利用Red/ET系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選敲除AcMNPV lef-10基因

白 玉，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

利用Red/ET系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選敲除
AcMNPVlef-10基因

白 玉，許曉東

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

【目的】 利用Red/ET系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選建立苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)晚期表達(dá)因子lef-10點突變載體，為進(jìn)一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?利用Red/ET系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選BAC修飾系統(tǒng)對AcMNPVlef-10進(jìn)行點突變，由于lef-10和必需基因vp1054有重疊，所以在敲除lef-10時只能通過引進(jìn)點突變使lef-10失活，避免影響vp1054的正常表達(dá)。首先，構(gòu)建rpsL-AMP篩選盒，然后在野生型AcBacmid中引進(jìn)點突變(方法是通過2次Red/ET重組：第1次重組在野生型AcBacmidlef-10中引進(jìn)rpsL-AMP抗性篩選標(biāo)記，形成一次重組Bacmid，第2次重組是在一次重組Bacmid中引進(jìn)含點突變的lef-10片段)，再利用鏈霉素反向篩選去除rpsL-AMP抗性篩選標(biāo)記，同時引入相應(yīng)的點突變。將從lef-10基因點突變重組菌中提取得到的AcBacmid與質(zhì)粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分別共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞，同時用野生型AcBacmid與質(zhì)粒pTriEx1.1共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞作為對照，顯微鏡下觀察病毒的復(fù)制情況，確定lef-10基因是否為AcMNPV的必需基因。【結(jié)果】 通過對重組Bacmid的PCR鑒定和點突變序列的測定，證明AcMNPVlef-10基因已經(jīng)發(fā)生點突變；通過共轉(zhuǎn)染試驗發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，lef-10補回型病毒和野生型病毒一樣，均能在Sf9細(xì)胞中復(fù)制產(chǎn)生具有感染性的子代病毒粒子BV，從而對鄰近細(xì)胞造成二次感染，使得細(xì)胞死亡，且lef-10補回型重組病毒產(chǎn)生感染性病毒粒子的能力與野生型基本一致；而由于lef-10缺失型重組病毒不能產(chǎn)生有感染性的病毒粒子，所以在被lef-10缺失型重組病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，細(xì)胞數(shù)目不會隨著轉(zhuǎn)染時間的增加而發(fā)生明顯改變?！窘Y(jié)論】 利用Red/ET重組系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選系統(tǒng)可以在AcMNPVlef-10基因中引入點突變，且lef-10是桿狀病毒生活周期中的一個必需基因，其缺失會影響桿狀病毒的復(fù)制。

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)；lef-10；Red/ET重組系統(tǒng)；rpsL反向篩選系統(tǒng)；基因敲除

桿狀病毒是一類專性寄生于昆蟲和某些甲殼類無脊椎動物的病原微生物，根據(jù)其包涵體的形態(tài)可分為2個屬，即核多角體病毒屬(Nucleopolyhedrovirus，NPV)和顆粒體病毒屬(Granulovirus，GV)[1]。苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒屬的代表成員，是一類在宿主細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的DNA病毒。其基因組長134 kb，共有154個開放閱讀框。AcMNPV基因的表達(dá)可分為4個階段：立即早期基因表達(dá)、早期基因表達(dá)、晚期基因表達(dá)和極晚期基因表達(dá)。

早期基因主要為病毒基因組DNA復(fù)制和晚期基因表達(dá)提供必需的蛋白因子。晚期基因的表達(dá)依賴于病毒基因組DNA的復(fù)制，并通過一種病毒編碼或病毒改造過的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，同時需要一類蛋白因子調(diào)控其表達(dá)，即晚期表達(dá)因子(Late expression factor，lef)。

瞬時表達(dá)試驗證明，AcMNPV中已鑒定的19種lef基因[2-3]中有11種與病毒DNA的復(fù)制有關(guān)，即lef-1[4]、lef-2[5]、lef-3[6-7]、lef-7[8]、lef-11[9]、p143[7]、dnapol[10]、ie1[11]、ie2[12]和p35[13]，另外lef-10基因也可影響病毒DNA的復(fù)制水平[14]。其中l(wèi)ef-1、lef-2、lef-3、p143、lef-11、dnapol和ie1是DNA復(fù)制的必需基因，lef-10、lef-7、ie2和p35是促進(jìn)DNA復(fù)制的基因。p35對DNA復(fù)制的促進(jìn)作用與其抗細(xì)胞凋亡功能有關(guān)。lef-1和lef-2既是DNA復(fù)制的必需基因，也是調(diào)控晚期基因表達(dá)的基因。其他參與晚期基因表達(dá)調(diào)控的基因有l(wèi)ef-4[15]、lef-5[16]、lef-6[17]、lef-8[15]、lef-9[15]、lef-10[7,12]、lef-12[18]、39k[19]和p47[15]，但除lef-10之外，這些基因均不參與病毒基因組DNA的復(fù)制。

在19個晚期表達(dá)因子中，目前關(guān)于AcMNPVlef-10基因功能的研究還比較少。lef-10基因位于AcMNPV基因組33.8～35.9圖譜單位，并且呈順時針方向排列，其編碼一個由78個氨基酸組成的小蛋白，分子質(zhì)量為8.7 ku，等電點為3.6，是迄今鑒定的分子質(zhì)量最小的晚期表達(dá)基因的產(chǎn)物。lef-10的同源基因在所有的GroupⅠ和大部分GroupⅡ桿狀病毒中都存在[2]。瞬時表達(dá)試驗證明，lef-10與晚期和極晚期基因表達(dá)有關(guān)，但與早期基因表達(dá)無關(guān)[7]。lef-10也是晚期基因有效表達(dá)的必需基因[7]。當(dāng)用家蠶核多角體病毒(BmNPV)lef-10缺失突變體轉(zhuǎn)染BmNPV細(xì)胞時，檢測到子代病毒滴度為零，病毒基因組復(fù)制水平下降，基因轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降，同時也未檢測到早期基因lef-3的表達(dá)，這些結(jié)果表明，BmNPVlef-10對于病毒基因組DNA的復(fù)制及晚期基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用，還會影響早期基因的表達(dá)水平[14]。

雖然研究證實lef-10基因在BmNPV的生活周期中是必需基因，但并不表明在AcMNPV中也是必需的，如Ac16是AcMNPV的結(jié)構(gòu)蛋白，對于出芽型病毒(BV)和包涵體病毒(ODV)的形成具有重要作用，但卻不是BmNPV的結(jié)構(gòu)蛋白，其缺失不會影響B(tài)mNPV中BV和ODV的形成[20-21]。Ac31[22-23]和Ac68[24-25]是BmMNPV復(fù)制所必需的基因，但這2個基因的缺失卻不會影響AcMNPV在昆蟲細(xì)胞中的復(fù)制。Ac74、Ac88、Ac102和Ac129/He118與AcMNPV ODV的形成有關(guān)，卻與棉鈴蟲核多角體病毒(HearNPV) ODV的形成無關(guān)[21,26]。

本試驗用到的反向篩選標(biāo)記基因為rpsL-AMP，這段基因中含有氨芐青霉素抗性基因和鏈霉素抗性抑制基因，將此基因?qū)隑acmid中并轉(zhuǎn)化到特定的大腸桿菌株系(有鏈霉素抗性的HS996、DH10B等株系)后，會使得大腸桿菌獲得氨芐青霉素抗性并抑制其本身的鏈霉素抗性，而用外源基因通過重組的方法將此標(biāo)記基因替換后，菌株的鏈霉素抗性恢復(fù)而氨芐青霉素抗性消失，從而能方便地在大腸桿菌中獲得lef-10點突變的重組桿狀病毒質(zhì)粒。本試驗利用鏈霉素反向篩選方法，在lef-10基因中引入點突變，盡量避免對lef-10臨近基因上下游調(diào)控序列的擾動，首次利用Red系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選成功敲除了AcMNPVlef-10基因，以期為進(jìn)一步研究AcMNPVlef-10基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌Top10(EscherichiacoliTop10)、大腸桿菌HS996(EscherichiacoliHS996)(含AcMNPV Bacmid DNA和Red/ET 重組質(zhì)粒 pRedET)、大腸桿菌BL21(DE3)、載體pTriEx1.1和Sf9細(xì)胞，皆由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子病毒學(xué)實驗室保存；AcMNPV Bacmid來源于 University of Reading，Prof.Ian Jones實驗室。

1.2 主要試劑

高載量PCR片段純化試劑盒和柱式DNAback試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，限制性內(nèi)切酶BspHⅠ、NcoⅠ和XhoⅠ及T4 DNA連接酶均購自Fermentas公司，DL5000 DNA Marker購自Vazyme公司，酵母浸粉和蛋白胨均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ugene HD轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司，胎牛血清購自Thermo Scientific HyClone公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

研究用到的引物均用Primer Premier 5軟件設(shè)計(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 rpsL-AMP篩選盒的構(gòu)建

本試驗用到的反向篩選標(biāo)記基因為rpsL-AMP，該基因是從rpsL-AMP篩選盒中通過PCR擴增得到的，所以首先需要構(gòu)建1個rpsL-AMP篩選盒，構(gòu)建過程(圖1)如下。

1.4.1rpsL基因的PCR擴增rpsL基因是通過2次PCR反應(yīng)得到的，第2次PCR反應(yīng)的目的是為了在rpsL基因的3′末端引進(jìn)一個SD序列，使未來構(gòu)建的篩選盒中的AMP基因可以利用此序列進(jìn)行翻譯。具體做法如下：

以大腸桿菌BL21(DE3)基因組DNA為模板，用引物rpsL-UP/rpsL-Down-Amp進(jìn)行PCR擴增，擴增體系為：大腸桿菌BL21(DE3)單菌落用接種針挑一下作為模板， 10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-UP 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min， 最后16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用柱式DNAback試劑盒純化，再以純化后的片段為模板，用引物rpsL-UP/rpsL-Down-Amp-1進(jìn)行PCR擴增，擴增體系為：模板rpsL1 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-UP 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp-1 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min,最后16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用高載量PCR片段純化試劑盒純化，-20 ℃保存。

圖1 rpsL-AMP篩選盒的構(gòu)建過程

1.4.2 pTriEx-rpsL質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BspHⅠ和XhoⅠ對上述第2次擴增的PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收；NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切pTriEx1.1質(zhì)粒，切膠回收酶切后的大片段，然后與酶切回收的PCR產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌落接種至含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min過夜搖菌，用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并對其用XbaⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司測序，構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為pTriEx-rpsL。

1.4.3rpsL-AMP片段的PCR擴增 以pTriEx-rpsL質(zhì)粒為模板，用引物rpsL-AMP-UPNew/rpsL-Down-Amp-1進(jìn)行PCR擴增，該擴增產(chǎn)物包含了ColEI的復(fù)制起始位點。擴增體系如下：pTriEx-rpsL質(zhì)粒0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物rpsL-AMP-UPNew 1 μL，10 μmol/L下游引物rpsL-Down-Amp-1 1 μL，Taq酶 0.5 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 210 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min, 最后16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用柱式DNAback試劑盒純化，-20 ℃保存。

1.4.4 prpsL-AMP質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BspHⅠ對1.4.3中PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行部分單酶切，然后用柱式DNAback試劑盒回收大片段，將回收的酶切產(chǎn)物在T4 DNA連接酶作用下16 ℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h，挑單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌落接種至含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min過夜搖菌，用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并對其用BspHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性克隆的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司測序，構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒命名為prpsL-AMP。

1.5 lef-10-KO-Bacmid的構(gòu)建

1.5.1 一次同源重組線性片段lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的制備 通過對lef-10進(jìn)行保守區(qū)間分析以及參考lef-10上下游基因的轉(zhuǎn)錄分析，在lef-10基因起始密碼子ATG下游12 bp處插入rpsL-AMP片段，造成插入突變以破壞lef-10的結(jié)構(gòu)。但該片段的插入可能會影響lef-10下游基因vp1054的表達(dá)，所以需要利用rpsL反向篩選敲除策略進(jìn)行二次重組，用含lef-10點突變的Linker DNA片段將rpsL-AMP替換出去，造成lef-10點突變，以最大限度地破壞lef-10的結(jié)構(gòu)而又不影響其下游基因的表達(dá)。

為了通過ET重組完成對lef-10基因的插入缺失，參照AcMNPV基因組全序列[27]和已構(gòu)建好的prpsL-AMP質(zhì)粒序列，用Primer Premier 5軟件設(shè)計特異性擴增引物對10rpsLF/10AMPR和lef10MF/lef10MR(表1)。10rpsLF/10AMPR引物對分別由AMP基因的引物區(qū)域和rpsL基因的引物區(qū)域組成。lef10MF/lef10MR引物對均由兩部分組成，分別是lef-10的同源臂區(qū)域和AMP基因的引物區(qū)域以及l(fā)ef-10的同源臂區(qū)域和rpsL基因的引物區(qū)域。lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的同源臂區(qū)域長50 bp，為lef-10基因中被插入?yún)^(qū)域上下游50 bp的序列。PCR反應(yīng)以prpsL-AMP質(zhì)粒為模板，進(jìn)行兩輪擴增，擴增產(chǎn)物即為lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR。具體做法如下：

以prpsL-AMP質(zhì)粒為模板，用10rpsLF/10AMPR進(jìn)行第一輪PCR擴增，擴增體系如下：prpsL-AMP質(zhì)粒0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物10rpsLF 1 μL，10 μmol/L下游引物10AMPR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 80 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min, 最后16 ℃保存。PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用柱式DNAback試劑盒純化，再以純化后的片段為模板，用引物lef10MF/lef10MR進(jìn)行第二輪PCR擴增，擴增體系為：模板 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物lef10MF 1 μL，10 μmol/L下游引物lef10MR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min,最后16 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余的加入5 μL 3 mol/L NaAc(pH 7.0)和150 μL 體積分?jǐn)?shù)100% 乙醇進(jìn)行沉淀，于-20 ℃放置30 min， 12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀在超凈臺上風(fēng)干5～10 min，加入5 μL 10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解，-20 ℃保存。

1.5.2 一次重組Bacmid的構(gòu)建 挑取EscherichiacoliHS996 (含AcMNPV Bacmid DNA和Red/ET 重組質(zhì)粒 pRedET)單克隆，接種到含卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的菌液，培養(yǎng)至OD600為0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至終質(zhì)量濃度 3～4 g/L后于37 ℃培養(yǎng)0.75～1 h，按Counter-Selection BAC Modification Kit的方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將1 μL乙醇沉淀回收的lef10MF-rpsL-AMP-lefMR線性化片段和EscherichiacoliHS996感受態(tài)細(xì)胞混合后，轉(zhuǎn)入電擊杯中，用SCIENTZ-2B基因?qū)雰x進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊參數(shù)設(shè)置為電壓 1 350 V，電容5 μF，電阻600 Ω。電擊后立刻加入1 mL的不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，30 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，然后涂布于含氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的LB固體平板上，30 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5.3 一次重組Bacmid的PCR鑒定 隨機挑取抗氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素的單菌落，用不同的引物組合進(jìn)行PCR擴增，以驗證lef-10基因是否發(fā)生插入突變。所用的擴增引物分別為lef-10基因的上、下游引物lef10-promoter-F和lef10-39R(表1)及rpsL-AMP基因內(nèi)部引物對rpsL-AMP-UPNew和10AMPR。不同組合分別為lef10-promoter-F/10AMPR和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。所有的PCR反應(yīng)都用野生型病毒Bacmid作為對照。

1.5.4 二次同源重組線性片段lef10MF-Linker-lef10MR的制備 參照AcMNPV基因組全序列，用Primer Premier5軟件設(shè)計特異性Linker DNA引物10MlinkF和10MlinkR(表1)，引物中的劃線部分為引進(jìn)的點突變，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

分別取10MlinkF和10MlinkR各20 μL混合均勻，在PCR儀上進(jìn)行高溫變性-低溫復(fù)性反應(yīng)：95 ℃ 40 s，16 ℃ 30 s，使Linker DNA成為雙鏈。以雙鏈Linker DNA為模板，用引物lef10MF/lef10MR進(jìn)行PCR擴增，擴增體系為：模板 0.1 μL，10×TaqBuffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，25 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L上游引物lef10MF 1 μL，10 μmol/L下游引物lef10MR 1 μL，Taq酶 0.25 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 15 s，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min, 最后16 ℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余的加入5 μL 3 mol/L NaAc(pH 7.0)和150 μL體積分?jǐn)?shù) 100% 乙醇進(jìn)行沉淀，于-20 ℃ 放置30 min, 12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌，12 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀在超凈工作臺上風(fēng)干5～10 min，加入5 μL 10 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解，-20 ℃保存。

1.5.5 二次重組Bacmid的構(gòu)建 挑取一次重組的EscherichiacoliHS996單克隆接種到含氨芐青霉素(50 μg/mL)、卡那霉素(15 μg/mL)和四環(huán)素(3 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)的菌液，培養(yǎng)至OD600為0.2～0.3，加入L-阿拉伯糖至終質(zhì)量濃度3～4 g/L后于37 ℃培養(yǎng) 45～60 min，按Counter-Selection BAC Modification Kit的方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。將1 μL乙醇沉淀回收的lef10MF-Linker-lef10MR線性化片段和一次重組的EscherichiacoliHS996感受態(tài)細(xì)胞混合后，轉(zhuǎn)入電擊杯中，用SCIENTZ-2B基因?qū)雰x進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。電擊參數(shù)設(shè)置為電壓1 350 V，電容5 μF，電阻600 Ω。電擊后立刻加入1 mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)1 h,然后涂布于含鏈霉素(50 μg/mL)和卡那霉素(15 μg/mL)的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5.6 二次重組Bacmid的PCR鑒定 隨機挑取抗鏈霉素、卡那霉素和四環(huán)素的單菌落，用不同的引物組合進(jìn)行PCR擴增，以驗證lef-10基因是否發(fā)生點突變。所用的擴增引物分別為lef-10基因的上、下游引物lef10-promoter-F和lef10-39R及rpsL-AMP基因的上游引物rpsL-AMP-UPNew。不同組合分別為lef10-promoter-F/lef10-39R和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。所有的PCR反應(yīng)都用野生型病毒Bacmid作為對照。

1.6 lef-10-KO-Bacmid轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞

為構(gòu)建野生型、敲除型和恢復(fù)型重組病毒，提取二次重組病毒Bacmid DNA，用pTriEx1.1與野生型AcMNPV Bacmid(對照)、pTriEx1.1與二次重組病毒Bacmid及pTriEx-innateP-lef10與二次重組病毒Bacmid 分別共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，形成重組病毒的基因組可以在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)染步驟為：取0.5 mL離心管，向其中加入100 μL無菌水、5 μL構(gòu)建好的質(zhì)粒和5 μL線性化Bacmid，混勻后加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，再充分混勻，靜置10～30 min后均勻加入到鋪好的Sf9細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染4 d后收集上清病毒，然后取100 μL病毒重新感染Sf9細(xì)胞，3 d后，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 rpsL-AMP篩選盒的構(gòu)建

2.1.1rpsL基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒pTriEx-rpsL的雙酶切鑒定 以大腸桿菌BL21(DE3)基因組為模板，通過2次PCR擴增rpsL基因，得到513 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖2-A)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTriEx-rpsL經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，得到約723 bp的片段(圖2-B)，與預(yù)期片段大小相同，表明載體構(gòu)建正確。

2.1.2rpsL-AMP片段的 PCR擴增及重組質(zhì)粒prpsL-AMP的單酶切鑒定 以pTriEx-rpsL質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增rpsL-AMP片段，得到 3 322 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖3-A)。構(gòu)建的重組質(zhì)粒prpsL-AMP經(jīng)BspHⅠ單酶切后，得到2 645和677 bp的2條片段(圖3-B)，與預(yù)期片段大小相同，表明載體構(gòu)建正確。

2.2 lef-10-KO-Bacmid的構(gòu)建

2.2.1 一次同源重組線性片段lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR的鑒定 以prpsL-AMP質(zhì)粒為模板，通過兩輪PCR擴增lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR片段，瓊脂糖凝膠電泳后得到1 486 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖4)。該片段即為一次重組所需的線性化片段。

圖2 rpsL基因的PCR擴增結(jié)果(A)及重組質(zhì)粒pTriEx-rpsL的雙酶切鑒定(B)M.DNA Marker;1.rpsL基因的PCR擴增產(chǎn)物；2.pTriEx-rpsL的雙酶切產(chǎn)物

圖3 rpsL-AMP基因的PCR擴增結(jié)果(A)及重組質(zhì)粒prpsL-AMP的單酶切鑒定結(jié)果(B)M.DNA Marker;1.rpsL-AMP基因的PCR擴增產(chǎn)物；2.prpsL-AMP的單酶切產(chǎn)物

2.2.2 一次重組Bacmid的構(gòu)建 將回收的線性片段電轉(zhuǎn)化L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后的E.coliHS996，在重組酶作用下，線性片段與lef-10基因發(fā)生同源重組，在含氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素的固體平板上獲得了多個重組轉(zhuǎn)化子。

2.2.3 一次重組Bacmid的PCR鑒定 隨機挑取單克隆，用不同組合引物進(jìn)行交叉PCR鑒定。不同引物組合分別為lef10-promoter-F/10AMPR和rpsl-AMP-UPNew/lef10-39R。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的目的片段(圖5)，結(jié)果與預(yù)期結(jié)果大小相同。表明lef-10基因中已經(jīng)插入外源線性DNA片段rpsL-AMP，一次重組病毒構(gòu)建正確。

2.2.4 二次同源重組線性片段lef10MF-Linker-lef10MR的制備 以雙鏈Linker DNA為模板，通過PCR擴增lef10MF-Linker-lef10MR片段，瓊脂糖凝膠電泳后得到118 bp的特異性片段，大小與預(yù)期結(jié)果吻合(圖6)，該片段即為二次重組所需的線性化片段。

2.2.5 二次重組Bacmid的構(gòu)建 將回收的線性片段電轉(zhuǎn)化L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后的一次重組大腸桿菌HS996，在重組酶作用下，線性片段與lef-10基因發(fā)生同源重組，在含鏈霉素、卡那霉素的固體平板上獲得了多個重組轉(zhuǎn)化子。

2.2.6 二次重組Bacmid的PCR鑒定 隨機挑取單克隆，用不同組合引物進(jìn)行交叉PCR鑒定。不同組合引物分別為lef10-promoter-F/lef10-39R和rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的目的片段(圖7)，結(jié)果與預(yù)期大小相同，表明lef-10基因中可能已經(jīng)引入點突變。對用引物對lef10-promoter-F/lef10-39R擴增的PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果顯示lef-10基因中確實已引入點突變(圖8)，表明二次重組病毒構(gòu)建正確。

圖4 lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR片段的PCR擴增結(jié)果 M.DNA Marker;1，2.lef10MF-rpsL-AMP-lef10MR 片段的PCR擴增產(chǎn)物

圖5 一次重組病毒的PCR鑒定 M.DNA Marker;1,2,5和6是用引物對lef10-promoter-F/10AMPR進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物；3,4,7和8是用引物對rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R 進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物，圖譜底部的小片段是引物二聚體。泳道1,3,5和7使用一次重組病毒作為模板；泳道2,4,6和8使用wtBacmid DNA作為模板

圖6 lef10MF-Linker-lef10MR片段的PCR擴增結(jié)果 M.DNA Marker;1，2.lef10MF-Linker-lef10MR 片段的PCR擴增產(chǎn)物

圖7 二次重組病毒的PCR鑒定M.DNA Marker;2,3,4和6是用引物對lef10-promoter-F/ lef10-39R進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物；1和5是用引物對 rpsL-AMP-UPNew/lef10-39R進(jìn)行PCR擴增的產(chǎn)物。泳道1-4使用重組病毒作為模板；泳道5-6使用wtBacmid DNA作為模板

圖8 lef-10基因部分序列的測序結(jié)果

2.3 lef-10-KO-Bacmid轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞

用pTriEx1.1與野生型AcMNPV Bacmid、pTriEx1.1與重組AcMNPV Bacmid及pTriEx-innateP-lef10與重組AcMNPV Bacmid 分別共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，形成重組病毒的基因組可以在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而使得細(xì)胞大量死亡。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察Sf9細(xì)胞的生長情況(圖9)可以發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)染時間的延長，被lef-10補回型重組病毒和野生型病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，死亡的細(xì)胞不再貼壁生長，而是游離懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中，表明lef-10補回型病毒與野生型病毒一樣，均能在Sf9細(xì)胞中復(fù)制產(chǎn)生具有感染性的子代病毒粒子BV，從而對鄰近細(xì)胞造成二次感染,使得細(xì)胞死亡；而在被lef-10敲除型重組病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，細(xì)胞數(shù)目不會隨著轉(zhuǎn)染時間的增加而發(fā)生明顯改變，細(xì)胞能夠密集地貼壁生長。因此可以初步判斷，lef-10基因的缺失會影響病毒的復(fù)制，進(jìn)一步說明lef-10基因點突變型重組病毒構(gòu)建成功。

圖9 野生型病毒(A)、敲除型病毒(B)和補回型病毒(C)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后的光鏡觀察

3 討 論

傳統(tǒng)的桿狀病毒改造大多采用同源重組的方法進(jìn)行，即將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組DNA共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，從而構(gòu)建出發(fā)生了同源重組的病毒。然而這種方法有很大的局限性，因為當(dāng)桿狀病毒的必需基因被敲除后，病毒便無法進(jìn)行復(fù)制產(chǎn)生子代病毒，從而無法得到重組病毒，也使得研究無法繼續(xù)。隨著科學(xué)的發(fā)展，Red/ET重組技術(shù)漸趨成熟，并成功運用于桿狀病毒的基因敲除和基因補回，使得對桿狀病毒的研究進(jìn)入了一個前所未有的高度。目前，利用該項技術(shù)已經(jīng)對許多基因進(jìn)行了精確敲除，這對于研究桿狀病毒的必需基因在病毒生命周期中的作用，以及在病毒復(fù)制中扮演的角色有著重要意義。

為了研究AcMNPVlef-10基因的功能區(qū)，首先要對該基因進(jìn)行敲除。通過對AcMNPVlef-10基因的分析可知，lef-10基因的轉(zhuǎn)錄方向與上游基因ac53和下游基因vp1054、ac55的轉(zhuǎn)錄方向均一致，其中與上游基因ac53有3 bp的重疊區(qū)域，與下游基因vp1054有143 bp的重疊區(qū)域。如果對lef-10整個ORF進(jìn)行敲除的話，可能會影響下游基因轉(zhuǎn)錄的起始。因此，本研究在敲除lef-10時考慮通過引進(jìn)點突變使lef-10失活，以此確保對lef-10基因保守區(qū)域進(jìn)行最小程度的破壞。引進(jìn)點突變的方法是通過2次Red/ET重組：第1次重組引進(jìn)rpsL-AMP抗性篩選標(biāo)記，第2次重組通過鏈霉素反向篩選去除rpsL-AMP抗性篩選標(biāo)記，同時引入相應(yīng)的點突變。需要說明的是，雖然有商品化的rpsL-Kan篩選盒，但本試驗卻自行構(gòu)建3rpsL-AMP篩選盒，主要原因是試驗所用的AcMNPV Bacmid是由Zhao等[28]改造過的含有Kan抗性標(biāo)記的篩選盒，所以無法使用商品化的篩選盒。本試驗利用Red/ET重組技術(shù)成功構(gòu)建了一次重組病毒，并利用鏈霉素反向篩選獲得lef-10點突變的重組病毒。

本試驗構(gòu)建的載體可以與Bacmid發(fā)生重組，形成可以表達(dá)外源基因的重組病毒。為了研究AcMNPVlef-10缺失型重組病毒侵染細(xì)胞時是否會影響病毒的復(fù)制，構(gòu)建了野生型、lef-10缺失型重組病毒以及l(fā)ef-10補回型重組病毒，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察重組病毒在Sf9細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況，結(jié)果表明被lef-10缺失型重組病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)部無法產(chǎn)生具有感染性的子代病毒粒子BV，從而無法造成細(xì)胞間的二次感染，也就是說lef-10基因是AcMNPV生活周期中的一個必需基因，其缺失會影響病毒DNA的復(fù)制，然而目前還不清楚lef-10基因如何精確調(diào)控病毒基因組的DNA復(fù)制。這些結(jié)果還說明，利用Red/ET系統(tǒng)的重組功能結(jié)合rpsL反向篩選BAC修飾系統(tǒng)對靶基因進(jìn)行點突變的方法是有效的。

本研究得到了AcMNPVlef-10基因點突變的重組病毒，后續(xù)將進(jìn)一步通過構(gòu)建含有截斷l(xiāng)ef-10基因的載體來研究AcMNPVlef-10的功能區(qū)。

4 結(jié) 論

本研究首次采用Red/ET系統(tǒng)結(jié)合rpsL反向篩選系統(tǒng)，構(gòu)建了AcMNPVlef-10基因點突變的重組病毒，通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗證明AcMNPVlef-10基因是病毒增殖所必需的基因，該方法對以后進(jìn)行桿狀病毒基因改造具有一定的參考價值。

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Disruption ofAcMNPVlef-10 by Red Recombination System in combination withrpsLcounter-selection

BAI Yu,XU Xiao-dong

(CollegeofLifeSciences,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 To study the function of late expression factorlef-10 ofAutographacalifornicanucleopolyhedro virus (AcMNPV),the RedET Recombination System in combination withrpsLcounter-selection was used to introduce a single point mutation into theAcMNPVlef-10 gene.【Method】 Since the ORF box of thelef-10 gene partially overlaps the upstream geneorf53 and the downstream genevp1054,a single point mutation was introduced into theAcMNPVlef-10 gene to protect the complete gene sequence on both sides.First,we constructedrpsL-AMPscreening box.Then introduction of point mutation was done through two RedET Recombination steps:the first Recombination was introduction ofrpsL-AMPresistance selection marker into theAcMNPVlef-10 gene and the second Recombination was to introduce a single point mutation into theAcMNPVlef-10 gene throughrpsLcounter-selection,while removing therpsL-AMPresistance selection marker.Then,Sf9 cells were co-transfected with lef10-KO-Bacmid DNA and pTriEx1.1 as well as lef10-KO-Bacmid DNA and pTriEx-innateP-lef10.The co-transfection with wtBacmid DNA and pTriEx1.1 was sued as control.Then the infected cells were observed under the microscope.【Result】 Based on PCR identification of recombinant Bacmid and point mutations sequences,it was confirmedlef-10 gene had been disrupted.Co-transfection experiments showed that with the extension of the transfection time,vAclef-10KO-REPand vAcwtreplicated inSf9 cells to produce infectious virions BV.This resulted in secondary infection of neighboring cells and cell death.The production ability of infectious virions of vAclef-10KO-REPwas consistent with vAcwt.Because vAclef10-KOcan not produce infectious virions,the number of cells did not change significantly with the extension of the transfection time when using vAclef10-KOto transfectSf9 cells.【Conclusion】AcMNPVlef-10 gene has significant effects on replication of virus.

Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV);lef-10;RedET recombination system;rpsLcounter-selection BAC modification system; gene disruption

時間:2015-11-11 16:16

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.12.026

2014-04-24

陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計劃項目(2011JM3002)

白 玉(1989-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，在讀碩士，主要從事桿狀病毒lef-10基因功能的研究。 E-mail：807738718@qq.com

許曉東(1967-)，男，黑龍江甘南人，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子病毒學(xué)研究。E-mail：xuxd@nwsuaf.edu.cn

Q786

A

1671-9387(2015)12-0181-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151111.1616.052.html