蒙藥古日古木-13對小鼠視網(wǎng)膜光損傷的保護作用

張?zhí)熨Y 王彥夫 曉琴 謝飛 李冉 詹艷 韓立坤

(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院 1眼科，內(nèi)蒙古 通遼 028000;2內(nèi)分泌科)

視網(wǎng)膜光損傷是指光照強度過大或光照時間過長對視網(wǎng)膜造成的損害。研究表明視網(wǎng)膜細胞損傷的3條途徑為過氧化物介導，視紫紅質介導和細胞凋亡〔1,2〕。光損傷可導致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層損傷〔3〕，且與凋亡相關的基因和蛋白表達相關。因此，抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡是預防和治療視網(wǎng)膜光損傷疾病的重要途徑。蒙藥古日古木-13治療青光眼等視神經(jīng)損傷類疾病的療效確切〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)蒙藥日古木-13能對視神經(jīng)損傷起到保護作用〔5〕。本實驗以蒙藥古日古木-13對視神經(jīng)損傷的保護和治療作用為出發(fā)點，觀察光損傷小鼠視網(wǎng)膜的功能和組織結構的變化及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-8、caspase-9、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達情況，評估蒙藥古日古木-13對視網(wǎng)膜光損傷的保護作用及抑制視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 采用吉林大學醫(yī)學院實驗動物中心提供的鼠齡7～8 w SPF級雄性C-57小鼠40只，體重18～22 g。飼養(yǎng)條件：按照晝夜節(jié)律，光照12 h(80 lux,6∶00～18∶00)，避光12 h，溫度：18～25℃，相對濕度：40%～65%，未限制攝食飲水。入組前所有小鼠經(jīng)常規(guī)檢查雙眼前節(jié)及眼底，以排除屈光介質混濁和眼底異常。

1.2藥物與試劑 RIPA裂解液、蛋白分子量標準、Marker、多聚甲醛、75%甲醛、生理鹽水和戊巴比妥鈉鹽均購自Beyotime生物科技；羊抗鼠、β-actin抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、caspase-3 抗體、caspase-8 抗體和caspase-9抗體均購自ABCOM-Technology forerunner；阿托品眼用凝膠購自沈陽興齊制藥；左氧氟沙星眼用凝膠購自湖北東勝制藥，蒙藥古日古木-13由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院提供。

1.3主要儀器 眼電生理檢測儀購自法國邁威；眼科手術器械及顯微手術器械均購自新華醫(yī)療器械；超凈工作臺購自日本Airtech，光學顯微鏡、倒置相差顯微鏡、體式顯微鏡和熒光導致顯微鏡IX70均購自日本Olympus；Thermo酶標儀全自動高壓滅菌器、平衡離心機、低速離心機和微量移液器均購自美國Thermo Fisher；純水機POSEIDON-R150購自銳思捷科學儀器；-80℃超低溫冰箱購自日本SANYO；酶標儀550型購自美國Bio-Rad。

1.4動物分組、模型建立及給藥 將小鼠隨機分成5組：正常組(8只)，對照組(8只)和治療組(24只)。其中，治療組隨機分為3組：治療高劑量組(8只)、治療中劑量組(8只)、治療低劑量組(8只)。將對照組及治療組進行24 h暗適應后置入光損傷實驗箱中進行光照(9 000 lux冷光源,溫度：22～25℃；濕度：40%～65%；自由飲食飲水)12 h。照射結束后所有小鼠送返至暗環(huán)境12 h。模型建立后開始給藥，治療高劑量組： 1.6 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。治療中劑量組： 0.8 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。治療低劑量組： 0.4 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。對照組：0.7 ml生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃給藥7 d。灌胃劑量參考《蒙藥學百科全書》《蒙醫(yī)藥實驗學》《實驗動物學》

1.5ERG檢測 實驗各組小鼠在暗黑房間中整夜進行暗適應；將小鼠稱重，按比例在小鼠腹腔內(nèi)注射適量麻醉劑，使其進入深度麻醉狀態(tài)；麻醉完成后，在暗紅光照明下，膠帶固定小鼠趴在動物試驗平臺前方，滴涂阿托品散瞳凝膠。電極安裝：連接正電極使環(huán)形電極分別接觸左右眼角膜頂端，使其接觸角膜中心，一通道正極接右眼，二通道正極接左眼；雙頭針電極輕輕插入小鼠下顎，接通兩個通道的負接口，同側正負極方向一致；針電極插入小鼠尾巴，接通地電極。將小鼠及動物試驗平臺推入閃光刺激球內(nèi)。于電生理計算機錄入小鼠編號，進入ERG-0.01程序，示波信號確認無誤后關閉暗紅光，可依次進行0.01ERG及3.0ERG檢測(3.0ERG檢測前進行暗適應15～20 min)。

1.6視網(wǎng)膜組織形態(tài)學檢查 切片，1%戊巴比妥鈉鹽溶液麻醉5組小鼠，顯微鏡下摘除眼球，留取足夠長的視神經(jīng)，于12點位及3點位進行結膜縫線標記，用生理鹽水沖洗干凈，置于多聚甲醛中保存，標記各組名稱。將小鼠眼球置于包埋盒中，垂直懸吊12點位縫線，使眼球標本置于水平方位，OCT包埋劑包埋冷凍后，放置于冰凍切片機。切片機溫度：-30℃，切片厚度：4～7 μm，沿視神經(jīng)的上方和下方，從眼球后壁向角膜方向分別進行切片。蘇木素-伊紅(HE)染色，37℃烘片30 min；蘇木素染色10～15 min，蒸餾水沖洗，70%乙醇沖洗20～30 s；伊紅染色10～15 min，蒸餾水沖洗。透明、固定、封片。光學顯微鏡下觀察并記錄視網(wǎng)膜組織結構變化。

1.7Western印跡檢測正常組、治療組和對照組的凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表達量。

1.7.1視網(wǎng)膜組織蛋白的提取 分離視網(wǎng)膜組織，用液氮研磨組織至粉末狀；將視網(wǎng)膜組織粉末倒入EP管，將細胞裂解液和蛋白酶抑制劑(比例9∶1)置于漩渦混勻器震蕩混勻60 s；冰箱裂解(4℃)30 min，離心機離心(12 000 r/min，4℃，10 min)，取上層血清置于4 ml EP管中；加入二喹啉甲酸(BCA)后進行蛋白總濃度測定。

1.7.2檢測 取干凈清潔玻璃板，將玻璃短板與帶隔條玻璃板相對放置裝入板夾中，前后推動，底部對齊后扣上開關，待灌入分離膠；制備10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膠：雙蒸水3.3 ml，30%丙烯酰胺(29∶1)4.0 ml，1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 ml，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.1 ml，10%過硫酸銨0.1 ml，TEMED 4 μl；將分離膠從玻璃板左上角灌入，加至玻璃板的2/3高度后再緩慢地加入雙蒸水，水液封膠面，待其凝固后可見水與分離膠之間有一折射線，即可用濾紙吸干上層水液，加入濃縮膠；配制5%濃縮膠：雙蒸水2.7 ml，30%丙烯酰胺(29∶1)670 μl，Tris-HCl(pH6.8)500 μl，10% SDS 40 μl，10%過硫酸銨40 μl，TEMED 4 μl；灌入濃縮膠，在玻璃板間插入Teflon梳子，室溫放置10 min，待梳子之間的濃縮膠回縮，即可將玻璃板裝入電泳槽內(nèi)。電泳：將配好的膠放入電泳槽內(nèi)，加入電泳液(Tris 15.1 g，Glycine 94 g，SDS 5 g，蒸餾水1 000 ml)后，豎直向上拔除梳子，加入Marker，再將制好的蛋白樣品加入加樣槽內(nèi)，設定電壓80 V進行電泳，待Marker條帶漸進分開且蛋白樣品超過濃縮膠后，將電壓改為120 V進行電泳，當?shù)鞍讟悠肪嚯x電泳槽底 2 cm時終止電泳。轉膜：撬開玻璃板，刮去濃縮膠，切開分離膠，將凝膠反折180°置于轉膜液(蒸餾水1 L，Glycine 2.9 g，Tris 5.8 g，SDS 0.37 g)中，取所需大小的聚偏氟乙烯(PVDF)膜沒入轉膜緩沖液中，將濾紙、PVDF膜、凝膠和濾紙按順序依次放置在半干轉膜儀裝置上，倒入少許轉膜液后蓋好外蓋，連接電源設定電壓或電流，進行轉膜。封閉：轉膜完成后將PVDF膜放入5%脫脂牛奶TBST溶液(NaCl 8.8 g，Tris-HCl 8.0 20 ml，Tween-20 0.5 ml，蒸餾水1 000 ml)搖床封閉1.5～2.0 h。一抗孵育： 倒掉5%脫脂牛奶TBST溶液，抗體按照比例用抗體稀釋液稀釋，將PVDF膜放入含有稀釋好的一抗的密封袋中，置于4℃冰箱中過夜。洗膜：將PVDF膜放置搖床用TBST溶液漂洗3次，每次5～10 min。結合二抗：根據(jù)一抗來源選擇適合的二抗，抗體按照比例用抗體稀釋液稀釋，將PVDF膜放入密封袋中，加入稀釋好的二抗后置于37℃水平搖床上勻速搖動1.0～1.5 h。洗膜：結合二抗孵育后，將膜置于TBST溶液中洗滌3次，每次5～10 min。顯影：PVDF膜放于顯影儀器中，發(fā)光顯影液均勻滴涂在膜上，選擇程序曝光并顯影，可以清晰地顯示蛋白條帶。蛋白密度統(tǒng)計：應用Image J系統(tǒng)對各組細胞蛋白條帶灰度值進行分析，對其光密度強度進行掃描，測量各個條帶蛋白密度值，并使用Prism統(tǒng)計分析各組蛋白含量。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組ERG比較 正常組ERG振幅〔(953.27±15.80)μV〕明顯高于對照組〔(385.48±12.04)μV，P<0.05〕。治療低、中、高劑量組ERG振幅〔(575.13±8.66)、(708.60±18.32)、(688.47±8.70)μV〕均明顯高于對照組，且均明顯低于正常組(均P<0.05)。治療中、高劑量組ERG振幅數(shù)值顯著高于治療低劑量組(P<0.05)，治療中劑量組和治療高劑量組無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.2各組視網(wǎng)膜HE染色及外核層細胞比較 正常組視網(wǎng)膜細胞形態(tài)良好，排列整齊，結構層次清晰，外核層細胞排列緊密，大小均勻；對照組視網(wǎng)膜細胞形態(tài)排列紊亂，組織結構界限模糊不清，外核層細胞排列疏松，大小不一，可見空泡化及細胞水腫。治療低劑量組及治療高劑量組視網(wǎng)膜細胞排列不整齊，纖維間質部分水腫，偶見空泡；治療中劑量組細胞形態(tài)大致正常。見圖2。

a波-視錐細胞反應(3.0閃光刺激)，b波-視桿細胞反應(0.01閃光的刺激)圖1 各組小鼠ERG檢測結果

圖2 各組視網(wǎng)膜組織結構(HE，×40)

2.3各組視網(wǎng)膜外核層厚度比較 對照組視網(wǎng)膜外核層厚度〔(24.37±3.41)μm〕明顯低于正常組〔(31.2±1.43)μm，P<0.05〕。治療低、中、高劑量組視網(wǎng)膜外核層厚度〔(25.12±2.46)μm，(29.28±2.32)μm，(26.34±1.70)μm〕均明顯高于對照組且明顯低于正常組(均P<0.05)。治療中劑量組視網(wǎng)膜外核層厚度顯著高于治療低、高劑量組(P<0.05)，治療低劑量組與治療高劑量組無顯著差異(P>0.05)。

2.4各組caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2比較 與正常組相比，對照組凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax表達量顯著高于正常組，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著低于正常組(均P<0.05)；與對照組相比，治療低、中、高劑量組，凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax表達量均顯著低于對照組，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著高于對照組(P<0.05)。治療高劑量組凋亡蛋白caspase-3表達量顯著低于治療低、中劑量組(P<0.05)；治療各劑量組凋亡蛋白caspase-8表達量比較：治療低劑量組>治療高劑量組>治療中劑量組(均P<0.05)；治療中劑量組caspase-9、Bax表達量均顯著低于治療低、高劑量組(P<0.05)，而治療中劑量組抗凋亡蛋白Bcl-2表達量顯著高于治療低、高劑量組(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 Western 印跡檢測視網(wǎng)膜凋亡及相關蛋白水平

1～5：正常組，對照組，治療低劑量組，治療中劑量組，治療高劑量組圖3 Western印跡檢測各組視網(wǎng)膜凋亡及相關蛋白水平

3 討 論

視網(wǎng)膜是人體產(chǎn)生視覺的重要器官，極易受到內(nèi)、外致病因素的影響。過度的異常光刺激視網(wǎng)膜，會引起視網(wǎng)膜細胞死亡，經(jīng)光誘導細胞凋亡，形成視網(wǎng)膜光損傷。視網(wǎng)膜光損傷主要包括光的熱損傷、機械損傷和化學損傷。光的化學損傷被認為在視網(wǎng)膜光損傷中有重要作用〔3〕。與年齡相關性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性等疾病密切相關。視網(wǎng)膜細胞，特別是感光細胞的凋亡是最重要的發(fā)病機制〔6〕。

研究發(fā)現(xiàn)古日古木-13能通過轉化生長因子(TGF)-β信號通路影響RGC-5的增殖和凋亡〔5，6〕；古日古木-13可通過抑制慢性高眼壓青光眼模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的氧化應激反應和凋亡信號通路激活機制，保護視神經(jīng)功能。

視網(wǎng)膜電圖主要用于檢查視網(wǎng)膜功能狀態(tài)。根據(jù)調(diào)節(jié)不同的刺激條件和接受方式，可對視網(wǎng)膜各層疾病客觀地提供診斷依據(jù)，是一種無痛、無創(chuàng)的診斷方法。ERG的a 波起源感光細胞，因此 a 波振幅減小表示感光細胞功能受到損害。b 波起源于視網(wǎng)膜內(nèi)核層細胞，b 波下降表示視網(wǎng)膜內(nèi)信號傳導完整性受損〔7〕。

感光細胞和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞凋亡是視網(wǎng)膜光損傷的主要機制。導致細胞凋亡的因素包括光照的性質、強度，細胞的氧化反應，視紫紅質的水平，細胞基因的調(diào)控等〔8〕。而光損傷部位主要在光感受器和外核層。外核層主要由視錐細胞和視桿細胞組成，其內(nèi)含長鏈不飽和脂肪酸，最易受脂質過氧化反應的影響。當光子被視紫紅質吸收時，可激發(fā)電離，產(chǎn)生自由基，導致脂類過氧化，造成細胞膜的溶解、消失和視細胞的凋亡〔9〕。因此，測量視網(wǎng)膜外核層厚度常作為檢測視網(wǎng)膜細胞凋亡的指標，可以比較直觀地反映視細胞的損傷程度。

前期研究證實caspase-3、caspase-8、caspase-9在視網(wǎng)膜細胞凋亡中是重要的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，可接受多種信號刺激，激活下游底物種類繁多，誘導凋亡〔10，11〕。Bax、Bcl-2 基因是目前最重要的凋亡調(diào)控基因〔12〕，在凋亡信號轉導過程中發(fā)揮重要作用。其中 Bax 蛋白促進凋亡，Bcl-2 蛋白抑制凋亡。Bax、Bcl-2通過介導細胞色素C 等物質的釋放，阻止下游caspase 的活化，導致細胞凋亡，發(fā)揮上游調(diào)控作用。caspase-3 還可裂解 Bcl-2 蛋白，產(chǎn)生類 Bax 促凋亡活性片段來激活caspase-3，進而促進細胞凋亡。維持兩種蛋白的表達平衡是抑制細胞凋亡的關鍵〔13～15〕。