基于硝基咪唑衍生物的Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)配合物的合成、晶體結構及生物活性

楊莉寧 劉春葉 成 昭 梁玲玲 張 劍

(西安醫(yī)學院藥學院，西安 710021)

咪唑作為許多酶的活性中心功能基團，參與了很多重要的生物化學反應，對生命活動起著十分重要的作用[1?3]。硝基咪唑類化合物與生物體內許多大分子如DNA、酶和受體等發(fā)生超分子結合[4]，產(chǎn)生廣泛的醫(yī)藥活性如抗病毒、抗結核、抗腫瘤、抗感染、抗寄生蟲等，因而備受人們的關注[5?7]。就其抗感染方面來說，硝基咪唑具有潛在的抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌活性，其中甲硝唑和替硝唑已被用于治療幽門螺旋桿菌引起的感染，顯示出硝基咪唑類化合物在研發(fā)新型抗菌藥領域的潛力。而甲硝唑作為最基本、最常見的硝基咪唑類藥物，由于在臨床上的長期使用，存在一定的耐藥性和不良反應，所以對甲硝唑進行結構修飾，增強其抗菌作用，減少不良反應，是近年來藥物化學領域的熱門課題[8?11]。

Cu是生命組織體內的微量元素。以有機酸和其它供體作為配體的Cu(Ⅱ)配合物廣泛存在于生物體內，并在化學和生物化學催化系統(tǒng)中起著很重要的作用[12]。在多種金屬蛋白(金屬酶)中，咪唑環(huán)中的氮原子是1個常見且很重要的鍵合點，如在藍色的銅蛋白中，都有一個或多個咪唑環(huán)鍵合到銅或其它金屬離子上，并因此對其生物活性造成極強的影響[13]。銀離子具有極強的廣譜抗菌、抑菌作用,同時對人體細胞具有較低的毒副作用。Nomiya曾發(fā)現(xiàn)咪唑銀配合物具有很強的抗菌能力[14]。

基于此，我們合成了硝基咪唑衍生物——N，N′?二甲基?5?硝基?2，2′?聯(lián)咪唑(L)(Scheme 1)，并以它為配體，得到了2種含過渡金屬Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)的配合物，對配體及其配合物與小牛胸腺DNA(ct?DNA)的相互作用及其抗厭氧菌活性進行了初步研究。

Scheme 1 Structure of ligand L

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

ct?DNA、三羥甲基氨基甲烷((CH3OH)3CNH2，Tris)、BHI(腦心浸液)培養(yǎng)液或培養(yǎng)基、瓊脂粉均為生化試劑，其余均為分析純試劑，用前未做進一步處理。蒸餾水為二次蒸餾水。配體L按文獻方法合成[15?16]。

所用儀器有Vario EL?ⅢG型元素分析儀(德國EA元素分析系統(tǒng)公司)、6460A型三重串聯(lián)四極桿液質聯(lián)用儀(美國 Agilent科技有限公司)、EQUI?NOX55型紅外光譜儀(德國Brucker公司)、STA449C型熱分析儀(德國NETZCH公司)、1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)、Ubbeoldhe黏度計(上海申玻玻璃儀器廠)、DDS?307型電導儀(上海大譜儀器有限公司)、F?4500熒光分光光光度計(日本日立公司)、Bruker SMART CCD單晶衍射儀(德國Bruker公司)、YQX?Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱(上海博泰實驗設備有限公司)、ELX 800TM酶標儀(美國Bio Tek公司)。

1.2 配合物的合成

[Cu(L)(Ac)2]2(1)：將 0.5 mmol Cu(Ac)2·H2O 和 0.5 mmol配體L分別溶于15 mL甲醇中，混合并攪拌1 h，過濾，濾液在室溫下放置，7 d以后有藍色晶體析出。元素分析按C24H30Cu2N10O12的計算值(%)：C 37.06，N 18.015，H 3.89；實驗值 (%)：C 37.05，N 17.81，H 3.65。

配合物[Ag(L)(NO3)]·H2O(2)：將 0.5 mmol AgNO3和0.5 mmol配體L分別溶于15 mL甲醇中，混合并攪拌2 h，過濾，得淡黃色粉末，避光保存。元素分析按 AgC8H11N6O6的計算值(%)：C 24.30，N 21.26，H 2.78；實驗值(%)：C 24.32，N 21.43，H 2.51。ESI?MS(乙腈為溶劑)：[Ag(L)]+m/z實測值(理論值)：315.19(315.019)。

1.3 配體及配合物與DNA相互作用實驗

采用文獻已報道的經(jīng)典方法，對實驗所需試劑及緩沖溶液進行配制，并測定配體及配合物與DNA相互作用的紫外光譜、熒光光譜及黏度[17?18]。

1.3.1 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的紫外光譜

室溫條件下，以Tris?HCl緩沖溶液作對照，測定時樣品池和空白池分別裝3 mL溶液(配體、配合物1和配合物2溶液濃度均為0.1 mmol·L-1)，在200～600 nm波長范圍掃描；依次加入濃度為80.7 μmol·L-1的DNA溶液0.02 mL(加5次)，每次加入DNA溶液后充分混合并作用5 min后再進行掃描。

1.3.2 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的熒光光譜

室溫條件下，在熒光光度計的比色皿中加入2 mL Tris?HCl緩沖溶液和1 mL濃度為0.1 mmol·L-1的配體或配合物溶液，再依次加入0.02 mL濃度為80.7 μmol·L-1的 DNA 溶液(加 5 次)，每次加入 DNA溶液后充分混勻并作用5 min，在一定激發(fā)波長激發(fā)下，分別掃描300～570 nm波長范圍內的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫都設置為10 nm。

1.3.3 配體及其配合物與ct?DNA相互作用的黏度

將待測溶液的溫度恒定在(25±0.1)℃，固定DNA溶液的濃度為80.7 μmol·L-1，每次分別加入濃度為0.1 mmol·L-1的配體、配合物1和配合物2溶液0.02 mL(加4次)，用烏氏黏度計測定含不同濃度配體、配合物1和配合物2的DNA溶液的相對黏度(η)。溶液的相對黏度按η=(t-t0)/t0計算，式中t0是緩沖溶液流經(jīng)毛細管所需的時間，t是DNA溶液(含濃度不等的配體或配合物)流經(jīng)毛細管所需的時間。η0是未加配體或配合物時DNA溶液的相對黏度。以(η/η0)1/3對結合比率(ccompound/cDNA)作圖，可得到配體或配合物的濃度對DNA的黏度影響曲線。

1.4 配合物晶體結構的測定

挑選大小為0.64 mm×0.38 mm×0.19 mm的配合物1單晶樣品，置于Bruker Smart APEX CCD單晶衍射儀上，采用經(jīng)石墨單色化的MoKα射線(λ=0.071 073 nm)為輻射源，在296(2)K下以φ?ω掃描方式收集配合物X射線單晶衍射強度數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)經(jīng)SAINT程序還原并對所得數(shù)據(jù)進行Lp強度因子校正，并經(jīng)SADBAS程序[19a]進行半經(jīng)驗法吸收校正。對氫原子采用各向同性熱參數(shù)，并用理論加氫法得到氫原子位置。采用全矩陣最小二乘法修正所有非氫原子坐標及其各向異性熱參數(shù)。晶體結構采用SHELXL?97[19b]程序由直接法解出。有關晶體學數(shù)據(jù)見表1。

表1 配合物1的晶體結構參數(shù)Table 1 Crystal parameters of complex 1

CCDC：2036599，1。

1.5 配體及其配合物的體外抗厭氧菌活性實驗[20]

采用經(jīng)典的2倍稀釋法藥物敏感試驗原理測定配體及其配合物的最小抑菌濃度(MIC)。所用菌株為變形鏈球菌(Streptococcus mutansUA159)、伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemATCC 29523)(由第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙體實驗室提供)。取凍存的變形鏈球菌(S.mutans)和伴放線放線桿菌(A.a)分別劃線接種于培養(yǎng)基表面，進行厭氧培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)36 h的S.mutans和培養(yǎng)48 h的A.a菌落各自接種于培養(yǎng)液，其中前者培養(yǎng)24 h，后者培養(yǎng)48 h，備用。用少量DMSO配制配體及其配合物的溶液作為待測抗菌劑，用無菌水對各種抗菌劑從1 280～0.625 mg·L-1進行2倍梯度稀釋。96孔板的每孔中分別加入上述各種濃度的待測抗菌劑溶液、細菌培養(yǎng)液和BHI培養(yǎng)液，用酶標儀進行OD值測定。取對照組(每孔以磷酸鹽緩沖鹽溶液代替待測抗菌劑溶液，其余同前)100 μL，進行10倍梯度稀釋，取100 μL稀釋的菌液鋪于BHI培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)48 h，得到每孔中原細菌生存數(shù)(同時對3個復孔進行計數(shù)，取平均值)。再于厭氧箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后，繼續(xù)測定OD值，得到MIC值。所有的試樣均平行測試3次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 配合物的性質表征

配合物2元素分析的實驗值與理論值基本相符，初步可以確定其可能組成。25℃下，測得配合物2(1 mmol·L-1)在乙醇中的摩爾電導率Λm*為27.42 S·cm2·mol-1，結果表明配合物2屬于非電解質[21]，硝酸根參與了配位。

以KBr壓片測定配體及其配合物的紅外光譜。與配體L相比較，形成各配合物后特征吸收峰發(fā)生的偏移主要表現(xiàn)在咪唑環(huán)上的振動吸收，其中νC=N伸縮振動和配體相比由1 530 cm-1向低波數(shù)(1 518～1 528 cm-1)發(fā)生了紅移且強度降低，這是N原子與金屬配位引起C=N核間電子密度降低造成的，說明金屬與咪唑環(huán)上的3位N發(fā)生了配位。配合物1中的醋酸根的Δν值(νas,COO-νs,COO)接近200 cm-1，與文獻報道[22]的醋酸根對稱橋聯(lián)配位模式的紅外吸收峰一致，說明醋酸根與2個Cu離子橋聯(lián)配位，晶體結構解析(見后文)也證明了這一結論。配合物2存在含氧酸根NO3-，在譜圖上表現(xiàn)為6條譜帶，分別為1 630、1 375、1 290 cm-1處的 νas,NO-3，1 100 cm-1處的，及 897和 870 cm-1處的 δNO-振動吸收，指紋區(qū)3譜帶增加，說明NO3-可能以單齒形式參與配位，配位后對稱性降低，使譜帶增多[23]。而位于指紋區(qū)的420 cm-1吸收峰可以歸因為配位鍵 νAg—N。

用Tris?HCl緩沖溶液配制配體L及其2種配合物(0.1 mmol·L-1)的溶液，測定它們的紫外可見吸收光譜(圖1)。圖1表明配體在200～400 nm范圍內有2個主要吸收峰，分別位于240和336 nm處，可分別歸屬為有機配體咪唑環(huán)共軛體系的π→π*和n→π*躍遷。2種配合物和配體呈現(xiàn)有類似的雙吸收峰，但吸收峰的強度發(fā)生了改變，同時配體的240 nm處的吸收峰在配合物中均發(fā)生了略微的藍移，這是金屬離子與配體發(fā)生配位的結果。

圖1 配體L和配合物1、2的UV?Vis光譜圖Fig.1 UV?Vis spectra of ligand L and complexes 1,2

在室溫條件下，分別測定了配體L和配合物2的固體熒光光譜(圖2)。在280 nm紫外光激發(fā)下，配體分別在471、485和493 nm處有弱的熒光發(fā)射峰，主要是配體內的π→π*躍遷所致。而配合物2在300 nm激發(fā)光激發(fā)下于421、452和468 nm處產(chǎn)生較強的藍光熒光發(fā)射光譜，相較于配體，其熒光發(fā)射峰發(fā)生了藍移，是由配體與金屬配位后配體的共軛程度降低而引起的[24]。

圖2 配體L和配合物2的固體熒光光譜Fig.2 Solid fluorescence spectra of ligand L and complex 2

在氮氣流速30 cm3·min-1、升溫速率20 ℃·min-1的條件下進行熱重分析，測得2種配合物從室溫到800或1 000℃溫度范圍內的熱重-示差掃描量熱(TG?DSC)曲線(圖 3)。

從圖3的TG曲線可以看出，配合物1的結構在200℃開始快速坍塌，失重率為41.35%，對應于配合物熔化并分解失去2個醋酸根及配體咪唑環(huán)上的硝基(理論值：42.21%)，同時DSC曲線上在226℃出現(xiàn)一個尖銳的吸熱峰，這與配合物的熔點一致。隨后直至接近1 000℃，配合物1緩慢失去剩余的二甲基聯(lián)咪唑殘片，最終的殘余物可能為Cu單質，殘余量15.67%，與理論值16.34%基本相符。

圖3 配合物1和2的TG?DSC曲線圖Fig.3 TG?DSC curves of complexes 1 and 2

配合物2的熱分解可以分為3步。在100～180℃為第一步的緩慢失去結晶水的過程，TG曲線平緩下降，失重率為4.66%(理論值：4.56%)，同時DSC曲線上對應在121℃出現(xiàn)一個很小的吸熱峰。DSC曲線在202℃有一尖銳的吸熱峰，可能是配合物熔化吸熱，同時TG曲線開始迅速下降，對應于配合物第2步分解，失去有機配體L，直到300℃左右，此時總失重實驗值為57.46%，與理論值56.96%相吻合。其后為第3步，殘余的AgNO3緩慢分解，失重趨勢變慢，從300～800℃殘余物含量一直在減小，可能為AgNO3分解所得的單質銀在高溫N2氣氛下不斷揮發(fā)所致。

綜合元素分析、UV?Vis光譜、紅外光譜、固體熒光光譜、質譜、摩爾電導率及TG?DSC等分析數(shù)據(jù)，根據(jù)硝基咪唑衍生物配合物的文獻[25]，初步確定配合物2的可能結構為二配位直線型的配合物，如Scheme 2所示。

Scheme 2 Structure of complex 2

2.2 配合物1的晶體結構

配合物1晶體屬于單斜晶系的C2/c空間群。單晶衍射結果表明，配合物1為一個對稱的雙核結構，含有4個配位的醋酸根，每一個醋酸根都是與2個銅離子二齒橋聯(lián)配位，Cu—O鍵長為0.195 5～0.198 9 nm(表2)，構成了槳輪籠型結構，其軸向分別被咪唑環(huán)上的N占據(jù)，Cu—N鍵長為0.219 1 nm。在雙核銅籠型結構中，2個銅離子間的距離(0.265 7 nm)比2個銅原子的范德華距離(0.286 nm)短，比2個銅離子的金屬半徑之和(0.255 nm)稍長，證明配合物中存在Cu與Cu之間的弱相互作用[26]。配合物中每個五配位的銅離子具有四方錐幾何構型，與Cu配位的4個氧原子是共面的，構成了四邊形的錐底，錐頂被軸向的咪唑環(huán)上N占據(jù)(圖4)。由于硝基及甲基的位阻效應，配體的2個咪唑環(huán)發(fā)生了很大程度的扭曲，環(huán)平面幾乎呈90°角。在相鄰分子之間，含硝基的咪唑環(huán)上的H6—C6與醋酸根的O6形成分子間氫鍵C6—H6…O6(C6…O6 0.246 4 nm，∠C6—H6…O6=138.13°)。醋酸根的甲基的H11—C11與配體咪唑環(huán)上未配位的3位N4也存在氫鍵C11—H11…N4(C11…N4 0.265 2 nm，∠C11—H11…N4=142.05°)。通過這些分子間氫鍵把各配合物分子連接成一維鏈，鏈與鏈之間又通過咪唑環(huán)的π?π堆積(咪唑環(huán)之間距離為0.334 9 nm)構筑為二維的層狀超分子結構(圖 5)。

圖4 配合物1的橢球概率30%的分子結構圖Fig.4 Molecular structure of complex 1 with thermal ellipsoids at 30% probability level

表2 配合物1的部分鍵長和鍵角Table 2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complex 1

圖5 配合物1的二維結構Fig.5 Two?dimensional structure of complex 1

2.3 配合物2溶液的穩(wěn)定性

室溫下測定了配合物2在Tris?HCl緩沖液(pH=7.1)中0、24、48 h的UV?Vis吸收光譜。圖6表明，在Tris?HCl緩沖液中，配合物2的UV?Vis光譜隨時間變化基本保持不變，表明配合物2在溶液中是基本穩(wěn)定的[27]。

圖6 配合物2在Tris?HCl緩沖液(pH=7.1)中的UV?Vis光譜Fig.6 UV?Vis spectra of complex 2 in Tris?HCl buffer(pH=7.1)

2.4 配體及配合物與ct?DNA相互作用

首先用紫外吸收光譜對配體L及其配合物與ct?DNA的相互作用進行了表征。從DNA濃度對配體及配合物1、2的紫外吸收光譜的影響可以看出(圖7)，隨著向配合物中滴加ct?DNA量的增加，配體L的紫外吸收表現(xiàn)為略微的減色效應，最大吸收峰幾乎沒有發(fā)生位移。而配合物1和2在240和340 nm附近的紫外雙吸收峰發(fā)生了擾動，尤其是240 nm附近電子吸收峰的位移和強度都發(fā)生了改變，其最大吸收峰發(fā)生了紅移(≥2 nm)，且有一定程度的增色效應。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是配合物與DNA結合，導致了溶液中配合物聚集以及配合物分子之間氫鍵的破壞[28?30]。

圖7 不同濃度的DNA存在時配體L及其配合物1、2的紫外吸收光譜Fig.7 UV absorption spectra of ligand L and its complexes 1,2 in the presence of DNA with different concentrations

采用熒光光譜對配體L及其配合物與ct?DNA的相互作用進一步進行研究。DNA濃度對配體及配合物1、2的熒光光譜的影響如圖8所示。隨著DNA濃度的增大，配合物1的熒光光譜強度明顯增加，這說明配合物1與DNA有較強的相互作用。而配體L及配合物2的熒光強度隨著DNA濃度的增加逐漸減小，發(fā)生明顯的減色效應。配體L的熒光發(fā)射峰發(fā)生了較大的紅移，配合物2的峰則未觀察到偏移。當小分子與DNA以靜電結合模式作用后，二者在水溶液中互相碰撞發(fā)生能量交換，可導致小分子的熒光光譜發(fā)生猝滅[31]。由此推測，配體及配合物2可能與DNA以靜電結合或溝渠結合模式相互作用。

圖8 不同濃度的DNA存在時配體L及其配合物1、2的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of ligand L and its complexes 1,2 in the presence of DNA with different concentrations

從配體L及配合物濃度對DNA黏度的影響曲線(圖9)可以看出，隨配體L及配合物2濃度的增加，DNA的相對黏度幾乎不變，可能是由于它們以靜電結合或溝渠結合模式與DNA相互作用，因為二者相互作用較弱，DNA雙螺旋結構未發(fā)生變化，因而黏度變化不大。這與光譜實驗結果一致。而DNA的相對黏度隨配合物1濃度的增加顯著降低，這說明配合物1可能以部分插入方式使DNA雙螺旋發(fā)生扭曲，導致其黏度減小[32]。

圖9 配體及其配合物1、2濃度增大對DNA黏度的影響Fig.9 Effects of increasing concentrations of ligand L and its complexes 1,2 on viscosity of DNA

2.5 配體及其配合物抗厭氧菌活性研究

對配體L及其配合物1、2進行抗厭氧菌活性試驗，并以經(jīng)典的抗厭氧菌藥物甲硝唑(Metronidazole)作為對照，測試結果如表3所示。結果表明，參與抑菌實驗的所有藥物對A.a的抑菌效果更強，而配體L對A.a的抑菌效果還要強于甲硝唑，其MIC值最小，但其2種配合物的抗A.a菌活性與甲硝唑相當，說明金屬離子并未起協(xié)同作用。而對于S.mutans的抑菌活性高低順序為配合物2>配體>配合物1，甲硝唑對變異鏈球菌幾乎無抗菌活性，說明這些藥物對不同厭氧菌菌株的抗菌性有一定的選擇性。

表3 配體L和配合物1、2及其他化合物對S.mutans和A.a的MICTable 3 MIC of ligand L,its complexes 1,2 and other compounds on S.mutans and A.a

硝基咪唑類化合物抑菌的作用機制研究結果表明，硝基咪唑類化合物能有效地滲透細菌的細胞膜，與細菌的DNA螯合形成復合物，抑制DNA復制，進而達到殺滅致病菌之功效[33]。雖然化合物與DNA相互作用的結果表明，配合物1與DNA相互作用較強，但其抗菌活性卻并非最高，說明金屬配合物抗厭氧菌機制不完全是靶向于細菌的DNA。金屬配合物抗厭氧菌機制較為復雜，還需要進一步研究。

3 結 論

設計、合成了N，N′?二甲基?5?硝基?2，2′?聯(lián)咪唑(L)的銅、銀配合物[Cu2(L)(Ac)2]2(1)和[Ag(L)(NO3)]·H2O(2)，測定了配合物1的單晶結構，通過元素分析、UV?Vis、FT?IR、固體熒光光譜、質譜、摩爾電導率及熱重分析等測試方法對配合物2進行了表征。結果表明有機配體L分別與醋酸銅、硝酸銀作用形成了結構不同的配合物，配合物1是一個由醋酸根橋聯(lián)的雙核對稱槳輪籠型結構的配合物，而配合物2可能是一個直線型的單核配合物。紫外吸收光譜、熒光光譜及黏度分析法的結果表明配合物1與ct?DNA相互作用模式可能為部分插入，而配體及配合物2則為靜電或溝渠作用模式。配體L對伴放線放線桿菌(A.a)表現(xiàn)出優(yōu)于甲硝唑的抗厭氧菌活性，有望成為一種有效的抗厭氧菌藥物。