黃芪注射液中次生成分作用于白細胞減少癥模型小鼠的代謝組學(xué)研究

曲婷麗 劉騰 鄭茜 盧曉林 趙正保 李震宇

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）17-2091-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.17.08

摘 要 目的：研究黃芪注射液中次生成分作用于白細胞減少癥模型小鼠的代謝組學(xué)。方法：將小鼠分為正常組、模型組、黃芪注射液組（0.004 mL/g）及其次生成分低、中、高劑量組（0.004、0.008、0.016 mL/g），每組7只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 mg/kg）以復(fù)制白細胞減少癥模型。造模成功后，各給藥組小鼠腹腔注射相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠腹腔注射等體積無菌注射用水，每天1次，連續(xù)7 d。實驗期間，每隔2 d測定小鼠的體質(zhì)量變化。末次給藥后，采用動物血液分析儀檢測小鼠的血常規(guī)指標(biāo)[白細胞（WBC）、中性粒細胞（NE）、淋巴細胞（LY）、單核細胞（MO）計數(shù)]，采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對小鼠血清進行代謝組學(xué)分析。結(jié)果：與模型組比較，次生成分低劑量組小鼠體質(zhì)量在給藥第4、8天時均顯著增加（P<0.05），次生成分各劑量組小鼠血清中WBC、NE、LY、MO計數(shù)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。經(jīng)代謝組學(xué)分析顯示，黃芪注射液中次生成分可顯著回調(diào)白細胞減少癥模型小鼠血清中亞精胺、尿酸、檸檬酸、煙酰胺、二十碳五烯酸、亞油酸、芥酰胺、1-磷酸鞘氨醇等8個差異代謝物的含量，其作用涉及亞油酸代謝途徑、煙酸和煙酰胺代謝途徑、三羧酸循環(huán)途徑。結(jié)論：黃芪注射液中次生成分具有升高白細胞減少癥模型小鼠白細胞的作用，其作用機制可能與干預(yù)亞油酸代謝途徑、煙酸和煙酰胺代謝途徑、三羧酸循環(huán)途徑有關(guān)。

關(guān)鍵詞 黃芪注射液;次生成分;代謝組學(xué);白細胞減少癥

Metabonomics Study on the Effects of Secondary Components of Astragalus membranaceus Injection on Leukopenia Model Mice

QU Tingli1，LIU Teng1，ZHENG Qian1，LU Xiaolin1，ZHAO Zhengbao1，LI Zhenyu2（1. School of Pharmacy， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China; 2. Modern Research Center of TCM， Shanxi University， Taiyuan? 030006， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study metabonomics of secondary components of Astragalus membranaceus injection on leukopenia model mice. METHODS： The mice were divided into normal group， model group， A. membranaceus injection group （0.004 mL/g）， secondary components low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.004， 0.008， 0.016 mL/g）， with 7 mice in each group. Except for normal group， other groups were given cyclophosphamide （80 mg/kg） intraperitoneally to induce leukopenia model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intraperitoneally， and normal group and model group were given constant volume of sterile water for injection intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 days. During the experiment， the changes of body weight of mice were measured every 2 days. After the last administration， the blood routine indexes [white blood cell （WBC）， neutrophil （NE）， lymphocyte （LY） and monocyte （MO） counts] of mice were detected by animal blood analyzer. UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS combined with multivariate statistical analysis were used to analyze the metabonomics of mice serum. RESULTS： Compared with model group， body weight of mice in the secondary component low-dose group increased significantly on the 4th and 8th day of administration （P<0.05）， and the counts of WBC， NE， LY and MO in serum of mice in secondary component groups increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. Metabonomic analysis showed that the secondary components of A. membranaceus injection could significantly regulate the contents of 8 endogenous metabolites in serum， including spermidine， uric acid， citric acid， nicotinamide， eicosapentaenoic acid， linoleic acid， erucamide and sphingosine-1-phosphate. Their effects involved linoleic acid metabolism pathway， nicotinic acid and nicotinamide metabolism pathway and tricarboxylic acid cycle pathway. CONCLUSIONS： The secondary components of A. membranaceus injection possess the effect of increasing white blood cells in leukopenia model mice， the mechanism of which may be related to intervention of linoleic acid metabolism pathway， nicotinic acid and nicotinamide metabolism pathway， and tricarboxylic acid cycle pathway.

KEYWORDS? ?Astragalus membranaceus injection; Secondary components; Metabolomics; Leukopenia

黃芪注射液是由黃芪藥材經(jīng)水提醇沉法制備而成，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第17冊）》（WS3-B-3335-98），具有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕等功效[1]。黃芪注射液中的化學(xué)成分主要包括初生成分和次生成分：初生成分為通過初級代謝活動所產(chǎn)生的植物體自身生長、發(fā)育、繁殖等所必需的物質(zhì)，如糖類、氨基酸類、有機酸類、核苷類成分等;次生成分是植物次生代謝所產(chǎn)生的一類植物體細胞生命活動和生長發(fā)育非必需的少量小分子有機化合物，如生物堿類、皂苷類、黃酮類、萜類成分等[2-11]。臨床研究報道，黃芪注射液具有升高患者體內(nèi)白細胞的作用[12-17]，但具體是黃芪注射液中哪類成分發(fā)揮的升高白細胞的作用尚不明確?；诖?，本課題組采用大孔樹脂吸附法，分離黃芪注射液中的次生成分，并采用分析速度快、靈敏度高、分辨率高的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS）[18]，研究黃芪注射液中次生成分作用于白細胞減少癥模型小鼠的代謝組學(xué)，以期為尋找黃芪注射液中具有升高白細胞作用的化學(xué)成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器與軟件

本研究所用主要儀器和軟件有：Q Exactive Orbitrap型高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo Scientific Q Exactive公司），KDC-149HR型離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），HEMAVET 950FS型動物血液分析儀（美國Drew Scientific公司），Xcalibur 3.2軟件、Compound Discoverer 3.0軟件（美國Thermo Fisher Scientific公司），Simca-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號1807163，規(guī)格10 mL/支），注射用環(huán)磷酰胺（德國Baxter Oncology GmbH 公司，批號8J270A，規(guī)格 0.2 g），D101大孔吸附樹脂（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號20190613），檸檬酸合成酶試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號BC1060）;乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（晉）2019-0001。所有小鼠均自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪注射液中次生成分的制備

取黃芪注射液20 mL，加入預(yù)處理過的D101大孔吸附樹脂柱中，以30倍柱體積的水洗脫后，再以10倍柱體積的70%乙醇洗脫;收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，即得黃芪注射液中次生成分（得率為10.0%）。臨用時，將該次生成分以無菌注射用水稀釋至20 mL（與原黃芪注射液中次生成分的濃度一致），備用。

2.2 黃芪注射液中次生成分的藥效作用研究

2.2.1 分組、造模與給藥 將小鼠分為正常組、模型組、黃芪注射液組（0.004 mL/g，劑量根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果設(shè)置[19-20]）和次生成分低、中、高劑量組（0.004、0.008、0.016 mL/g，劑量根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置），每組7只。除正常組小鼠腹腔注射等體積無菌注射用水外，其余各組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 mg/kg），連續(xù)3 d。當(dāng)模型組和各給藥組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)[白細胞（WBC）、中性粒細胞（NE）、淋巴細胞（LY）、單核細胞（MO）計數(shù)]與正常組小鼠上述指標(biāo)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，則表明白細胞減少癥模型復(fù)制成功[21]。造模成功后，各給藥組小鼠腹腔注射相應(yīng)藥物，正常組和模型組小鼠腹腔注射等體積無菌注射用水，每天1次，連續(xù)7 d。實驗過程中，每隔2 d稱定小鼠體質(zhì)量，并根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

2.2.2 小鼠體質(zhì)量變化考察 對“2.2.1”項下測得的各組小鼠體質(zhì)量，采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。結(jié)果顯示，造模前各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;給藥后第4、8天，模型組小鼠體質(zhì)量均較正常組顯著降低（P<0.05），黃芪注射液組和次生成分低劑量組小鼠體質(zhì)量均較模型組顯著升高（P<0.05），詳見表1。

2.2.3 樣本采集 末次給藥后，各小鼠均禁食禁水，次日進行眼眶取血，置于含抗凝劑乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）的EP 管中，以全血進行血常規(guī)指標(biāo)檢測;同法取血，不抗凝，于4 ℃條件下以3 500 r/min離心15 min，取上層血清于-80 ℃條件下保存，用于UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS代謝組學(xué)分析。

2.2.4 小鼠血常規(guī)指標(biāo)檢測 取“2.2.3”項下經(jīng)抗凝處理后的各組小鼠全血樣品，采用動物血液分析儀檢測血常規(guī)指標(biāo)。與正常組比較，模型組小鼠血清中WBC、NE、LY、MO計數(shù)均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，黃芪注射液組和次生成分各劑量組小鼠血清中上述指標(biāo)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與黃芪注射液組比較，次生成分低劑量組小鼠血清中上述指標(biāo)均顯著降低（P<0.01），次生成分中劑量組小鼠血清中WBC、NE、MO計數(shù)均顯著降低（P<0.05或P<0.01），次生成分高劑量組小鼠血清中WBC、MO計數(shù)均顯著降低（P<0.01），詳見表2。

2.3 小鼠血清樣品的代謝組學(xué)分析

參考文獻[20，22]，以UPLC-Q Exactive Orbitrap- HRMS法進行血清代謝組學(xué)分析。

2.3.1 血清樣本的處理 取“2.2.3”項下正常組、模型組、黃芪注射液組、次生成分低劑量組小鼠的凍存血清樣本100 μL于EP管中，加入甲醇225 μL和乙腈75 μL，渦旋2 min;再于4 ℃條件下以13 000 r/min離心15 min，取上清液，待測。另從上述各組待測上清液中分別取10 μL混合，作為質(zhì)控（QC）樣本。

2.3.2 UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS條件 （1）色譜條件：色譜柱為ACQUITYUPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%甲酸溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，2%B;2～3 min，2%B→35% B;3～15 min，35%B→70%B;15～18 min，70%B;18～29 min，70%B→98%B;29～31 min，98%B;31～33 min，98%B→2%B;33～35 min，2%B）;流速為0.2 mL/min;進樣量為5 μL;柱溫為40 ℃。（2）質(zhì)譜條件：采用加熱電噴霧離子源（HESI），噴霧電壓正極為3 500 V、負極為2 500 V，毛細管溫度為320 ℃，鞘氣流速為35 Arb，輔氣流速為10 Arb;采用正負離子切換采集模式，掃描模式為Full Scan/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率設(shè)定為MS Full Scan 3500 FWHM和MS/MS 17500 FWHM，掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100→1 500。

2.3.3 代謝物分析 將“2.3.1”項下的正常組、模型組、黃芪注射液組、次生成分低劑量組處理后的血清待測樣本及QC樣本，按“2.3.2”項下色譜與質(zhì)譜條件進行分析，于正負離子模式下，采集總離子流圖，詳見圖1（除正常組和模型組之外的其余組總離子流圖略）。由圖1可知，正常組和模型組小鼠血清中各代謝物色譜峰分離良好;在正負離子模式下，正常組和模型組小鼠的血清代謝物的種類和含量不同，說明兩組間的血清代謝物存在差異。基于此，筆者繼續(xù)采用多元統(tǒng)計分析法，進一步分析正常組和模型組之間血清代謝物的差異。

2.3.4 多元統(tǒng)計分析 將“2.3.3”項下所得的正常組和模型組血清代謝物原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)的“.raw”格式文件導(dǎo)入Compound Discover 3.0軟件進行提取和預(yù)處理，再將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2010軟件中進行面積歸一化處理;采用Simca-P 13.0軟件對經(jīng)面積歸一化處理后的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，根據(jù)正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）模型所得的變量投影重要度（VIP）值（VIP>1.0），并結(jié)合t檢驗（P<0.05），尋找差異代謝物[19]。通過查詢HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//enigma.lbl.gov/metlin/）、KEGG（https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html）等數(shù)據(jù)庫，指認兩組間的差異代謝物。結(jié)果顯示，共指認出21個差異代謝物，分別為脯氨酰胺、L-脯氨酸、甜菜堿、檸檬酸、L-異亮氨酸、乙酰肉堿、1-磷酸鞘氨醇、煙酰胺、L-苯丙氨酸、1-硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇、D-鞘氨醇、1-十七烷酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、溶血磷脂酰肌醇、亞精胺、鄰苯二甲酸酐、二十碳五烯酸、亞油酸、葡萄糖、鄰苯二甲酸二丁酯、尿酸、芥酰胺。

基于上述方法，將正常組、模型組、黃芪注射液組和次生成分低劑量組的血清代謝物原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，得到OPLS-DA得分圖（圖2）。由圖2可知，QC樣本數(shù)據(jù)聚在一起，說明本研究采用的UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS法用于代謝組學(xué)分析具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。黃芪注射液組數(shù)據(jù)比次生成分低劑量組數(shù)據(jù)距離正常組更近，說明黃芪注射液升高白細胞的作用強于其次生成分。進一步分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，次生成分低劑量組小鼠血清中亞精胺、尿酸、芥酰胺的相對含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），檸檬酸、煙酰胺、二十碳五烯酸、亞油酸、1-磷酸鞘氨醇的相對含量均顯著降低（P<0.01），表明黃芪注射液中次生成分可明顯回調(diào)小鼠血清中上述8個差異代謝物的相對含量，詳見圖3。

2.3.5 代謝通路分析 將小鼠血清中可被黃芪注射液中次生成分回調(diào)的8個差異代謝物名稱導(dǎo)入MetPA數(shù)據(jù)庫（http：//www. Metaboanalyst.ca）進行分析。結(jié)果顯示，黃芪注射液中次生成分治療白細胞減少癥可能與亞油酸代謝途徑、煙酸和煙酰胺代謝途徑、三羧酸循環(huán)途徑有關(guān)，詳見圖4。

2.3.6 檸檬酸合酶的檢測 檸檬酸合酶是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶[23]，基于此，本研究通過測定正常組、模型組、次生成分低劑量組小鼠心肌組織中檸檬酸合酶的活性，以驗證黃芪注射液中次生成分對三羧酸循環(huán)途徑的影響。具體方法如下：取血完成后，將各組小鼠處死，取其心肌組織適量，加10倍量（mL/g）生理鹽水進行勻漿處理，于4 ℃條件下以3 000 r/min離心10 min;取上清液，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，檢測檸檬酸合酶的活性。結(jié)果，與正常組[（59.11±0.75） mmol/（min·mg）]比較，模型組小鼠心肌組織中檸檬酸合酶活性[（49.51±0.94） mmol/（min·mg）]顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，次生成分低劑量組小鼠心肌組織中檸檬酸合酶活性[（57.68±0.60） mmol/（min·mg）]顯著升高（P<0.01）。

3 討論

3.1 黃芪注射液中次生成分對白細胞減少癥模型小鼠體質(zhì)量和白細胞的影響

動物體質(zhì)量的穩(wěn)定增長，可從側(cè)面反映藥物的療效，若給藥后動物的體質(zhì)量一直下降，說明藥物無治療作用或治療作用較小，且毒副作用可能較大，因此在藥效學(xué)實驗中常將動物的體質(zhì)量變化作為考察的指標(biāo)[24]。白細胞減少癥是一種外周血WBC數(shù)量持續(xù)低于4.0×109 L-1的疾病，而WBC主要包括NE、LY、MO[19]，因此通過測定WBC、LY、MO、NE計數(shù)的變化，可反映藥物是否具有升高白細胞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液中次生成分可升高白細胞減少癥模型小鼠的體質(zhì)量以及血清中的白細胞計數(shù)。

3.2 黃芪注射液中次生成分升高白細胞的代謝通路分析

黃芪注射液中次生成分治療白細胞減少癥可能與亞油酸代謝途徑、煙酸和煙酰胺代謝途徑、三羧酸循環(huán)途徑有關(guān);且本研究通過測定小鼠心肌組織中檸檬酸合酶的活性，也驗證了黃芪注射液中次生成分可通過作用于三羧酸循環(huán)，發(fā)揮升高白細胞的作用。

3.2.1 作用于亞油酸代謝途徑 黃芪注射液中次生成分作用于亞油酸代謝途徑與黃芪注射液一致[20]。環(huán)磷酰胺可升高白細胞減少癥模型小鼠血清中亞油酸的含量[25-27]，說明其可能通過作用于亞油酸代謝途徑引起白細胞減少。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪注射液中次生成分干預(yù)后，白細胞減少癥模型小鼠血清中亞油酸的相對含量顯著降低，由此說明，黃芪注射液次生成分可能通過作用于亞油酸代謝途徑發(fā)揮治療白細胞減少癥的作用。

3.2.2 作用于煙酸和煙酰胺代謝途徑 煙酰胺是輔酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的組成部分，參與了包括腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）形成在內(nèi)的200多種酶反應(yīng)[28]。煙酸是一種維生素，由煙酸腺苷轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為NAD+并參與細胞能量的代謝[29];其也可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為煙酰胺，抑制sirt1酶和parp1酶，并能調(diào)控細胞的乙?；吞腔痆30]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)環(huán)磷酰胺作用后，白細胞減少癥模型小鼠血清中煙酰胺相對含量顯著升高;經(jīng)黃芪注射液中次生成分干預(yù)后，模型小鼠血清中煙酰胺相對含量顯著降低。由此說明，黃芪注射液中次生成分可能通過作用于煙酸和煙酰胺代謝途徑發(fā)揮治療白細胞減少癥的作用。

3.2.3 作用于三羧酸循環(huán)途徑 檸檬酸是三羧酸循環(huán)的重要中間代謝物[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)環(huán)磷酰胺作用后，白細胞減少癥模型小鼠血清中檸檬酸相對含量顯著升高，說明環(huán)磷酰胺影響了模型小鼠血清中檸檬酸的代謝;經(jīng)黃芪注射液中次生成分干預(yù)后，模型小鼠血清中檸檬酸相對含量顯著降低，且檸檬酸合酶的活性顯著升高。由此說明，黃芪注射液中次生成分可通過影響三羧酸循環(huán)發(fā)揮治療白細胞減少癥的作用。

綜上所述，黃芪注射液中次生成分對白細胞減少癥模型小鼠具有明顯的治療作用，其作用機制與干預(yù)亞油酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、三羧酸循環(huán)有關(guān)。次生成分為黃芪注射液中具有升高白細胞作用的有效成分，但次生成分的種類較多，具體是何種成分發(fā)揮作用有待進一步研究。此外，由于UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS技術(shù)的檢測缺陷性，較難檢測到極性小的代謝物[18]，因此僅通過UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS技術(shù)分析黃芪注射液中次生成分治療白細胞減少癥的作用機制不夠全面;后續(xù)可采用核磁共振氫譜（1H-NMR）代謝組學(xué)技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）代謝組學(xué)技術(shù)等對黃芪注射液中次生成分治療白細胞減少癥的作用機制的研究進行完善。

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（收稿日期：2021-03-23 修回日期：2021-06-09）

（編輯：唐曉蓮）