不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

胡光，王芳，郎朗，姜新剛，吳瑞艷

1.樂泰藥業(yè)有限公司醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱 150025；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱 150076

酒精性肝病是由長期過量飲酒導(dǎo)致的肝臟損傷。初期常表現(xiàn)為脂肪肝，嚴(yán)重者表現(xiàn)為肝炎、肝纖維化和肝硬化[1]。主要發(fā)病機(jī)制是乙醇及其衍生物的代謝過程中直接或間接誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激、腸原性內(nèi)毒素、炎性介質(zhì)等多種因素相互作用的結(jié)果[2]。不覺曉口服液是由刺五加、首烏藤、柏子仁、遠(yuǎn)志提取而成，具有改善睡眠的功能。總黃酮是不覺曉口服液的主要有效成分，其每100 毫升含總黃酮5.7 g?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-4]，黃酮類化合物具有擴(kuò)張冠狀血管、降血脂、抗抑郁、抗氧化等作用。黃酮類化合物還可以提高生物體抗氧化及清除自由基的能力，其抗氧化原理主要是黃酮類化合物酚羥基上的氫原子與過氧自由基結(jié)合生成黃酮自由基，進(jìn)而與其他自由基反應(yīng)，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，起到抗氧化的作用[5-7]。

一次性乙醇灌胃，是常用的氧化損傷模型制備方法，乙醇通過產(chǎn)生過量自由基的引起多器官損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)[8-9]。目前不覺曉口服液用于肝臟氧化損傷方面的研究報(bào)道較少，因此該文針對(duì)不覺曉口服液對(duì)乙醇氧化損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究，以2020 年8—10 月期間選取100 只小鼠為研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品

不覺曉口服液（國食健字G20040683），人體推薦劑量為40 mL/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康ICR 小鼠（長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），體質(zhì)量約18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(吉)2018-0007。

1.3 儀器與試劑

多功能酶標(biāo)儀（TECAN infinite F50）、低溫高速離心機(jī)（Thermo Fisher Sorvail ST 8R）、電熱恒溫水浴鍋（DZKW-4）、紫外分光光度計(jì)（島津UV-1780）等儀器；谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測(cè)試試劑盒、超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所、無水乙醇（優(yōu)級(jí)純GR）等試劑。

1.4 方法

依據(jù)國食藥監(jiān)?；痆2012]107 號(hào)文件中，參考其中抗氧化功能評(píng)價(jià)方法。將小鼠隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、造模組及不覺曉口服液低、中、高3 個(gè)劑量組，20只組，每組雌雄各半。不覺曉口服液給藥量以人體推薦劑量的5、10、30 倍設(shè)3.33、6.67、20.00 mL/（kg·bw）3 個(gè)劑量組，空白組和造模組按照10 mL/（kg·bw）給予等體積的蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d，每隔6 d 稱重調(diào)整灌胃量。末次灌胃后，空白組不禁食水，而造模組和不覺曉給藥組禁食不禁水16 h，給予50%乙醇12 mL/（kg·bw）一次性灌胃，6 h 后眼球取血并取肝組織備用。

1.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

取每組小鼠血清和肝組織，血樣3 000 r/min 離心10 min，取上清備用；肝組織勻漿后備用；測(cè)定抗氧化物質(zhì)GSH、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA、肝組織蛋白的含量和抗氧化酶SOD 活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清及肝組織中GSH 含量對(duì)比

該次實(shí)驗(yàn)中對(duì)模型鼠的血清和肝組織分別進(jìn)行檢測(cè)，GSH 含量的變化見圖1、圖2 和表1。不覺曉口服液灌胃30 d 后，造模組與空白組相比，GSH 含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），血清和肝組織變化一致，表明乙醇氧化損傷造模成功。不覺曉口服液誘導(dǎo)的GSH 含量的變化具有性別差異，雄性組給予不覺曉口服液低、中、高劑量組與造模組相比均有顯著性變化,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；雌性組血清中GSH 僅高劑量組有顯著性影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肝臟組織GSH 含量為中、高劑量組有顯著性影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中GSH 的影響[(),μmol/L]

表1 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中GSH 的影響[(),μmol/L]

注：與空白對(duì)照組相比，#P＜0.05；與造模組相比，*P＜0.05

圖1 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠血清抗氧化物質(zhì)GSH 的影響

圖2 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠肝組織抗氧化物質(zhì)GSH 的影響

2.2 小鼠血清及肝組織中SOD 活性對(duì)比

造模組血清和肝組織中的SOD 與空白組相比活性顯著降低，乙醇影響了抗氧化酶SOD 的活性，造模成功。SOD 的含量變化見圖3、圖4 和表2。在血清和肝臟組織中，不覺曉口服液各劑量組與造模組相比較，SOD酶活性均有顯著性提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠血清抗氧化物質(zhì)SOD 的影響

圖4 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠肝組織抗氧化物質(zhì)SOD 的影響

表2 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中SOD 的影響[(),U/mgprot]

表2 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中SOD 的影響[(),U/mgprot]

注：#與空白對(duì)照組相比，P＜0.05；*表示與造模組相比，P＜0.05

2.3 小鼠血清及肝組織中MDA 含量對(duì)比

MDA 的含量變化見圖5、圖6 和表3。乙醇誘導(dǎo)氧化損傷，使體內(nèi)過氧化物含量增加，造模組與空白組的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MDA 含量明顯增加。給予不覺曉口服液后，與造模組相比，能夠明顯降低MDA 的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明不覺曉口服液具有抗氧化的作用。

圖5 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠血清抗氧化物質(zhì)MDA 的影響

圖6 不覺曉口服液對(duì)雌雄小鼠肝組織抗氧化物質(zhì)MDA 的影響

表3 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中MDA 的影響[(),nmol/mL]

表3 不覺曉口服液對(duì)小鼠血清和肝組織中MDA 的影響[(),nmol/mL]

注：與空白對(duì)照組相比，#P＜0.05；與造模組相比，*P＜0.05

3 討論

健康機(jī)體具有完整的抗氧化和抗炎防御體系，其中SOD 是主要的抗氧化酶，GSH 是主要的抗氧化物質(zhì)?？寡趸到y(tǒng)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，清除自由基，減少過氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)肝組織，減少氧化損傷[10]。當(dāng)乙醇一次性灌胃，攝入量超過清除能力，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 含量增加，損傷細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致氧化損傷[11]。MDA 是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的重要產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)自由基產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化發(fā)生的間接指標(biāo)，其含量變化反映氧化損傷的程度[12]。GSH 作為抗氧化物質(zhì)具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用，同時(shí)具有解毒的作用，當(dāng)GSH 含量減少甚至耗竭，說明機(jī)體受到氧化損傷，嚴(yán)重時(shí)可引起毒性作用，因此GSH 也是氧化損傷的重要指標(biāo)[13-14]?？寡趸窼OD 在正常生理狀態(tài)下，發(fā)揮清除氧自由基的作用，含量減少說明機(jī)體清除氧自由基的能力減弱[15]。該實(shí)驗(yàn)通過乙醇造成氧化損傷模型，對(duì)比各組間血清和肝組織的GSH 含量、SOD 活力、MDA 含量，說明不覺曉口服液的抗氧化功能。

該實(shí)驗(yàn)中造模組與空白組相比，MDA 含量明顯增加，GSH 和SOD 明顯減少，說明乙醇造成小鼠血清和肝組織中的氧化產(chǎn)物增加而抗氧化能力降低，模型構(gòu)建成功。該研究結(jié)果顯示，雌性組血清中GSH 的含量高劑量組（64.47±0.78）μmol/L 顯著高于造模組（60.83±1.35）μmol/L（P＜0.05）；雌性組肝臟組織中GSH 的含量中劑量組（3.32±0.18）μmol/L、高劑量組（4.20±0.34）μmol/L顯著高于造模組（1.70±0.08）μmol/L（P＜0.05）。在血清和肝臟組織中，不覺曉口服液低、中、高劑量組與造模組相比，SOD 活性均有顯著性提高（P＜0.05）；不覺曉口服液低、中、高劑量組與造模組相比，能夠明顯降低MDA的含量（P＜0.05）。低、中、高劑量與造模組相比較，可以使MDA 含量降低，GSH 和SOD 含量與造模組相比明顯增加，且血清與肝組織的變化一致，說明不覺曉口服液可以對(duì)抗酒精對(duì)肝臟的損傷，具有護(hù)肝作用[15]。

解慶凡等[16]的研究表明：血清、肝組織中低、高劑量組SOD 活性分別為（189.03±16.84）U/ml、（102.53±11.38）U/mg、（201.23 ±15.63）U/mL、（110.29 ±12.42）U/mg，血清、肝組織低、高劑量組MDA 含量分別為（3.78±0.42）nmol/mL、（9.05±1.14）nmol/mg、（3.61±0.28）nmol/mL、（8.76±1.21）nmol/mg，脂脈寧高、低劑量組血清、肝組織中SOD 活性均高于造模組，MDA 含量均低于造模組(P＜0.05)。張可蘭等[5]的研究表明：血清中三葉木通總黃酮低、中、高劑量組MDA、SOD、GSH-PX 分別為（6.50 ±0.48）nmol/mL、（6.37 ±0.90）nmol/mL、（6.19 ±0.90）nmol/mL、（160.64±19.32）U/mL、（189.49±18.15）U/mL、（195.14±17.38）U/mL、（197.62±18.96）U/mL、（231.43±27.15）U/mL、（234.67±22.56）U/mL，顯著高于造模組MDA、SOD、GSH -PX（7.43 ±0.66）nmol/mL、（137.41 ±17.44）U/mL、（172.38±22.46）U/mL，各給藥組大鼠血清MDA 含量顯著降低，SOD、GSH-Px 活性顯著升高(P＜0.05）。提示三葉木通總黃酮可能通過抗氧化作用保護(hù)肝損傷小鼠。董清清等[9]研究表明：肝組織中刺五加注射液低、中、高劑量組MDA 和GSH 的含量分別為（8.88 ±1.29）、（8.20 ±0.99）、（6.07 ±1.09）nmol/mgprot、（2.05 ±1.52）、（3.19 ±0.82）、（4.17 ±0.95）mg/gprot，顯著高于模型組（10.04±1.63）nmol/mgprot、（1.73±0.89）mg/gprot，與造模組比較，低、中、高劑量MDA 含量明顯降低(P＜0.05)，GSH 含量則增加(P＜0.05)。以上研究結(jié)果與該文研究結(jié)果相一致，該文中造模組中GSH、SOD 水平降低，而MDA 含量升高，說明小鼠攝入乙醇后體內(nèi)出現(xiàn)氧化損傷，自由基增多，脂質(zhì)過氧化物增多，SOD、GSH在抗氧化過程中損耗過多，處于低水平狀態(tài)。而不覺曉口服液低中高劑量組與造模組相比，SOD、GSH 水平升高，MDA 含量降低。

不覺曉口服液處方由刺五加、首烏藤、柏子仁、遠(yuǎn)志組成，其中刺五加具有一定的清除自由基能力和抗自由基活性[17]；首烏藤具有顯著的體內(nèi)抗氧化活性[18]；柏子仁具有遠(yuǎn)志具有抗衰老作用，可提高機(jī)體抗氧化能力[19]，經(jīng)過科學(xué)配伍后，可增強(qiáng)其抗氧化功效。不覺曉口服液中含有大量的總黃酮，黃酮類化合物具有清除自由基的作用[20]，且其濃度與清除活力成正相關(guān)。

綜上所述，不覺曉口服液通過提高血清及肝臟中抗氧化指標(biāo)的水平，清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，有效干預(yù)酒精對(duì)肝細(xì)胞的損傷，發(fā)揮其抗氧化和保護(hù)肝臟的作用，為保護(hù)肝臟類的藥品提供科學(xué)依據(jù)。