活細(xì)胞樣本的液基制片及染色

曾賽凡，葉郁紅，陳余朋

病理學(xué)中的活細(xì)胞樣本是指將腫瘤細(xì)胞以較低密度接種于液體或半固體的培養(yǎng)液中形成懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系，對(duì)于已培養(yǎng)的活細(xì)胞需要轉(zhuǎn)移至玻片上進(jìn)行染色后鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞性質(zhì)的鑒定。本實(shí)驗(yàn)將活細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至液基固定瓶中進(jìn)行薄層制片，經(jīng)HE染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)取得良好效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系ECC-1(培養(yǎng)基PRMI 1640培養(yǎng)液加入10%胎牛血清)，傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中懸浮生長(zhǎng)，放置離心管中，普通離心機(jī)1 500 r/min離心5 min，用無(wú)菌的一次性塑料吸管吸取管底沉淀，滴入新柏液基保存瓶中固定靜置15 min。

1.2 細(xì)胞制片及染色將保存瓶放置新柏液基薄層T2000儀中制片，第一張制片放置95%乙醇中固定10 min,行蘇木精淡染評(píng)估細(xì)胞富集及重疊，若細(xì)胞平鋪均勻分布就繼續(xù)制片，若細(xì)胞重疊需按倍數(shù)稀釋固定液，肉眼觀察玻片劃定區(qū)域有灰白色的細(xì)胞富集印記，連續(xù)制片10張，放置95%乙醇中固定10 min后，從第10張往前推繼續(xù)淡染蘇木精篩查細(xì)胞量，選取有細(xì)胞量的玻片行HE染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色。免疫細(xì)胞化學(xué)指標(biāo)：鼠單抗CK(AE1/AE3)(1 ∶2 000，福州邁新公司)、p53(工作液，Dako公司)、PAX8(1 ∶1 000，福州邁新公司)，用子宮內(nèi)膜癌組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。采用免疫細(xì)胞化學(xué)EnVision法染色，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)抗原修復(fù)后，直接加入一抗，室溫下孵育30 min，二抗10 min，DAB顯色3 min，蘇木精復(fù)染1 min，脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

HE染色鏡下觀察細(xì)胞平鋪均勻分布，細(xì)胞呈圓形，核質(zhì)分明，細(xì)胞核呈藍(lán)色，核染色質(zhì)清晰可見(jiàn)，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)紅色(圖1)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色：CK呈細(xì)胞質(zhì)彌漫性棕色陽(yáng)性(圖2)，p53(圖3)及PAX8(圖4)呈細(xì)胞核棕褐色陽(yáng)性，背景干凈。

圖1 細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞核呈藍(lán)色，核染色質(zhì)清晰可見(jiàn)，核仁明顯，胞質(zhì)紅色 圖2 CK細(xì)胞質(zhì)呈彌漫性棕色，EnVision法 圖3 p53細(xì)胞核呈棕褐色，EnVision法 圖4 PAX8細(xì)胞核呈棕褐色著染，EnVision法

3 討論

活細(xì)胞液基薄層制片是通過(guò)過(guò)濾膜將細(xì)胞樣本中的細(xì)胞進(jìn)行過(guò)濾吸附至膜上，再通過(guò)負(fù)壓作用將濾膜上的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至帶正電荷的玻片上。懸液轉(zhuǎn)移至固定液時(shí)在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，避免污染對(duì)細(xì)胞鑒定的影響。液基薄層制片在婦科脫落細(xì)胞學(xué)樣本[1]中已廣泛使用，同樣在纖維支氣管鏡刷檢標(biāo)本[2]中也可富集到細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)也在活細(xì)胞樣本進(jìn)行細(xì)胞量的收集，對(duì)于活細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至保存液，細(xì)胞固定及時(shí)且充分，保證了細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整；預(yù)染觀察細(xì)胞分布情況是為了更好把握懸液與固定液的混合比例，制作玻片從第10張往前染色是為了檢查玻片細(xì)胞的富集情況；帶正電荷的玻片吸附性強(qiáng)，免疫細(xì)胞化學(xué)時(shí)抗原修復(fù)和沖洗不會(huì)掉片，活細(xì)胞液基薄層制片中無(wú)介質(zhì)參與，無(wú)需進(jìn)行背景消除，抗原滲透充分；形態(tài)學(xué)觀察獲得結(jié)構(gòu)清晰和染色鮮艷的細(xì)胞以及足夠的細(xì)胞量后，需用抗原標(biāo)記以確認(rèn)是否是內(nèi)膜腫瘤細(xì)胞，可用CK、p53、PAX8作為免疫細(xì)胞化學(xué)組合進(jìn)行標(biāo)記鑒定。文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]用瓊脂糖凝集培養(yǎng)細(xì)胞制成細(xì)胞塊切片行染色鑒定獲得良好的效果，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用薄層制片同樣也可獲得均勻平鋪細(xì)胞富集區(qū)域，且形態(tài)和抗原性完整的細(xì)胞玻片，其步驟簡(jiǎn)單，收集到的細(xì)胞單層、均勻、集中的分布于玻片直徑1.5 cm的區(qū)域內(nèi)，指定區(qū)域范圍可節(jié)省活細(xì)胞材料，減少閱片面積，縮短閱片時(shí)間。直觀的從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上篩查腫瘤細(xì)胞，再結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定腫瘤細(xì)胞?；罴?xì)胞液基薄層制片富集培養(yǎng)的細(xì)胞獲取更多的細(xì)胞學(xué)前期材料，分子病理學(xué)檢測(cè)有待進(jìn)一步驗(yàn)證效果。