實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)結(jié)核桿菌的臨床價(jià)值

魏進(jìn)武，廖俐雅，余登瓊，吳朝菊，袁世梅

重慶市墊江縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 408300

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，是全球需要面對(duì)的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是我國(guó)重點(diǎn)控制的重大疾病之一。我國(guó)是全球30 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，位居全球第2 位[1]。每年新報(bào)告肺結(jié)核患者約80 余萬(wàn)例，位居甲乙類傳染病第2 位[2]，結(jié)核桿菌是引發(fā)肺結(jié)核的主要病原菌，該菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為特殊，具有較強(qiáng)的耐藥性，能夠抵抗多種藥物，形成耐藥性的機(jī)制較為復(fù)雜[3]。這種病菌能夠侵犯全身的器官，其中最為常見(jiàn)的就是肺部受到侵害，進(jìn)而形成肺結(jié)核。肺結(jié)核是一種具有較強(qiáng)傳染性的傳染性疾病，并且能夠通過(guò)空氣進(jìn)行傳播。實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢查是診斷結(jié)核病的主要手段。肺結(jié)核主要是通過(guò)藥物治療，如果患者化療無(wú)效、多重耐藥的厚壁空洞、大塊干酪灶結(jié)核性膿胸、支氣管胸膜瘺、大咯血保守治療無(wú)效，需要進(jìn)行肺結(jié)核外科手術(shù)治療[4]。針對(duì)肺結(jié)核，還應(yīng)做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，改善預(yù)后，促進(jìn)患者病情好轉(zhuǎn)。該次研究方便選取2018 年1 月—2020 年9 月該院門診和住院部接收的疑似肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，應(yīng)用涂片法、QT-PCR 法、固體培養(yǎng)法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)，并比較三者的優(yōu)異性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取該院門診和住院部接收的疑似肺結(jié)核的患者作為該次的研究對(duì)象，其中男性3 728 例，女性3 338例。納入標(biāo)準(zhǔn)：具有咳嗽、咳痰、低熱、盜汗、痰中帶血等癥狀或已診斷肺結(jié)核患者的密切接觸者的患者，且近1個(gè)月未進(jìn)行抗結(jié)核治療，同意參與該次研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：近1 個(gè)月進(jìn)行抗結(jié)核治療。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 抗酸染色液：冷染法；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒（QT-PCR 法）和核酸提取試劑（磁珠法）；核酸提取儀（型號(hào)：Lab-Aid808），PCR 熒光定量分析儀（型號(hào)：宏石SLAN-48P）；羅氏培養(yǎng)基。

1.2.2 檢驗(yàn)方法 嚴(yán)格按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》、商品試劑盒說(shuō)明書及儀器標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。

①標(biāo)本采集和處理：患者清晨起床后首先給予清水漱口，用力咳痰置于無(wú)菌痰杯中，立即送檢。涂片法連續(xù)3 d 留清晨痰液。

②固體培養(yǎng)法（56 例）：視樣本黏稠程度，加1～2 倍4% NaOH，震蕩使樣本液化，取液化后的標(biāo)本0.1～0.3 mL，以無(wú)菌操作接種于羅氏培養(yǎng)基斜面上，置培養(yǎng)箱中37℃孵育。7 d 后有菌落生長(zhǎng)，報(bào)固體培養(yǎng)法結(jié)核桿菌陽(yáng)性。若8 周內(nèi)未生成菌落，則報(bào)告陰性。

③痰涂片鏡檢（7 066 例）：取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分0.05 mL，在玻片正面均勻涂抹成10 mm×20 mm 的卵圓形痰膜，厚度為透過(guò)痰膜看報(bào)紙上的5號(hào)字時(shí)字跡較模糊為適宜，室溫中干燥后加熱固定，后加入石碳酸復(fù)紅染液室溫染色10 min，水洗后使用3%的鹽酸酒精脫色，再使用亞甲基藍(lán)復(fù)染0.5～1 min，水洗后等待自然干燥，最后放置在顯微鏡下查看。若淡藍(lán)色背景下可見(jiàn)紅色略帶彎曲的桿菌，且有分枝生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)即為陽(yáng)性[5]。

④QT-PCR 法檢測(cè)（942 例）：用1～2 倍體積的4%NaOH 溶液液化痰樣本，上機(jī)提取核酸，將提取好的核酸取30 μl 加入擴(kuò)增管（擴(kuò)增管中已預(yù)置反應(yīng)體系），震蕩混勻并瞬時(shí)離心后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件設(shè)置：UNG 處理50℃2 min，預(yù)變性95℃10 min ；Touchdown 循環(huán)程序：95℃10 s，71℃15 s（每個(gè)循環(huán)下降1℃），78℃15 s，循環(huán)10 次；PCR 循環(huán)程序：95℃10 s、61℃15 s、78℃15 s，循環(huán)45 次。每批次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰陽(yáng)對(duì)照及臨界水平對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)束按試劑盒說(shuō)明書要求分析結(jié)果，結(jié)果有效且樣本Ct 值≤25 判斷結(jié)果為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察3 組患者抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率。對(duì)比涂片法與QT-PCR 法抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率、特異性、靈敏度、準(zhǔn)確率。特異性=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100.00%；靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性人數(shù)）×100.00%；準(zhǔn)確率=（真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/總例數(shù)×100.00%。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。滿足正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)的計(jì)量資料以（）表示，多組樣本間差異比較采用單因素方差分析，如有顯著性差異，組間兩兩比較用LSD 法檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)，均作雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組患者納入對(duì)象一般資料比較

3 組患者的性別、年齡、病程3 項(xiàng)一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 3 組患者一般資料比較

2.2 3 組患者固體培養(yǎng)法抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率比較

共有561 例應(yīng)用固體培養(yǎng)法檢測(cè)，其結(jié)核桿菌的陽(yáng)性例數(shù)為205 例，陽(yáng)性率為36.54%。固體培養(yǎng)法將作為結(jié)核桿菌檢出的金標(biāo)準(zhǔn)。典型的結(jié)核桿菌菌落呈菜花狀，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1

圖2

2.3 3 組患者涂片法與QT-PCR 法抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率比較

涂片法結(jié)核桿菌的陽(yáng)性例數(shù)為162 例，陽(yáng)性檢出率為2.29%；QT-PCR 法結(jié)核桿菌的陽(yáng)性例數(shù)為281 例，陽(yáng)性率為29.83%，對(duì)比兩組的陽(yáng)性檢出率，QT-PCR 法高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3 組患者涂片法與QT-PCR 法抗酸桿菌陽(yáng)性檢出率比較[n(%)]

2.4 3 組患者涂片法與QT-PCR 法檢驗(yàn)靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率比較

對(duì)352 例同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)法、涂片法及QT-PCR法的病例進(jìn)行分析，以固體培養(yǎng)法結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。涂片法(取樣1～3 次，首次陽(yáng)性即記為陽(yáng)性，否則繼續(xù)采樣第2次或第3 次，有1 次陽(yáng)性則記為陽(yáng)性)檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率分別為69.78%、90.61%、82.39%；QTPCR 法檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率分別為83.45%、86.85%、85.51%，QT-PCR 法靈敏度明顯高于涂片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 352 例患者同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)、涂片和QT-PCR 檢測(cè)結(jié)果比較（%）

3 討論

肺結(jié)核是一種慢性傳染性疾病，該病是由結(jié)核分枝桿菌引起，會(huì)對(duì)患者全身的器官和組織造成傷害，對(duì)患者、家庭、社會(huì)均會(huì)帶來(lái)較為嚴(yán)重的危害。目前我國(guó)的肺結(jié)核發(fā)病率逐年升高，并且結(jié)核病當(dāng)中出現(xiàn)越來(lái)越多的耐藥型病例，1 例活動(dòng)性的肺結(jié)核患者每年可傳染引起20 例左右的新發(fā)感染者，20%患者在早期無(wú)明顯臨床癥狀或癥狀較輕微，因此在結(jié)核分枝桿菌感染的最初階段，快速檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌，才能有效地從源頭控制結(jié)核病的擴(kuò)散[6-7]。臨床常用的檢測(cè)肺結(jié)核的方式主要有直接涂片抗酸染色鏡檢，即該次研究所用的涂片法、液體培養(yǎng)法和羅氏固體培養(yǎng)法，該次研究使用固體培養(yǎng)法，并作為研究的金標(biāo)準(zhǔn)，以及該次研究探索的QT-PCR 法檢測(cè)，這種方法主要用于檢測(cè)結(jié)核桿菌核酸。

涂片法是3 種檢驗(yàn)方法中最早啟用檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作較為簡(jiǎn)單，便捷，且并不需要特殊儀器設(shè)備，適合無(wú)法開(kāi)展分子檢測(cè)的基層實(shí)驗(yàn)室使用。其局限性在于染色不僅結(jié)核分枝桿菌呈陽(yáng)性，而非結(jié)核分枝桿菌如麻風(fēng)桿菌也呈陽(yáng)性；該方法還容易受到溫度、染色時(shí)間、染色液質(zhì)量，以及操作人員的主觀意識(shí)影響；該方法使用的標(biāo)本并未進(jìn)行消化滅活，容易污染環(huán)境，老處理不當(dāng)會(huì)存在巨大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)；另外，標(biāo)本荷菌量較低時(shí)，鏡檢也不易查見(jiàn)抗酸桿菌，假陰性的概率特別大，要求檢測(cè)人員具備較高的技術(shù)水平和職業(yè)素養(yǎng)。據(jù)盛莉等[8]報(bào)道，留痰時(shí)留第1口痰和第2 口痰也會(huì)影響抗酸桿菌檢出率。多方面因素導(dǎo)致不易控制檢測(cè)工作的質(zhì)量，且涂片法單次送檢的陽(yáng)性率比文中所訴陽(yáng)性率更低，通常需多次送檢，在檢驗(yàn)的時(shí)效性與經(jīng)濟(jì)性上并不都優(yōu)于QT-PCR 法[9]。

固體培養(yǎng)法作為檢驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠有效降低因標(biāo)本產(chǎn)生的假陽(yáng)性和假陰性的干擾因素，能夠通過(guò)確定性的陽(yáng)性標(biāo)本去考核其他方法的真陽(yáng)性率。但該方法培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且非結(jié)核分枝桿菌也有生長(zhǎng)，實(shí)際工作中培養(yǎng)的菌落形態(tài)并非都能生長(zhǎng)成典型的菜花樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)規(guī)定要求，結(jié)核桿菌的培養(yǎng)物如需開(kāi)蓋進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，需在BSL-3 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行[10-11]。目前絕大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)尚不具備此條件，因此，只能依靠肉眼觀察菌落形態(tài)進(jìn)行鑒別，故會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性率的提升，且該方法的靈敏度較低。

QT-PCR 法檢測(cè)結(jié)核桿菌的特異性及靈敏度均較強(qiáng)，并且能夠?qū)Σ煌愋偷臉?biāo)本通過(guò)提取結(jié)核桿菌DNA 進(jìn)行精確的檢測(cè)，在很大程度上提高了結(jié)核桿菌檢測(cè)的真陽(yáng)性率和準(zhǔn)確性，適用于體外難于培養(yǎng)和生長(zhǎng)緩慢的病原體。QT-PCR 法根據(jù)試劑盒不同檢測(cè)的靶基因不同，包括插入序列6110(IS6110)、IS986、16Sr-RNA、MPB64、MTP40、65KD、2 個(gè)或多個(gè)序列聯(lián)合應(yīng)用等[12-14],該研究中所采用的試劑盒的靶基因是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群所特有的IS6110 基因，不會(huì)受到各種分枝桿菌種（如龜、鳥、土地、施式、堪薩斯、亞洲分枝桿菌等）的影響，確診的價(jià)值較為顯著。隨著全自動(dòng)核酸提取儀的普及，能夠進(jìn)行自動(dòng)化的批量操作，減少了人為因素的影響。但由于開(kāi)展分子檢測(cè)需要專門設(shè)計(jì)的基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，且需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)取得上崗資質(zhì)的人員才能進(jìn)行操作，故結(jié)核桿菌核酸檢測(cè)并未大范圍普及[15]，在應(yīng)用PCR 過(guò)程中還應(yīng)該注意一些問(wèn)題，例如在樣本收集、處理、運(yùn)送、保存過(guò)程中避免失誤，提高工作質(zhì)量，減少檢測(cè)的誤差，避免在處理標(biāo)本過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染等情況，降低假陽(yáng)性率和假陰性率[16]。該研究中，QT-PCR 法的靈敏度為83.45%，明顯高于涂片法，但仍然遠(yuǎn)低于廠家給定的靈敏度值，可能原因?yàn)椋孩贈(zèng)]有去污步驟，不排除存在PCR 抑制因子，在低菌量時(shí)影響較大；②固體培養(yǎng)法存在一定的假陽(yáng)性；③部分樣本過(guò)于黏稠，核酸提取前的樣本液化不完全。特異性為86.85%，導(dǎo)致特異性低的原因?yàn)椋号囵B(yǎng)陰性而分子檢測(cè)陽(yáng)性的例數(shù)稍多，標(biāo)本荷菌量太低可能會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)陰性結(jié)果，這與培養(yǎng)的手工操作和檢測(cè)的敏感度有關(guān)。

該次研究將該院門診與住院部收治的疑似結(jié)核病的患者作為研究對(duì)象，應(yīng)用3 種方式進(jìn)行結(jié)核桿菌檢測(cè)，結(jié)果顯示，7 066 張涂片中陽(yáng)性例數(shù)為162 例，陽(yáng)性率為2.29%；942 例樣本進(jìn)行了QT-PCR 法檢測(cè)，陽(yáng)性例數(shù)為281 例，陽(yáng)性率為29.83%；固體培養(yǎng)法的結(jié)核桿菌的陽(yáng)性例數(shù)為205 例，陽(yáng)性率為36.54%，由于固體培養(yǎng)法標(biāo)本均來(lái)源于結(jié)核門診，并且作為該次研究的金標(biāo)準(zhǔn)，因此陽(yáng)性率較高，但是依舊存在一定影響因素。而涂片法陽(yáng)性率過(guò)低，原因可能為：①方法學(xué)局限；②與該研究中樣本的來(lái)源有關(guān)，樣本來(lái)源于各臨床科室并非都來(lái)自于結(jié)核門診，該研究中的涂片法陽(yáng)性率也與相關(guān)報(bào)道的2.72%相近[17]。QT-PCR 法陽(yáng)性率高于涂片法,且樣本來(lái)源于涂片法相同，適合進(jìn)行比較。涂片法檢測(cè)的靈敏度為69.78%，QT-PCR 法靈敏度為83.45%，與呂純芳等[18]報(bào)道的靈敏度為83.7%的數(shù)據(jù)相近。QTPCR 法靈敏度高于涂片法（P＜0.05）。結(jié)果表明，QTPCR 法陽(yáng)性率、靈敏度、準(zhǔn)確率均優(yōu)于涂片法。涂片法影響因素較多，存在一定的漏診率。PCR 方法靈敏度和特異性均較高，并且較為平均，檢測(cè)的準(zhǔn)確性更高。

綜上所述，應(yīng)用QT-PCR 法檢測(cè)結(jié)核桿菌的應(yīng)用價(jià)值更高，優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片法，具有較高的陽(yáng)性率、特異性和靈敏度，且QT-PCR 法可在接收標(biāo)本的當(dāng)日得出檢測(cè)結(jié)論，時(shí)效性遠(yuǎn)優(yōu)于固體培養(yǎng)法。如同時(shí)在PCR基礎(chǔ)上應(yīng)用固體培養(yǎng)法，能夠增強(qiáng)準(zhǔn)確性，最終確定患者結(jié)核桿菌為陽(yáng)性，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率，因此可以臨床推廣，逐步替代涂片法。