貴州蕓豆蟲(chóng)害菜豆象的調(diào)查與鑒定

趙 陽(yáng)，王 艷，林雪丹，羅阿東，陳 霄，李 潔，焦彥朝2，*

(1.六盤(pán)水市口岸服務(wù)中心，貴州 六盤(pán)水 553000；2.國(guó)家果蔬檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(六盤(pán)水)，貴州 六盤(pán)水 553000；3.貴陽(yáng)海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽(yáng) 550081)

菜豆象[Acanthoscelidesobtectus(Say)]屬鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchidae)三齒豆象屬(Acanthoscelide)，原產(chǎn)于南美和中美，目前已分布于亞洲、歐洲、非洲、美洲及大洋洲等5大洲。隨著國(guó)際經(jīng)濟(jì)貿(mào)易的頻繁往來(lái)，我國(guó)部分豆類(lèi)產(chǎn)地有菜豆象分布，與我國(guó)相鄰的日本、緬甸等國(guó)家亦有分布[1-2]。菜豆象主要危害菜豆屬的植物，同時(shí)也危害蠶豆、綠豆及豌豆等其他多種豆類(lèi)。其以幼蟲(chóng)在豆粒內(nèi)隱蔽蛀食，造成豆粒的品質(zhì)和重量下降，尤其對(duì)豆類(lèi)儲(chǔ)藏期間構(gòu)成較大威脅。研究表明，菜豆象危害不僅影響豆類(lèi)發(fā)芽率，降低產(chǎn)量，而且在豆類(lèi)儲(chǔ)藏期間的危害可造成重量損失達(dá)60%以上[3]，危害較大，被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[4]，在國(guó)際上被列為豆類(lèi)植物的重要檢疫對(duì)象之一[5-6]。由于菜豆象傳播范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)、危害嚴(yán)重、防治困難，因此該蟲(chóng)被農(nóng)業(yè)部列入《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單》，菜豆、蕓豆和豌豆等豆類(lèi)植物籽粒列入應(yīng)施檢疫的植物及植物產(chǎn)品名單[7]。根據(jù)《全國(guó)農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》，其中菜豆象在我國(guó)吉林、貴州及云南等3省44個(gè)縣(區(qū)、市)均已有疫情發(fā)生，且在貴州省內(nèi)37個(gè)縣(區(qū)、市)已有菜豆象危害[8]。

蕓豆也稱(chēng)菜豆，是菜豆象的高危寄主。蕓豆具有較高的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是貴州傳統(tǒng)的出口土特產(chǎn)，也是出口創(chuàng)匯的農(nóng)副產(chǎn)品，蕓豆出口排貴州農(nóng)產(chǎn)品出口的第4位[9-10]。貴州省是我國(guó)蕓豆主產(chǎn)區(qū)之一，是全國(guó)第3大蕓豆出口省[11]，蕓豆對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收具有重要意義。有研究顯示，貴州省菜豆象疫情較為嚴(yán)重[12]，畢節(jié)市所轄8個(gè)縣(區(qū))均有菜豆象疫情分布，有25萬(wàn)kg豆類(lèi)受害[13]，嚴(yán)重影響貴州省蕓豆的產(chǎn)量及品質(zhì)。

由于昆蟲(chóng)早期蟲(chóng)態(tài)(卵、幼蟲(chóng)及蛹)的形態(tài)學(xué)鑒定一直都是鑒定工作中的難點(diǎn)，往往需要培養(yǎng)至成蟲(chóng)才能準(zhǔn)確鑒定到種，通過(guò)種間細(xì)微的形態(tài)差異在口岸進(jìn)行檢疫檢驗(yàn)需要至少10 d的檢測(cè)周期，不適于口岸快速檢疫的要求[6]。PCR法特異性強(qiáng)、靈敏度高且便捷快速[14]，不受樣本發(fā)育階段的影響，適用于我國(guó)進(jìn)出境植物有害生物檢疫。鑒于此，針對(duì)貴州豆類(lèi)產(chǎn)品的特點(diǎn)，對(duì)貴州蕓豆樣品進(jìn)行隨機(jī)抽樣，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)菜豆象的發(fā)生進(jìn)行調(diào)查和鑒定，掌握貴州蕓豆中菜豆象疫情情況，以期為有效控制貴州蕓豆菜豆象的發(fā)生，提高有害生物檢疫技術(shù)，保障蕓豆產(chǎn)品出口安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及來(lái)源

1.1.1 蕓豆樣品 114份蕓豆樣品采集于貴州蕓豆主產(chǎn)地六盤(pán)水、畢節(jié)及主要集散地貴陽(yáng)等地市場(chǎng)，每份樣品約500 g。其中，貴陽(yáng)29份，編號(hào)GY1～GY29；六盤(pán)水26份，編號(hào)LPS1～LPS26；畢節(jié)59份，編號(hào)BJ1～BJ59；企業(yè)送樣223份，編號(hào)為QY1～QY223。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit，PCR反應(yīng)預(yù)混液Premix Taq(2×)，引物C1、C2，購(gòu)自Takara公司。

1.1.3 儀器 LXZ-260B270L人工氣候箱，寧波江南儀器廠；SZX16體視顯微鏡，日本OLYMPUS；5345梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf；Universal高壓電泳系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD；DOCXRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲(chóng)飼養(yǎng)方法 檢查豆粒上是否有幼蟲(chóng)注入孔，是否有“小窗”或羽化孔，每份樣品抽取一部分(盡量選取有蟲(chóng)眼的蕓豆，100 g)放入人工氣候箱。根據(jù)菜豆象的生物學(xué)特性，將人工氣候箱溫濕度調(diào)至菜豆象卵期、幼蟲(chóng)期最適的發(fā)育溫度30℃及相對(duì)濕度70%～80%，進(jìn)行人工飼養(yǎng)，以獲取昆蟲(chóng)成蟲(chóng)樣本[5，15]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 對(duì)飼養(yǎng)出的昆蟲(chóng)成蟲(chóng)，在體視顯微鏡下根據(jù)菜豆象的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行種類(lèi)鑒定。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 PCR擴(kuò)增體系：按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菜豆象成蟲(chóng)的DNA，利用菜豆象特異性引物(C1：GCCACCTTTCATGGAACTCAA，C2：TGCAAATACAGCTCCTATAGAAAGAACA)[16]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為192 bp。反應(yīng)總體系為50 μL，其中PCR反應(yīng)預(yù)混液Premix Taq(2×)25 μL、引物的終濃度均為0.2 μmol/L，模板DNA為200 ng，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)方法：取10 μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠和1×TBE緩沖液中電泳50 min(80 V)，GoldView溶液染色20 min后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

通過(guò)體視顯微鏡觀察，成蟲(chóng)體長(zhǎng)2～4.5 mm，頭、前胸背板及鞘翅表皮黑色，鞘翅端部邊緣橘紅色。腹部橘紅色，僅腹板基部有時(shí)呈黑色；臀板橘紅色。觸角11節(jié)，其中第1～4節(jié)呈橘紅色絲狀，有時(shí)包括第5節(jié)基半部；第5～10節(jié)呈黑色鋸齒狀；末節(jié)端部尖細(xì)，呈橘紅色。鞘翅密被黃色毛，在近鞘翅基部、中部及端部有裸色毛斑。后足腿節(jié)腹面近端有1長(zhǎng)而尖的大齒，后跟2～3個(gè)小齒，大齒的長(zhǎng)度約為前2個(gè)小齒的2倍，符合菜豆象的形態(tài)學(xué)特征，初步判定為菜豆象[5，15]。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

從圖1看出，以可疑菜豆象的成蟲(chóng)基因組DNA為模板，使用菜豆象、綠豆象和四紋豆象的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，僅菜豆象能夠擴(kuò)增得到1個(gè)分子量為192 bp的特異性條帶，與目標(biāo)基因分子量大小一致，而綠豆象、四紋豆象及空白對(duì)照均無(wú)特異性條帶產(chǎn)生，進(jìn)一步表明在蕓豆樣品中檢出了菜豆象。

注：M為D2000 DNA Marker，1～2為菜豆象，3～4為綠豆象，5～6為四紋豆象，7為空白對(duì)照。

2.3 蕓豆中菜豆象的發(fā)生與分布

2.3.1 蕓豆中菜豆象的發(fā)生 在114份產(chǎn)地樣品中菜豆象檢出數(shù)為9份，檢出率為7.9%；企業(yè)送樣的223份蕓豆樣品中菜豆象檢出數(shù)為0份，檢出率為0%；與企業(yè)送樣蕓豆樣品相比，市場(chǎng)來(lái)源樣品中存在菜豆象危害的風(fēng)險(xiǎn)較大。同時(shí)，形態(tài)學(xué)與PCR法菜豆象檢出結(jié)果一致，表明，PCR法可應(yīng)用于檢疫有害生物菜豆象。

2.3.2 菜豆象檢出蕓豆的種類(lèi)及來(lái)源 由表1可見(jiàn)，畢節(jié)市59份蕓豆樣品中檢出菜豆象2份，均來(lái)源于畢節(jié)市農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；貴陽(yáng)市29份蕓豆樣品中檢出菜豆象7份，其中，6份來(lái)源于貴陽(yáng)市糧油批發(fā)市場(chǎng)，1份來(lái)源于超市。菜豆象檢出蕓豆種類(lèi)覆蓋大蕓豆、紅蕓豆、大白蕓豆和紫花蕓豆等，涉及蕓豆種類(lèi)較廣；市場(chǎng)銷(xiāo)售的蕓豆仍需進(jìn)一步追溯其來(lái)源地。

表1 菜豆象檢出蕓豆種類(lèi)及來(lái)源

3 結(jié)論與討論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在市場(chǎng)銷(xiāo)售的蕓豆中檢出菜豆象，114份樣品檢出9份，檢出率為7.9%；企業(yè)送樣的蕓豆中未檢出菜豆象。究其原因：一是企業(yè)因?yàn)閺氖露嗄甑霓r(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易，具有較強(qiáng)的檢疫意識(shí)；二是蕓豆在企業(yè)銷(xiāo)售前都經(jīng)過(guò)人工挑選和熏蒸除害處理，提高了蕓豆品質(zhì)，降低有害生物的攜帶率和感染率。而市場(chǎng)銷(xiāo)售的蕓豆大多數(shù)從種植農(nóng)戶或經(jīng)銷(xiāo)農(nóng)戶手上收購(gòu)，未經(jīng)過(guò)任何加工和除害處理，攜帶有害生物的機(jī)率大幅增加。

形態(tài)學(xué)鑒定在昆蟲(chóng)成蟲(chóng)種類(lèi)鑒定中具有簡(jiǎn)單、直觀、快捷的優(yōu)勢(shì)，但需具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，否則在遇到近緣種或區(qū)別近似種上有可能出現(xiàn)鑒定錯(cuò)誤。同時(shí)，由于昆蟲(chóng)早期蟲(chóng)態(tài)的形態(tài)學(xué)鑒定往往準(zhǔn)確性不高，因而不適于口岸快速檢疫的要求[6]；而分子生物學(xué)鑒定周期短，且不受昆蟲(chóng)早期蟲(chóng)態(tài)的限制[16]，DNA是遺傳信息的載體，從其上獲得的信息既準(zhǔn)確又可靠，不會(huì)隨昆蟲(chóng)發(fā)育階段變化而不同，可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)上難以鑒別區(qū)分種類(lèi)的缺陷[17-18]。因此，該研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，2種方法互相驗(yàn)證，可同時(shí)鑒定貴州省蕓豆菜豆象疫情情況；同時(shí)也證實(shí)，為滿足今后檢疫工作發(fā)展的需要，可使用分子生物學(xué)鑒定方法鑒定處于不同發(fā)育階段菜豆象的蟲(chóng)害情況，縮短檢疫時(shí)間。

市場(chǎng)銷(xiāo)售的檢出菜豆象的蕓豆種類(lèi)覆蓋大蕓豆、紅蕓豆、大白蕓豆和紫花蕓豆等，涉及蕓豆種類(lèi)較廣，仍需進(jìn)一步追溯其來(lái)源地，有效控制蕓豆產(chǎn)地菜豆象危害繼續(xù)發(fā)生。

使用快速檢疫菜豆象的方法，可為企業(yè)豆類(lèi)產(chǎn)品出口提供技術(shù)支撐，促進(jìn)貴州蕓豆產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。同時(shí)應(yīng)加強(qiáng)與相關(guān)部門(mén)交流合作，實(shí)現(xiàn)資源信息共享，共同做好菜豆象的防控，擴(kuò)大貴州蕓豆出口。