百藥煎不同菌種發(fā)酵品特征性成分差異比較及潛在分子作用機制探討

王瑞生，曹文文，張江山，張振凌,3*，陳祎甜

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008

2.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450008

3.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450008

百藥煎為五倍子同茶葉、酵曲等經(jīng)發(fā)酵制成的塊狀物，有潤肺化痰、止血止瀉、解熱生津的功效[1]。臨床記載了百藥煎在中成藥中的應(yīng)用，如其組成的金霜煎、結(jié)腸安膠囊、清咽丸等。李時珍曰[2]“百藥煎功與五倍子不異。但經(jīng)釀造，其體輕虛，其性浮收，且味帶余甘……含噙尤為相宜”。相較于條件有限且質(zhì)量波動較大的傳統(tǒng)自然發(fā)酵，現(xiàn)代發(fā)酵法已經(jīng)針對影響百藥煎發(fā)酵質(zhì)量的相關(guān)因素，如菌種、基質(zhì)和溫濕度等進行了研究和改良[3-8]，使其炮制工藝和飲片質(zhì)量得到了較大改善。本課題組在前期研究中[9-11]利用微生物分離鑒定技術(shù)于傳統(tǒng)發(fā)酵過程中分離篩選出了五倍子發(fā)酵百藥煎的3種優(yōu)勢菌種/群：黑曲霉Aspergillus niger（BYJ.H-1）、米根霉Rhizopus oryzae（BYJ.G-1）和蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus（HMB2）、巨大芽孢桿菌菌株Bacillus megaterium（HMB5）、伯頓絲孢畢赤酵母Burton Pichia pastoris（HMY1）、克魯維酵母菌株Kluyveromyces（HMY2）4菌混合菌群，并在恒溫恒濕條件下分別進行發(fā)酵，均可以得到五倍子的發(fā)酵品百藥煎，且主要指標(biāo)成分沒食子酸的含量都可以達到≥35%的要求[12]。但百藥煎在發(fā)酵過程中的物質(zhì)基礎(chǔ)變化涉及到酚類、酯類和兒茶素類等多種化學(xué)成分[13]，不同菌種對其發(fā)酵質(zhì)量的影響是否存在較大差異尚不明確，僅依據(jù)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的單一指標(biāo)判斷上述發(fā)酵品間的差異性有所片面，有必要根據(jù)其發(fā)酵過程中的特征性成分的變化進一步分析。

百藥煎對于呼吸及消化系統(tǒng)的治療和調(diào)理依賴于自身多種物質(zhì)基礎(chǔ)的協(xié)同作用[14-15]，但目前有關(guān)百藥煎的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用研究較少，使其功效作用機制研究難以深入到細胞分子層面。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[16]是一種基于大數(shù)據(jù)時代背景下融合系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)、藥理學(xué)以及多種網(wǎng)絡(luò)計算平臺的新興學(xué)科，可以在臨床研究前實現(xiàn)跨微觀（分子、生化網(wǎng)絡(luò)）到宏觀（組織、器官）的多層次理論模擬和分析，從而系統(tǒng)、動態(tài)地研究模型內(nèi)多個元素（藥物分子、靶標(biāo)、細胞、組織、器官等）之間的相互作用，從可視化角度闡釋中藥多分子、多靶點、多途徑的功效作用機制。

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，以五倍子發(fā)酵百藥煎過程中2種新產(chǎn)生的成分2,4,6-三-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖（2,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGβG）和2,4,6-三-O-沒食子酰-α-D-葡萄糖（2,4,6-tri-O-galloyl-α-D-glucose，TGαG）及2種升高成分沒食子酸和表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）的HPLC峰面積為指標(biāo)，采用主成分分析-聚類分析（principal component analysis-cluster analysis，PCA- CA）法對比3種不同菌種/群發(fā)酵品的差異；同時結(jié)合實驗基礎(chǔ)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對百藥煎“清熱化痰、止血止瀉、解熱生津”功效的潛在分子作用機制進行探究，為百藥煎的發(fā)酵炮制、質(zhì)量控制、臨床應(yīng)用和飲片開發(fā)提供參考。

1 儀器和材料

1.1 儀器

2487型高效液相色譜儀，上海通微分析技術(shù)有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；SPL-250型生化培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW- CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，上海蘇凈實業(yè)有限公司；BSA224S-CW型電子天平和BT25S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；400Y型高速多功能粉碎機，永康市鉑歐五金制品有限公司；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；W22型電陶爐，佛山市順德區(qū)啟偉電器有限公司。

1.2 材料及試劑

五倍子購于安徽石田中藥飲片有限公司，批號160429，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定為漆樹科植物鹽膚木Rhus chinensisMill.葉上的蟲癭，符合《中國藥典》2020年版五倍子項下的各項規(guī)定，百藥煎均為實驗室自制，制備方法見“2.1”項。茶葉，綠茶，河南信陽茶葉專業(yè)市場，批號20160810；BYJ.G-1，實驗室保藏，批號20180118；BYJ.H-1，實驗室保藏，批號20190119；HMB2，實驗室保藏，批號20180702；HMB5，實驗室保藏，批號20180705；HMY1，實驗室保藏，批號20180711；HMY2，實驗室保藏，批號20180712；PDA/LB培養(yǎng)基，自制，批號20190809；沒食子酸、EGC對照品，成都普斯生物科技有限公司，批號分別為PS000688、PS0230- 0025，質(zhì)量分數(shù)均≥99%；2,4,6-三-O-沒食子酰-D-葡萄糖（TGG，由于TGG結(jié)構(gòu)具有半縮醛，始終有α和β 2個互變異構(gòu)體存在，因此對照品是1個，但是在色譜圖上有2個峰）對照品，批號20150824，自制，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%；三氟乙酸，上海麥克林生化科技有限公司，批號202007015，分析純；乙腈，美國Thermo公司，批號20201016，色譜純；甲醇，天津富宇精細化工有限公司，批號20200713，分析純。

1.3 數(shù)據(jù)庫及平臺

有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/ tcmsp.php），蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（UniversalProtein，Uniprot，https://www.uniprot.org/），人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards-Human Genes，https://www.genecards.org/），交互式韋恩圖平臺（jvenn，http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html），功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（STRING，https://string-db.org/），高通量基因組數(shù)據(jù)分析工具平臺（Bioconductor，https:// bioconductor.org/）。

2 方法與結(jié)果

2.1 百藥煎樣品制備

取茶葉，分次加水煎煮，濾過，合并濾液，濃縮至適量，放涼，與五倍子細粉混合，制成軟材，于115 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min，放至室溫。分別接種BYJ.H-1、BYJ.G-1和HMB2、HMB5、HMY1、HMY2 4菌混合菌群，置溫度35 ℃，濕度85%條件下發(fā)酵，待藥塊表面遍布白色“霉衣”時，取出，切成小方塊，低溫干燥。3種菌種各發(fā)酵9批，批號分別為BM1～BM9、BH1～BH9、BA1～BA9。

2.2 不同菌種發(fā)酵品特征性成分差異對比

2.2.1 供試品溶液的制備 取各批樣品粉碎，過4號篩，取0.2 g，精密稱定，加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量后靜置2 h，超聲提取40 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失的質(zhì)量，取續(xù)濾液，過0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取沒食子酸、EGC、TGG對照品適量，精密稱定后加甲醇溶解，配制成含沒食子酸0.1 mg/mL、EGC 0.3 mg/mL、TGG 0.02 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 樣品測定 參照本課題組前期建立的HPLC法[12]測定27批百藥煎樣品，含量以干燥品計，色譜圖見圖1，測定結(jié)果見表1。

2.2.4 不同菌種發(fā)酵品PCA-CA分析

（1）特征性成分降維分析：采用SPSS 20.0軟件將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進行降維，根據(jù)特征值＞1和累積方差貢獻率＞80%，選取前2個成分作為降 維后的主成分（表2），并將主成分載荷轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的特征向量（得分系數(shù)）后計算主成分得分，結(jié)果見表3、4。

圖1 混合對照品 (A) 和百藥煎樣品 (B) 的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and Baiyaojian sample (B)

（2）不同菌種發(fā)酵品聚類分析：以主成分得分為指標(biāo)，采用SPSS 20.0軟件對不同菌種發(fā)酵品進行k-均值聚類分析，將群集數(shù)設(shè)置為3后輸出聚類結(jié)果并進行可視化。結(jié)果顯示，各聚類群集中的發(fā)酵品并非單一種類，不同菌種發(fā)酵品的聚類結(jié)果存在交叉現(xiàn)象，群集聚類趨勢無規(guī)律且與菌種類別無關(guān)聯(lián)，見圖2。

2.3 百藥煎潛在分子作用機制探究

2.3.1 活性成分靶標(biāo)及功效相關(guān)靶標(biāo)篩選

（1）活性成分靶標(biāo)篩選：鑒于百藥煎基礎(chǔ)研究過少，TCMSP數(shù)據(jù)庫并未收錄相關(guān)信息，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上[17]借助PubChem數(shù)據(jù)庫對百藥煎的活性成分進行整理（表5），然后以各成分名稱為關(guān)鍵詞通過TCMSP和Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)名稱，結(jié)果共得到158個靶點，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“成分-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖3。

表1 百藥煎不同菌種發(fā)酵品中4種特征成分峰面積Table 1 Peak area of four characteristic components in different strains fermented products of Baiyaojian

表2 主成分特征值及解釋的總方差Table 2 Principal component eigenvalues and explained total variance

表3 主成分載荷及特征向量Table 3 Principal component loads and eigenvectors

（2）百藥煎功效靶標(biāo)篩選：依據(jù)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論從“病、癥、證”角度對百藥煎的功效應(yīng)用進行分析后整理出可供數(shù)據(jù)庫檢索的方向——呼吸道疾病（respiratory disease，RD）、水液代謝失調(diào)（water metabolism imbalance，WI）和消化道出血（alimentary tract hemorrhage，AH）并提取其中的主要關(guān)鍵詞（圖4），然后通過GeneCards數(shù)據(jù)庫進行檢索，剔除重復(fù)及相關(guān)得分過低者，共得到1916個相關(guān)靶標(biāo)，主要涉及多表皮生長因子結(jié)構(gòu)樣域10（multiple epidermal growth factor-like domains protein 10）、抗肌萎縮蛋白（dystrophin）、骨成型蛋白受體1A（bone morphogenetic protein receptor type 1A）、C-X-C趨化因子基序配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）等。

表4 特征成分的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)及主成分得分Table 4 Standardized data of feature components and scores of principal components

圖2 不同菌種發(fā)酵品k-均值聚類散點圖Fig.2 K-mean cluster scatter plot of different strains fermentation products

2.3.2 中藥成分-功效靶點交集 基于Jvenn平臺對百藥煎及其功效相關(guān)靶點進行取交集處理，得到99個共有靶點，在3種病證中互有交集（圖5），這些靶點即為百藥煎發(fā)揮功效的潛在作用靶點，包括絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine kinase 1，AKT1）、前列腺素G/H合成酶1/2（prostaglandin- endoperoxide synthase 1/2，PTGS1/2）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等。

2.3.3 百藥煎功效調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 在明確百藥煎治療RD/WI/AH的潛在作用靶點后，采用Cytoscape軟件分別以“百藥煎、活性成分、相關(guān)靶點、RD/WI/AH”為節(jié)點，4者間的微觀聯(lián)系為網(wǎng)絡(luò)屬性，構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6），可明顯看出百藥煎是以多組分協(xié)同干預(yù)多個靶點起到治療RT/DS/HS的作用。

2.3.4 共有靶點的蛋白互作及PPI網(wǎng)路拓撲分析 為進一步探究百藥煎治療RD/WI/AH的分子作用機制，將共有靶點上傳至STRING平臺查詢靶點間的互作關(guān)系（置信度≥0.7），篩選后初步得到核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。剔除重復(fù)者及PPI網(wǎng)絡(luò)外的離散靶點后，RD相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有79個節(jié)點、652條邊，WI相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有78個節(jié)點、619條邊，AH相關(guān)網(wǎng)絡(luò)具有13個節(jié)點、41條邊，共計98個核心靶點。在此基礎(chǔ)上利用Cytoscape軟件中的Network Analyzer對3個網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，并依據(jù)節(jié)點度和邊中心性將網(wǎng)絡(luò)按順時針降序布局，見圖7。

表5 百藥煎活性成分基本信息Table 5 Basic information of active ingredients of Baiyaojian

圖3 百藥煎“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 “Component-target” network diagram of Baiyaojian

2.3.5 核心靶點的GO及KEGG富集分析 利用Bioconductor平臺和R語言對上述具備互作關(guān)系的核心靶點進行GO及KEGG富集分析，得到112個GO條目和154條KEGG信號通路，在錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05的前提下依據(jù)P值降序排列后分別選取前20個進行分析并做可視化處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述GO條目均與分子生物學(xué)功能相關(guān)，主要包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/ threonine kinase activity）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等，見圖8；上述KEGG信號通路主要包括PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、卡波西肉瘤皰疹病毒感染通路（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection pathway）、人類巨細胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection pathway）、乙型肝炎通路（hepatitis B pathway）、癌蛋白聚糖通路（proteoglycans in cancer pathway）等，見圖9。對最為顯著的PI3K-Akt信號通路的作用機制進行深入探究，發(fā)現(xiàn)藥物可通過多個靶點作用在通路中的節(jié)點上，圖10為其代謝通路圖，圖中標(biāo)紅的節(jié)點即為藥物靶點主要作用節(jié)點。

圖4 百藥煎功效檢索關(guān)鍵詞分析Fig.4 Analysis of efficacy search key words of Baiyaojian

3 討論

圖5 “藥物靶點-疾病靶點”韋恩圖Fig.5 Venn diagram of “drug target-disease target”

圖6 百藥煎功效調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Efficacy control network diagram of Baiyaojian

目前，對于百藥煎成分變化與功效變化的內(nèi)在 聯(lián)系，尚無文獻報到。本課題組前期主要對百藥煎成分變化進行了深入研究，其中TGG為百藥煎中首次發(fā)現(xiàn)的化合物，該化合物結(jié)構(gòu)由于具有半縮醛，因此始終有α和β 2個互變異構(gòu)體存在[12]，因此本研究將發(fā)酵后，百藥煎中含量升高的成分沒食子酸、EGC以及TGβG、TGαG和等特征性成分作為指標(biāo)進行研究。由于TGG為本課題組首次從百藥煎中分離得到，得率較低；且不同菌種發(fā)酵百藥煎中該成分含量差異較大，在使用標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時誤差較大，計算出的含量不準(zhǔn)確，而峰面積作為指標(biāo)更加準(zhǔn)確，因此，在選擇指標(biāo)時選用峰面積為指標(biāo)。

圖7 共有靶點的拓撲分析Fig.7 Topological analysis of shared targets

圖8 百藥煎治療RD/WI/AH核心靶點的GO富集分析Fig.8 Analysis of GO enrichment of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH core targets

本研究以特征性成分為指標(biāo)的PCA-CA分析結(jié)果顯示3種關(guān)鍵優(yōu)勢菌種在五倍子發(fā)酵百藥煎的化學(xué)成分變化過程中均可產(chǎn)生類似的特征性變化。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，這種特征性變化可能是百藥煎發(fā)酵后增效減毒作用機制產(chǎn)生的關(guān)鍵過程，即降低 鞣質(zhì)含量減少其口腔澀味、胃腸道收斂刺激性和肝臟毒性的同時大量生成沒食子酸、EGC等相對分子質(zhì)量小、易吸收的藥效活性成分。結(jié)果顯示上述3種優(yōu)勢菌種均可以完成這段關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化且結(jié)果基本一致，表明3種不同菌種發(fā)酵品間不存在明顯差異性。此外，現(xiàn)行國家藥典中尚未收錄本品，相關(guān)省市的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范也僅以沒食子酸為質(zhì)控指標(biāo)，不利于其臨床療效及用藥安全性的保障，針對此現(xiàn)狀，可利用一測多評或指紋圖譜等多成分評價體系探究上述特征性成分作為質(zhì)控指標(biāo)的可行性。

網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果顯示，百藥煎中的沒食子酸、EGC、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和EGC沒食子酸酯5種活性成分對其適應(yīng)病證存在潛在干預(yù)作用，可能是通過AKT1、STAT3、EGF、MAPK1、MAPK3、CXCL8、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，AVEGFA）、前列腺素氧化環(huán)化酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）等核心靶點的協(xié)同作用達到治療RD/WI/ AH的目的。其中，AKT1可以調(diào)節(jié)包括細胞增殖、凋亡、代謝和血管生成在內(nèi)的多種生物過程，STAT3作為急性期響應(yīng)因子在多種炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)和基礎(chǔ)能量代謝中具有重要作用，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）則在體內(nèi)外刺激各種表皮和上皮組織的生長，MAPK作為MAP激酶信號傳導(dǎo)途徑的重要組成部分與呼吸及消化系統(tǒng)疾病（肝炎、百日咳等）密切相關(guān)，CXCL8作為炎癥刺激響應(yīng)因子在呼吸道及消化道炎癥（支氣管炎、口腔炎、肺炎、胃炎等）發(fā)生中占據(jù)重要地位，上述各靶點所參與的生物過程要么涉及到呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，要么涉及到循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)和破損組織的生長，而RD/WI/AH的產(chǎn)生恰好與此相關(guān)，證明百藥煎很有可能是通過上述靶點間的協(xié)同作用達到相應(yīng)功效。GO分析結(jié)果顯示，核心靶點的表達主要涉及到激酶活性、連接酶及受體蛋白結(jié)合等分子功能；KEGG通路分析結(jié)果顯示，百藥煎的功效發(fā)揮主要涉及病毒感染、癌變和細胞因子調(diào)節(jié)等信號通路，其中PI3K-Akt信號通路的基因富集率和差異性表達最為顯著，該通路不僅參與多種生長因子、細胞因子和細胞外基質(zhì)等的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)[20]。

圖9 百藥煎治療RD/WI/AH的KEGG通路富集分析Fig.9 Analysis of KEGG path enrichment of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH

圖10 百藥煎治療RD/WI/AH的KEGG信號通路之一 (PI3K-Akt)Fig.10 One of KEGG signaling pathways of Baiyaojian in treatment of RD/WI/AH (PI3K-Akt)

在PI3K-Akt信號通路傳導(dǎo)過程中，相關(guān)生長因子與其受體酪氨酸激酶結(jié)合或G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，分別激活I(lǐng)A型和IB型PI3K基因，PI3K可以催化磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）的生產(chǎn)，PIP3可以作為第2個信使激活A(yù)kt，Akt經(jīng)過一系列磷酸化反應(yīng)后，可作用于多靶點，從而調(diào)控蛋白質(zhì)合成、細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖和DNA修復(fù)等過程[19-20]?！癛eference Network”是直接從KEGG信號通路中提取的分支信號通路，體現(xiàn)了其中部分基因之間的相互作用信息，在PI3K-Akt信號通路中有5條這樣的通路，本研究中的靶點主要富集在其中的EGF-EGFR-PI3K信號通路、EGF-EGFR-RAS- PI3K信號通路、IGF-IGF1R-PI3K信號通路及EGF- EGFR-PI3K-NF-κB信號通路上。在上述前2條分支信號通路中，基因主要分布在GF、RTK、AKT及BAD 4個節(jié)點上[21-22]。富集在GF節(jié)點上的基因有EGF、FGF2、FGF10、PDGFB及VEGFA，主要負責(zé)編碼一些活性因子。EGF負責(zé)編碼表皮生長因子超家族的成員，可刺激體內(nèi)外各種表皮和上皮組織的生長。FGF2和FGF10基因編碼的蛋白是成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族的成員，F(xiàn)GF可參與各種生物過程，包括胚胎發(fā)育，細胞生長，形態(tài)發(fā)生，組織修復(fù)，腫瘤生長和侵襲等[23]。

PDGFB基因編碼的蛋白包括血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），為中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肺、皮膚及血管平滑肌細胞的正常增殖以及血管和腎小球的正常發(fā)育所需，在傷口愈合中具有重要作用，可在多種發(fā)育過程中發(fā)揮作用[24]。VEGFA也是PDGF/VEGF生長因子家族的一員，編碼肝素結(jié)合蛋白，可誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，對生理和病理性的血管生成都至關(guān)重要。富集在RTK節(jié)點上的基因有EGFR、FGFR1、FLT1、KDR、PDGFRB、IGF1R、EPHA2及ERBB2，主要負責(zé)編碼一些受體蛋白。EGFR編碼一種跨膜蛋白，是表皮生長因子的受體[25]。FGFR1是FGF2和FGF10等纖維細胞生長因子的受體。FLT1和KDR基因編碼的蛋白為VEGF的受體（VEGFR）。PDGFRB是PDGF的酪氨酸激酶受體。IGF1R編碼胰島素樣生長因子1受體，也是一種酪氨酸激酶。EPHA2及ERBB2編碼的蛋白也是一種酪氨酸激酶，前者編碼的是一種腎素受體，后者則是EGF的受體。Akt節(jié)點是PI3K通路中的關(guān)鍵節(jié)點，對應(yīng)基因為Akt，Akt是一種蛋白激酶，依賴于PI3K通路激活。富集在BAD節(jié)點上的基因為BAD，BAD是Bcl-X/Bcl-2結(jié)合蛋白，主要參與調(diào)控細胞的存活及細胞的凋亡。

在IGF-IGF1R-PI3K上富集有研究基因的節(jié)點主要有GF、RTK及Akt，通過此信號通路可參與蛋白質(zhì)合成生物功能并調(diào)控mTOR信號通路[26-27]。在EGF-EGFR-PI3K-NF-κB信號通路上除GF、RTK及Akt 3個節(jié)點外，還有TKK及NF-κB 2個節(jié)點。TKK節(jié)點對應(yīng)的基因為IKBKB，負責(zé)編碼的蛋白是一種血清激酶，在NF-κB信號通路中起著重要作用。NF-κB節(jié)點對應(yīng)的基因為RELA，它負責(zé)編碼的蛋白為NF-κB家族的一員，NF-κB是一種全細胞轉(zhuǎn)錄因子，幾乎存在于所有細胞類型中，是一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的終點。綜上所述，百藥煎是通過EGF、FGF2、EGFR、FLT1及AKT等多種基因來調(diào)控PI3K-Akt通路中的多種信號傳導(dǎo)，從而參與蛋白質(zhì)合成、細胞凋亡、細胞周期進程等多種生物功能，或參與調(diào)控JAT/STAT信號通路、NF-κB信號通路及mTOR信號通路等旁支信號通路來發(fā)揮藥物的功效，達到治療RD/WI/AH的目的。百藥煎是通過多個活性成分協(xié)同作用于多個信號通路中的多個靶點來實現(xiàn)“潤肺化痰、止血止瀉、解熱生津”功效的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突