基于信號放大策略的超靈敏質譜新方法及其應用

秦少杰，繆代禹，白 玉，劉虎威

(北京大學化學與分子工程學院，北京分子科學國家實驗室，生物有機與分子工程教育部重點實驗室，北京 100871)

生物體中的核酸、蛋白質等生物大分子以及大量小分子代謝物參與了生命活動的整個過程，對其進行超靈敏檢測，不僅為準確理解細胞乃至生物體內生命活動內在機制提供了必要的基礎信息，也為臨床的早期診斷、疾病發(fā)展狀態(tài)的跟蹤以及預后提供了重要的診治依據(jù)。生物分子種類繁多，其中具有指示性作用的生物標志物在生物樣本中的含量往往較低，而且所處基質復雜，使超靈敏檢測極具挑戰(zhàn)。雖然光譜、電化學、核磁等分析技術為生物標志物的分析提供了重要工具，但是囿于其靈敏度、分析通量以及分析速度的限制，無法滿足生物分子的超靈敏檢測需求。

質譜法具有高靈敏度、高通量、分析速度快等優(yōu)勢，且可以通過二級甚至多級質譜對物質結構進行鑒定，目前已廣泛應用于蛋白組學、代謝組學等方面。液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)法重現(xiàn)性好、定量和定性能力強，分析對象范圍寬，在生物分子檢測方面應用較成熟，如非靶向代謝組學的鑒定和篩選[1]，糖基化修飾肽段的定性和定量分析等[2]。上述工作通常需要較冗雜的前處理步驟，對起始樣本量有一定要求，隨著分析需求的不斷提高，分析樣本用量逐漸減小，這對現(xiàn)有質譜檢測方法和技術的分析靈敏度提出了更高挑戰(zhàn)，成為現(xiàn)階段質譜在生命分析化學領域所面臨的一大難題。

針對上述問題，研究人員通過設計信號放大/轉移/增敏的策略，將待測物信號轉變?yōu)榱硪环N或幾種響應強的質譜信號，利用兩者之間存在的定量關系，實現(xiàn)待測物信號的間接檢出，以提高方法的檢測靈敏度。該思路的普適性強，可以應用于生物大分子以及小分子代謝物的檢測，信號增強效果通?？蛇_幾個數(shù)量級以上，很大程度上解決了超微量生物樣本中標志物的分析需求，為單細胞研究提供了重要的方法基礎。

綜上，本文主要聚焦應用信號放大策略實現(xiàn)質譜超靈敏檢測的方法及其在生物檢測方面的應用。根據(jù)信號放大策略的不同以及質譜離子化方式的差異，對近年來發(fā)展的質譜技術和方法進行總結與歸類，按照放大策略將其分為轉化、衍生化以及數(shù)量擴增3大類；按照離子化方式分為基于電噴霧、激光解吸附以及電感耦合等離子體3大類。與此同時，本文從研究手段、放大策略以及應用角度等方面進行總結，最后基于質譜超高靈敏檢測的發(fā)展現(xiàn)狀對未來提出展望。

1 基于噴霧的電離模式

基于噴霧的電離模式包含電噴霧電離(ESI)及在其基礎上發(fā)展的誘導電噴霧(induced ESI)和納升電噴霧(nanoESI)等方式。該類電離方式具有搭建相對簡便、質譜儀器適配性強和前端樣本處理生物相容性好等特點。然而，受限于敞開的大氣電離環(huán)境和有限的離子傳輸效率，常壓條件下生物樣本中超痕量生物標志物的分析仍然具有挑戰(zhàn)性。通過結合信號的捕獲、轉化/衍生化和信號放大策略，可顯著提升分析方法的靈敏度，助力超痕量生物樣本乃至單細胞層面的目標物分析研究。

核酸是生命體的遺傳物質，其電離效率隨聚合度的增加而降低，基于質譜的核酸大分子分析能力有限。為解決這一問題，蔣健暉等[3]提出將檢測靈敏度較低的DNA轉化為質譜響應更強的核苷酸，憑借單核苷酸較高的檢測靈敏度和nanoESI的高電離效率，成功實現(xiàn)DNA甲基化水平的超靈敏質譜分析。與之類似，張新祥等[4]利用毛細管電泳分離并富集消化后的單核苷酸，從125 pg DNA樣品中分析了5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)的含量，并進一步將該方法用于RNA中修飾堿基的檢測[5]。不同于降解轉化高聚物的策略，陳蕓等[6-8]通過檢測肽段間接分析目標核酸，利用與短鏈非編碼RNA(miRNA)互補的DNA探針特異性識別目標miRNA，隨后酶切與探針共價相連的肽段釋放信號肽用于質譜檢測，實現(xiàn)了多肽序列編碼的miRNA質譜分析。將互補DNA探針置換為核酸適配體，該方法可用于人表皮生長因子2(HER2)等生物標志物的檢測[9]，助力疾病診斷和藥效評價。此外，季銨鹽類化合物憑借出眾的電離效率常被用作報告離子。Badu-Tawiah等[10]將季銨鹽報告離子與抗體共價偶聯(lián)，在紙噴霧基底上完成免疫識別過程，通過滴加氨水，高效釋放pH敏感的報告離子，實現(xiàn)了瘧疾抗原以及2種腫瘤標志物的超靈敏檢測，示于圖1a。

圖1 基于噴霧電離模式的信號放大策略[10,16,18,24]Fig.1 Signal amplification strategies based on electrospray ionization[10,16,18,24]

相較于信號轉化策略，化學衍生化策略在質譜分析中的使用更廣泛。張新祥等開發(fā)了基于肼基三嗪的堿基衍生化策略，通過肼基與醛基、羧基的縮合反應標記5-醛基胞嘧啶(5fC)、5-羧基胞嘧啶(5caC)[11]和5hmC[12]，顯著提高了稀有堿基的檢測靈敏度。與之類似，袁必鋒等[13]利用季銨鹽修飾的碳二亞胺同時衍生8種堿基，將檢測限降低3個數(shù)量級。在此基礎上，他們進一步設計靶向磷酸基團的重氮喹啉衍生試劑[14]，在正離子模式下鑒定到12種游離三磷酸核苷，揭示了肝細胞癌與游離三磷酸核苷表達量的相關性。除了稀有堿基需要一定的增敏手段外，蛋白質在質譜檢測時同樣需要高效的富集方法或衍生化策略。黃光明等[15]應用點擊化學，將季銨鹽衍生的氰基苯并噻唑與半胱氨酸共價偶聯(lián)，開發(fā)了針對半胱氨酸和末端為半胱氨酸的肽段[16]的新型檢測方法，示于圖1b。該方法應用誘導電噴霧質譜對復雜生物樣品中特定蛋白質和肽段進行定量分析，線性范圍為100 amol～10 nmol，并進一步實現(xiàn)了單細胞中游離半胱氨酸的快速檢測。對于單細胞中代謝物的研究，郭寅龍等[17]利用酶促脫氫衍生化反應，在nanoESI噴針中將D-乳酸轉化為質譜響應更強的吡啶鹽類化合物，將其與同質荷比的L-乳酸區(qū)分，為超痕量手性異構體的質譜分析提供了新方法。聚糖較普通的手性化合物具有更復雜的同分異構體，其高靈敏分析更具挑戰(zhàn)。Lageveen-Kammeijer等[18]應用Girard’s P試劑將末端還原性糖衍生為吡啶鹽，提升其檢測靈敏度；同時，通過酯化-氨解唾液酸將其衍生為中性基團，構建了可兼顧構型的低豐度糖組學分析方法，示于圖1c。唾液酸的衍生化旨在屏蔽羧酸陰離子，提升其在正離子模式下的響應信號。Kema等[19]采用類似方法，使用丙酸酐原位衍生兒茶多酚類化合物以屏蔽酚羥基，大幅提升靈敏度的同時減少了血漿樣本的需求，為L-多巴、多巴胺和腎上腺素等代謝物的臨床監(jiān)測提供了新思路。

除了上述基于信號轉化和衍生化的方法，對檢測對象或信號分子進行數(shù)量上的擴增，通過信號放大同樣能夠實現(xiàn)高靈敏檢測。2016年，Marshall等[20]運用質譜檢測酶聯(lián)免疫法(ELISA)的產物，通過酶促反應實現(xiàn)信號分子數(shù)量上的擴增，提出了酶聯(lián)免疫質譜法(ELIMSA)。劉一鳴等[21]將微流控技術與解吸附電噴霧離子源(DESI)相結合，應用循環(huán)酶法擴增產生大量的報告分子，使亞皮摩爾量級miRNA的質譜檢測成為可能。與之相似，羅海等[22]利用核酸外切酶開發(fā)出一種無基質雙重放大方法，該方法使用三重探針構建擴增體系，由靶標DNA或核酸適配體啟動擴增，放大倍數(shù)超過600。等溫擴增作為一類特殊的酶法擴增，具有特異性強、放大倍數(shù)高、發(fā)展相對成熟等優(yōu)點，多用于基于等溫擴增的熒光或電化學超靈敏分析。2021年，盧建忠等[23]報道了等溫擴增技術在質譜分析中的應用，借助核酸擴增和降解轉化雙重放大策略，成功檢測了50 amol的miRNA。除酶法擴增外，還可借助納米顆粒作為功能化基底，利用其良好的可修飾性、穩(wěn)定性與較高的比表面積，實現(xiàn)其上大量質譜標簽的修飾，將超痕量生物分子的直接檢測轉化為數(shù)百倍乃至數(shù)千倍的增敏質譜標簽的檢測，顯著提升目標生物分子的檢測靈敏度。此外，多數(shù)納米粒子具有較好的生物相容性，可廣泛應用于生物樣本中低豐度物質的痕量檢測。2019年，本課題組設計并合成了基于氧雜蒽母核的系列質譜標簽[24]，將特異性抗體/適配體和質譜標簽組裝在金納米顆粒表面合成質譜探針。在完成目標蛋白質的探針識別后，利用自行搭建的電噴霧加速的基底噴霧離子化質譜進行檢測，高速電噴霧噴射樣本表面，可實現(xiàn)大量質譜標簽分子的原位解離和實時檢測。本方法將蛋白生物標志物的檢測限降低了7個數(shù)量級，實現(xiàn)了zmol水平生物標志物的定量分析。在此基礎上，本課題組進一步將該方法應用于單細胞分析，通過質譜探針實現(xiàn)單細胞蛋白質的檢測，與單細胞代謝物實時分析相結合，構建了多維度有機質譜流式細胞平臺,示于圖1d[25]。與現(xiàn)有的無機質譜流式細胞儀相比，該平臺首次實現(xiàn)了單細胞層面上代謝物和蛋白質的同時分析，并大大降低了抗體偶聯(lián)稀土元素所需的成本，為單細胞多維度、多參數(shù)分析提供了有力工具。該方法成功檢測了5種腫瘤細胞/細胞亞型中6種目標蛋白和近百種代謝物，不僅實現(xiàn)了細胞和細胞亞型的精準分型，也為腫瘤耐藥異質性的分子機制提供了相關分子信息。欒天罡等[26]進一步將基于功能性金納米顆粒的信號放大策略與紙噴霧質譜相結合，采用化學解離的方式釋放質譜探針，實現(xiàn)了前列腺抗原以及癌胚抗原等多種標志物的高效檢測。Baird等[27]應用類似的免疫捕集-信號放大-化學解離策略，使用功能化二氧化硅納米顆粒檢測了全血中稀有細胞，為臨床快速檢驗提供了新方法。

通過結合信號轉化、衍生化和信號放大等策略，在基于噴霧類質譜檢測超痕量樣品中低濃度生物分子方面取得了重要進展。信號轉化策略能夠規(guī)避檢測對象穩(wěn)定性差、靈敏度低等缺點，并通過檢測物種的轉化顯著提升分析靈敏度；但目前的信號轉化策略大多基于分子雜交的放大實現(xiàn)核酸分析，對于蛋白質和代謝物等分子的信號轉化方法有待進一步開發(fā)。衍生化策略能夠大幅提升目標物的檢測靈敏度，但其選擇性和廣譜性受到反應基團的限制，在有限體積的復雜樣品中難以實現(xiàn)高特異性衍生化，在組學水平上較難實現(xiàn)無歧視的衍生。不同的信號放大策略為低含量分子的超靈敏檢測提供了更多可能，但如何提高信號放大的普適性，從而增加蛋白質等生物分子檢測通量，仍然是未來需要著重突破的難點。

2 基于激光解吸附的電離模式

基于激光解吸附的MALDI/LDI質譜技術具有靈敏度高、鹽容忍度高、空間分辨率好以及較強的非靶向檢測能力等優(yōu)點，在生物組織以及細胞中的代謝物、脂質以及蛋白質和肽段的檢測中發(fā)揮著重要作用。盡管如此，由于生物大分子較低的離子化效率，目前借助該方法僅能對一些高豐度的蛋白[28]以及肽段[29]進行檢測，檢測靈敏度仍十分有限。因此，如何將被檢測分子信號轉移或放大，提高檢測靈敏度，實現(xiàn)微量生物樣本甚至是單細胞水平的檢測仍極具挑戰(zhàn)。2003年，Mirkin等[30]首次提出了利用基于納米顆粒的生物標簽對蛋白質進行超靈敏檢測。通過在磁性納米顆粒表面組裝靶標蛋白的抗體與DNA序列，與靶標蛋白識別后進行磁分離，進而通過去雜交的方式將釋放的單鏈DNA序列進行PCR擴增與檢測。該方法可實現(xiàn)30 amol/L的前列腺抗原檢測，相比于常規(guī)的臨床檢測方法，檢測限降低了6個數(shù)量級。此外，利用類似的模式，該方法還可實現(xiàn)DNA 的檢測[31]。對于信號響應更強的質譜標簽，除了短鏈核酸序列外，可裂解的有機小分子標簽由于具有設計性更強、體積更小、離子化效率更高等優(yōu)勢，與超靈敏質譜結合具備更強大的檢測能力。劉寶紅等[32]將PEG鏈作為質譜標簽組裝在金納米顆粒表面，利用巰基的光可裂解性以及Au納米本身的基質作用，通過LDI/MS實現(xiàn)信號放大與轉移，實現(xiàn)了模式蛋白凝血酶以及表皮黏附因子EpCAM在血清環(huán)境中的超靈敏檢測，示于圖2a，在此基礎上，將磁性顆粒引入體系中[33]，通過形成三明治免疫結構減少非特異吸附，并借助磁性分離提高分離效率。Cooks等[34]將該方法應用于稀有的循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)的檢測。相關工作也有一些報道[35-41]。該方法還可實現(xiàn)單細胞蛋白質的檢測，即單個MCF-7細胞表面的EpCAM蛋白、細胞角蛋白19 (CK19)和粘蛋白1(muc1)的相對定量[42]。但此類方法的檢測靈敏度仍有限，且樣本需要送入真空完成激光解吸附過程，分析通量受限。此外，雖然可通過內標校正，但方法的重復性和準確性仍有待進一步提升。

在上述工作的基礎上，利用多重信號放大的思路還可將檢測靈敏度進一步提升。林金明等[43]通過等溫滾環(huán)擴增(RCA)技術進行了信號的二次放大，提高了120個凝血酶分子的檢出靈敏度。除了利用質譜標簽進行信號放大外，利用酶催化底物的特性也可以實現(xiàn)信號的轉移和放大。Schellenberger等[44]將自制的20種肽段底物混合溶液噴灑至組織表面，反應一段時間后，通過產物生成量來反映組織層面的十幾種蛋白酶、激酶以及磷酸化酶的空間分布以及活性變化，示于圖2b[45]。Zenobi等[46]將酶混合溶液噴灑至靶板表面，實現(xiàn)核心代謝物ATP/ADP的檢測。

基于激光解吸附離子化質譜的空間分辨率可達幾微米，可用于組織表面的高分辨微區(qū)成像。Lim等[47]將免疫組織化學(IHC)與MALDI-MS相結合，示于圖2c，在抗體表面共價結合了可裂解的質譜標簽與熒光基團，在與常規(guī)免疫熒光的結果互相驗證的前提下，實現(xiàn)了對小鼠腦部以及人體扁桃體和乳腺癌切片的成像，同時獲得一些代謝物的信息。

圖2 基于激光解吸附類電離的信號放大策略[32,44,47-48]Fig.2 MALDI/LDI based signal amplification strategies[32,44,47-48]

除了增強蛋白質檢測信號外，對于很多質譜響應較差的代謝物和生物標志物，發(fā)展與之相關的衍生化策略以提高其檢出能力也是非常有效的手段。Fletcher等[48]利用吡啶硼酸陽離子與鄰二羥基的特異性縮合反應，對組織表面的兒茶酚胺等4種代謝物進行了原位衍生化，并利用LDI/GCIB-TOF-SIMS雙重檢測方式，實現(xiàn)了豬腎上腺組織的高分辨成像，示于圖2d。林金明等[49]利用凝集素與細胞表面糖鏈的特異性相互作用，在凝集素的一端修飾長鏈DNA引物，通過RCA方式實現(xiàn)信號擴增，進而利用MALDI-TOF MS實現(xiàn)短鏈DNA probe的釋放和檢測，最終實現(xiàn)了MCF-7細胞表面α-d-甘露糖基和β1-6N-乙酰葡萄糖胺的成像。由于細胞中糖合成的過程需要從外界攝入原料，因此，可借助代謝標記的策略提高糖鏈以及糖蛋白的檢出能力。聶宗秀等[50]通過click反應將激光可裂解探針(Tphsene)與攜帶正交標記基團的唾液酸類糖蛋白耦合，最終檢測限可低至約500個Hela細胞。

基于信號放大策略的MALDI/LDI-MS超靈敏檢測，使用最廣泛的方法是在納米顆粒上負載質譜標簽來實現(xiàn)信號放大，進而通過引入新的識別方法及改造質譜標簽結構以滿足不同的檢測需求。針對某一類蛋白質或者代謝物，可結合本身的性質，通過衍生化或者酶促反應來間接實現(xiàn)這一目的。更重要的是，區(qū)別于其他離子化方式，MALDI/LDI-MS具有高空間分辨的特點，有望實現(xiàn)高分辨率下組織甚至單細胞中蛋白質以及代謝物的檢測。

但是，由于基于激光解吸附的離子化方式通常需要在真空環(huán)境下進行，以獲得高靈敏分析結果，給保持生物樣本的本征狀態(tài)帶來困難。因此，發(fā)展常壓MALDI/LDI方法可能是解決該問題的一個思路，但常壓下的檢測靈敏度損失也是不容忽視的問題；代謝物的衍生化策略以及蛋白質的同時檢測數(shù)目有限對現(xiàn)有方法提出了進一步挑戰(zhàn)；對于單細胞研究而言，如何進一步提高空間分辨率和靈敏度，實現(xiàn)單細胞甚至亞細胞器水平的質譜成像，則是該領域所面臨的共同挑戰(zhàn)。

3 基于電感耦合等離子體電離

與基于激光的離子化方式不同，ICP-MS通過電感耦合的方式產生等離子體，在極高的火焰溫度下將待測物分子離子化，由于離子化效率高，蒸發(fā)能力強，尤其適用于檢測微量金屬元素。2002年，Tanner等[51]將攜帶金屬標簽的抗體與靶標蛋白相孵育，金屬標簽與目標蛋白通過免疫識別的作用相連，利用兩者含量間存在的對應關系，通過ICP-MS定量分析金屬元素，實現(xiàn)目標蛋白質的定量。該方法本質上是一種信號轉移和放大，可實現(xiàn)0.1 μg/L蛋白質的檢測，如此高的靈敏度主要得益于ICP-MS對金屬元素的檢測敏感性。Tanner等[52]對ICP-MS裝置中的TOF部分進行了改造，通過使用120 V正交加速器，在提高空間分辨率的同時，獲得了更快的采樣速度，每秒可以采集50 000張譜圖，能夠滿足單個細胞的多變量分析需求。將該技術進一步優(yōu)化整合，推出了商業(yè)化的質譜流式細胞儀—“mass cytometry”。Tanner與Nolan等[53]使用該儀器，將攜帶金屬標簽的抗體與細胞孵育后，通過氬氣噴霧的形式將細胞懸液處理成單細胞液滴實現(xiàn)進樣，之后進入溫度高達5 500 K的等離子炬焰區(qū)進行離子化過程，并利用ICP-MS對元素進行定量分析。該實驗利用34個標記試劑對人骨髓中的免疫細胞進行細胞表型及免疫信號響應的深度分析，揭示了全新的藥物作用與人體造血免疫功能的聯(lián)系。除了對細胞懸液進行分析，通過對質譜流式方法進行改進，可以用于高分辨的組織成像。由于激光直徑只有1 μm，通過后續(xù)的單細胞成像分割軟件，即可實現(xiàn)多維單細胞成像與分析[54]。Bodenmiller在這一領域開展了一系列工作，其中相當一部分工作是圍繞乳腺癌這一疾病展開的，通過對300多位乳腺癌患者的研究，發(fā)現(xiàn)了新的疾病亞型，并且與后期患者的生存曲線有很好的對應關系[55]。除此之外，他們利用質譜流式研究了腫瘤細胞與免疫細胞的關系，揭示了與免疫抑制相關的生態(tài)系統(tǒng)特征和不良預后[56]。

無機質譜流式細胞儀還可實現(xiàn)單細胞多組學研究，Nolan等[57]應用臨近連接(proximity ligation)策略，設計與靶向mRNA序列互補的DNA探針，加入模板后通過RCA方式將探針延長，之后使用攜帶金屬元素的DNA probe進行互補配對，這一路線與抗體孵育探針互不干擾。因此，可以實現(xiàn)30多種與細胞表型相關的蛋白與mRNA的同時檢測。利用該方法，Bodenmiller等[58]研究了與乳腺癌發(fā)病相關的蛋白質與RNA表達水平的相關性。

基于無機質譜的流式細胞儀可以實現(xiàn)單細胞水平多維度和多組學的研究，這對于從系統(tǒng)生物學的角度去理解疾病機制、細胞分化以及信號傳導都具有重要的作用。但是，該方法的儀器和試劑昂貴，抗體的制備和修飾繁雜，且可能存在抗體的交叉反應，更重要的是該類技術從原理上無法獲得直接反映細胞狀態(tài)的代謝物信息，限制了相關應用的開展。

4 結論

本文根據(jù)離子化方式以及待測物種類的不同，對近年來基于信號放大策略的質譜超靈敏檢測方法及其在生物分析中的應用進行了綜述。方法都各具特色，且很好地提升了檢測能力和靈敏度，但同時存在各自的局限性：1) 檢測通量有限。在ICP-MS方法中尤為明顯，雖然相比于基于熒光信號輸出的方法，該方法不存在光譜重疊的影響，可同時檢出30種金屬元素，但這樣的通量仍無法滿足真正意義上的組學分析需求。而近期發(fā)展的有機質譜流式方法，利用質譜標簽的結構可拓展性，從理論上極大提高了分析通量，但這對質譜標簽的合成簡便性、結構類似性、無離子化歧視等也提出了要求，目前正在進一步發(fā)展和逐步完善中。針對代謝物的檢測，目前衍生化策略還只能針對某一類具有相似結構的分子或特定的官能團進行化學反應和增敏，普適性面臨挑戰(zhàn)。因此，進一步提高信號放大策略的檢測通量是非常重要的發(fā)展方向之一。2) 信號放大能力有待提高。雖然借助納米粒子較高的比表面積，可以實現(xiàn)上萬個質譜標簽的有序組裝，但解離過程同樣存在效率損失；目前借助各種信號放大策略，靈敏度達到了單細胞水平，而隨著研究的深入，針對單細胞器、甚至單分子水平的檢測則更具研究價值和挑戰(zhàn)。因此，如何進一步提高信號放大能力，從而達到生命分析靈敏度的“天花板”，是一個值得思考的問題。3) 多組學兼容能力有待加強。從多組學角度對生物學問題進行全面的解釋，已被越來越多的科研工作者所接受和認同[59]，因此發(fā)展多組學分析技術對理解相關生物學問題提供了更嚴謹和整體的視角。截至目前，基于質譜的多組學分析方法仍然非常有限，無機質譜流式可實現(xiàn)基因組、轉錄組、表觀遺傳組以及蛋白質組學的同時分析[60-61]。本課題組近期發(fā)展的多維度有機質譜流式細胞分析方法，可實現(xiàn)單細胞蛋白質以及代謝組學的同時檢測[25]。因此，發(fā)展高通量、高內涵的多組學質譜分析新技術，也是該領域努力的目標。

通過發(fā)展信號放大策略提高信號檢出靈敏度的方法尚處在發(fā)展階段，值得進一步研究和深入挖掘，創(chuàng)新性方法的建立將推動生命分析領域朝著更精準、更靈敏的方向發(fā)展。