普朗尼克F-68，加入純化水10 mL作為水相；油相與水相分別置于65 ℃水浴中，使溶解；并于1000 r/min條件下將水相緩慢加入油相，攪拌乳化30 min，高速勻質(zhì)4 min后將乳化體系分散到45 mL冷水中，300 r/min條件下攪拌固化20 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得，于4 ℃存放，備用。

制備6批MA-SLN，其外觀均勻一致無差異，MA-SLN粒徑密度分布圖和電勢分布圖見圖2。測得其包封率為（56.12±0.82）%；平均粒徑為 （196.31±6.26）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.184±0.020；ζ電位為（-37.18±2.36）mV。表明本實驗優(yōu)化的制劑處方與制備工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性高。研究表明[18]，當微粒表面電位的絕對值大于30 mV時，微粒間由于存在較大的靜電斥力而有利于制劑穩(wěn)定性的提高并使粒徑保持均勻，因此，MA-SLN具有較高的穩(wěn)定性。

2.6 MA-SLN藥劑學性質(zhì)考察

2.6.1 MA-SLN形態(tài)觀察 將MA-SLN樣品適量，按照SEM和TEM的常規(guī)操作處理后，觀察其外觀形態(tài)結(jié)構。結(jié)果如圖3所示，MA-SLN為規(guī)整平滑的均勻?qū)嶓w骨架球狀結(jié)構，球體表面無苦參堿的規(guī)則晶體析出、內(nèi)部顯示均勻一致，表明苦參堿與SLN的骨架材料相容性良好而使苦參堿在MA-SLN呈現(xiàn)均勻分布，這種分布行為利于提高藥物的穩(wěn)定性和載藥量。

圖2 MA-SLN粒徑密度分布 (A) 和電勢分布 (B)Fig.2 Particle size distribution by intensity (A) and ζ potential distribution (B)

圖3 MA-SLN掃描電鏡圖 (×2400,A) 和透射電鏡圖 (×6000,B)Fig.3 SEM image (× 2400,A) and TEM images (× 6000,B) of MA-SLN

2.6.2 苦參堿包裹情況考察

（1）DSC掃描：分別取適量MA-SLN、B-SLN、苦參堿粉末、苦參堿與SLN物理混合物用DSC掃描檢測苦參堿及載體特征峰的變化情況。DSC掃描條件為99.99% N2，升溫速度20 ℃/min，溫度范圍0～280 ℃，結(jié)果如圖4。由圖4可知，苦參堿在70～78 ℃出現(xiàn)特征峰，B-SLN在55 ℃左右出現(xiàn)特征峰，物理混合物苦參堿＋SLN分別出現(xiàn)了SLN和苦參堿的特征峰；而將苦參堿制成MA-SLN后，苦參堿的特征峰消失，僅顯示SLN的特征峰。

圖4 MA-SLN的DSC掃描分析圖Fig.4 Analysis diagram of MA-SLN by DSC scan

（2）XRD分析：用XRD測定苦參堿粉末、MA-SLN和B-SLN。樣品在45 kV、40 mA的Cu-Kα輻射下進行分析，測試范圍5°～90°，掃描速率為 2°/min。掃描結(jié)果見圖5。由圖5可知，純藥物苦參堿的XRD譜圖在6°～25°掃描角度之間顯示出許多尖峰，表明苦參堿具有高結(jié)晶性，而MA-SLN則沒有了藥物苦參堿的主峰，結(jié)晶度降低；與B-SLN相比，MA-SLN的主峰沒有移動，整體強度變化不大，在7°掃描角度處強度略有提高，這可能是由于脂質(zhì)納米粒中苦參堿的加入，導致了包載苦參堿的SLN結(jié)晶度發(fā)生變化。結(jié)合DSC掃描結(jié)果推斷，苦參堿可被充分包裹到SLN中的實體骨架中，且苦參堿與SLN骨架材料相容性良好。

2.7 MA-SLN體外釋藥特點

圖5 MA-SLN的XRD掃描分析圖Fig.5 Analysis diagram of MA-SLN by XRD

采用透析法考察MA-SLN的釋藥特點，精密稱取MA-SLN 2 mL，放入截留相對分子質(zhì)量為2500的透析袋中，扎緊，置于50 mL的生理鹽水溶液中，調(diào)整介質(zhì)37 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min進行體外透析試驗，取樣時間為1、2、3、4、6、9、12、18、24 h，取樣量為3 mL，并補充同溫等量的生理鹽水，同法以相同質(zhì)量濃度的苦參堿水溶液作為對照，計算累積釋放率。結(jié)果見圖6。由圖6可知，苦參堿水溶液中苦參堿可快速釋藥，并在6 h后達基本釋放完藥物到平衡。而MA-SLN較苦參堿水溶液體外透析釋藥過程緩慢，在24 h后才逐漸達到平衡，因此MA-SLN體外釋藥具有緩釋效果。

圖6 苦參堿水溶液和MA-SLN體外釋放曲線 ( ±s,n = 3)Fig.6 In vitro release of WMA and MA-SLN ( ±s,n = 3)

2.8 MA-SLN經(jīng)皮滲透研究

取昆明種小鼠，脫頸處死后剝離皮膚，剪凈皮膚上的毛，小心剔除皮下黏膜膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗干凈后切成小塊（3.0 cm×3.0 cm），-20 ℃冷凍保存，1周內(nèi)使用。

將角質(zhì)層向上固定于立式雙室擴散池上，在接收池加入7 mL生理鹽水作為接收液，保持恒溫在（32.0±0.5）℃，攪拌速度300 r/min；在供給池中分別加入相同苦參堿量的MA-SLN和苦參堿水溶液。分別在1、2、3、4、6、9、12、18、24 h取接收液0.5 mL，并補加0.5 mL新鮮接收液，將取得樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜。按照“2.2.2”項下色譜條件測定苦參堿含量，按公式計算各時間點苦參堿累積透過量（ΔM）[19]。

C為接收液中的藥物質(zhì)量濃度（μg/mL），V為接收液的體積（mL），Ae為擴散池的有效面積（cm2）

圖7 苦參堿累積透過量 ( ±s,n = 3)Fig.7 Cumulative permeation of matrine ( ±s,n = 3)

結(jié)果如圖7所示。由圖可知MA-SLN較苦參堿經(jīng)皮滲透釋藥快，1～9 h時ΔM達到500 μg/cm2左右，是苦參堿水溶液的3.93倍（t檢驗，P＜0.05），表明MA-SLN能夠顯著促進苦參堿的經(jīng)皮滲透，其原因可能是MA-SLN以其較小的粒徑（197 nm）和 親脂性而增強了苦參堿的經(jīng)皮滲透性，同時，藥物在MA-SLN微粒中以高濃度的分子狀態(tài)分布增大了其熱力學活度，進一步利于苦參堿的經(jīng)皮滲透吸收。9～24 h，MA-SLN可以持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物，以維持藥物的經(jīng)皮滲透吸收，表明MA-SLN具有良好的緩釋行為；而水溶液中藥物雖然也隨時間延長而ΔM緩慢增加，但是增加不明顯（t檢查，P＞0.05），表明苦參堿在苦參堿水溶液中難于經(jīng)皮滲透吸收。結(jié)果表明MA-SLN不僅可以提高藥物經(jīng)皮滲透吸收的效率，還具有良好的緩釋行為。

3 討論

苦參堿具有多種藥理作用，是一種具有巨大臨床應用價值的天然藥物。但是，由于苦參堿存在強烈持久的苦味且對胃腸道黏膜存在刺激，加之其生物半衰期較短，血漿清除快，臨床為保證療效需大劑量給藥，進而增加不良反應發(fā)生頻次，這些限制了苦參堿口服給藥與注射給藥的廣泛應用。

本實驗研究了以微乳-低溫固化法制備MA- SLN，并對其藥劑學性質(zhì)與透皮給藥行為進行了考察。研究發(fā)現(xiàn)，采用微乳-低溫固化法制備MA-SLN，其工藝簡單、周期短、成本低與可控性高，因此易于產(chǎn)業(yè)化放大。

實驗中，為了準確測定苦參堿固體脂質(zhì)納米粒的包封率，必須將納米粒和游離的藥物有效分離。常用葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法和超速離心法等分離方法。其中透析法過程緩慢，藥物容易泄露；實驗過程中也采用過超速離心法，但實驗不易產(chǎn)生沉淀，且結(jié)果不穩(wěn)定；而魚精蛋白凝聚法主要是通過在納米粒表面吸附某種蛋白質(zhì)來增加固體脂質(zhì)納米粒的密度使游離藥物與納米粒通過離心后達到有效分離。本實驗用約含2/3以上精氨酸的鮭魚精蛋白，一種含有胍基的帶正電的堿性氨基酸?？鄥A固體脂質(zhì)納米粒帶有負電荷。多聚陽離子魚精蛋白會與帶負電的納米粒產(chǎn)生絮凝作用，并通過離心將納米粒和游離藥物分離，該法簡單易行，且分離效果較好。

本實驗制備的MA-SLN呈規(guī)整平滑的均勻?qū)嶓w骨架球狀結(jié)構，苦參堿在SLN均勻分布且二者相容性良好，MA-SLN對苦參堿具有較高的包封率（56.12±0.82）%，因此載藥量大，可滿足不同疾病治療的需求；MA-SLN的平均粒徑為197 nm（PDI為0.184），電位為（-32.0±2.1）mV，表明MA-SLN粒徑分布均勻并具有良好的穩(wěn)定性。MA-SLN具有較小的粒徑，并且由于SLN的親脂性材料將藥物包裹于脂質(zhì)結(jié)構中，增加了藥物的穩(wěn)定性和細胞透過率，因此，可以極大地促進苦參堿的透皮吸收[20-21]，9 h時ΔM達到500 μg/cm2是苦參堿水溶液的3.93倍（t檢驗，P＜0.05），同時，由于苦參堿被充分包埋于MA-SLN的實體骨架材料中因而具有較好的緩釋行為，可持續(xù)釋藥24 h。MA-SLN為苦參堿提供了一種基于納米微粒的新型外用緩釋給藥系統(tǒng)，在一定程度上促進了中藥的傳承與創(chuàng)新，因此，MA-SLN具有廣闊的應用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突