椰子油基膽鹽脂質(zhì)體的制備及工藝優(yōu)化

時(shí)振振 白新鵬 岳宜靜

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570000)

椰子油(Coconut Oil，CO)是源于椰子果肉經(jīng)榨取和精煉得到的植物性油脂，富含中鏈脂肪酸(Medium Chain Fatty Acids，MCFAs)以及多種活性物質(zhì)[1]，MCFAs比例高達(dá)80%以上，主要為辛酸、癸酸以及月桂酸，月桂酸含量在原生態(tài)椰子油中高達(dá)50%～53%，故椰子油又被稱為月桂酸油[2-4]。中鏈脂肪酸中的中鏈脂肪酸甘油三酯(Medium Chain Triglycerides，MCT)含量占60%，能被人體快速消化吸收，迅速提供能量，且不會(huì)在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化或堆積成脂肪[5]，具有促進(jìn)新陳代謝、減少機(jī)體負(fù)荷、抗菌[6]、抗氧化、降血脂和膽固醇等多種生理功能[1，7]，對(duì)人體的生理健康發(fā)展和維持具有積極效應(yīng)[3]。椰子油的熔點(diǎn)約為24～26 ℃[8]。椰子油低熔點(diǎn)和不溶于水的性質(zhì)限制了其在食品工業(yè)的應(yīng)用范圍。

脂質(zhì)體(liposome，LPs)是1965年英國科學(xué)家Bangham在用電鏡觀察分散在水中的磷脂時(shí)發(fā)現(xiàn)的。其結(jié)構(gòu)是由尾對(duì)尾的磷脂雙分子層形成外圍結(jié)構(gòu)，內(nèi)部為水相，磷脂分子層之間為油相[9]，其理想化結(jié)構(gòu)見圖1。相較于納米乳液和微膠囊而言，脂質(zhì)體的優(yōu)勢(shì)是形成了一個(gè)同時(shí)運(yùn)載著油和水的體系。將性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)包埋在脂質(zhì)體中，可更長時(shí)間保持物質(zhì)原有活性，并且由于脂質(zhì)體顆粒大小屬于納米級(jí)別，因此被脂質(zhì)體包埋的物質(zhì)更容易被人體吸收利用[10-13]。膽鹽脂質(zhì)體是在脂質(zhì)體膜中加入膽鹽如膽酸鈉或去氧膽酸鹽而形成的，它不同于普通脂質(zhì)體，由于膽鹽的加入賦予了脂質(zhì)體高度的變形性，可攜帶藥物透過比自身尺寸小數(shù)十倍的孔隙，最初被應(yīng)用于促進(jìn)透皮給藥[14-17]。

圖1 脂質(zhì)體理想化結(jié)構(gòu)示意圖

呂方方等[18]曾對(duì)羧甲基殼聚糖(CMCT)包裹椰子油脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但因素水平設(shè)計(jì)不夠完善。研究擬利用脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)特征，將椰子油包裹在中間的疏水尾部之間，其中也不乏由部分油脂被包埋進(jìn)了內(nèi)水相[12]，以提高椰子油的水溶性及生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

初榨椰子油：海南大白康健醫(yī)藥股份有限公司；

脫氧膽酸鹽(豬)：65%，上海源葉生物科技有限公司；

大豆卵磷脂：食品級(jí)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；

無水乙醇：分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；

石油醚(Ⅱ)：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

1×PBS緩沖液：pH 7.2～7.4，廣州賽國生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：EL204型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D型，上海予華儀器設(shè)備有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：GL-20G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

高功率超聲波破碎儀：KQ-800KDE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀型：EV400型，北京萊伯泰科儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膽鹽脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法制備椰子油膽鹽脂質(zhì)體。將磷脂與脫氧膽鹽按一定比例(m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽分別為2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)加入茄形瓶中，再加入一定量無水乙醇和一定量的椰子油。將混合物超聲分散一定時(shí)間后，于55 ℃下旋蒸30 min。再加入25 mL的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)后，在一定溫度下水化一定時(shí)間后即得到椰子油脂質(zhì)體。

1.2.2 包封率的測(cè)定

(1) 游離椰子油含量測(cè)定：采用萃取—離心法分離游離椰子油，分離后旋蒸除去有機(jī)溶液，再利用差量法得到游離油脂含量。具體操作：取3 mL椰子油脂質(zhì)體于15 mL離心管中，再加入3 mL石油醚，搖晃離心管約15 s后進(jìn)行離心(2 000 r/min、3 min)，重復(fù)萃取3次。將茄形瓶稱重得到空瓶重M1，稱重后加入萃取液石油醚放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)，蒸發(fā)除去萃取液石油醚后，待茄形瓶溫度變?yōu)槌睾笤俅畏Q重得到瓶重M2?？瞻讓?duì)照為按同樣方法制備脂質(zhì)體，但不加入椰子油，首先稱重得到空瓶重M3，再按同樣方法先萃取后蒸發(fā)除去石油醚，得到蒸發(fā)石油醚后的瓶子質(zhì)量M4。按式(1)計(jì)算游離椰子油含量。

W游=(M2-M1)-(M4-M3)，

(1)

式中：

W游——游離椰子油含量，g；

M1——空瓶質(zhì)量，g；

M2——蒸發(fā)除去萃取液石油醚后瓶質(zhì)量，g；

M3——對(duì)照組空瓶質(zhì)量，g；

M4——對(duì)照組蒸發(fā)石油醚后的瓶子質(zhì)量，g。

(2) 總椰子油含量測(cè)定：取3 mL椰子油脂質(zhì)體于15 mL離心管中，加入3 mL破乳劑?；旌暇鶆蚝蠓湃氤暻逑礄C(jī)中超聲粉碎10 min進(jìn)行破乳，破乳后加入3 mL石油醚，搖晃離心管約15 s后進(jìn)行離心(8 000 r/min、3 min)，共重復(fù)萃取3次。將茄形瓶稱重得到空瓶重M5，稱重后加入萃取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)，蒸發(fā)除去石油醚后，待茄形瓶溫度變?yōu)槌睾笤俅畏Q重得到瓶重M6?？瞻讓?duì)照為按同樣方法制備脂質(zhì)體，但不加入椰子油，再按試驗(yàn)測(cè)定法測(cè)定。首先空白對(duì)照組含量得到空白對(duì)照組空瓶質(zhì)量M7，再按同樣方法先萃取后蒸發(fā)除去石油醚，得到蒸發(fā)石油醚后的瓶子質(zhì)量M8。按式(2)計(jì)算總椰子油含量。

W總=(M6-M5)-(M7-M8)，

(2)

式中：

W總——總椰子油含量，g；

M5——空瓶質(zhì)量，g；

M6——蒸發(fā)除去萃取液石油醚后瓶質(zhì)量，g；

M7——對(duì)照組空瓶質(zhì)量，g；

M8——對(duì)照組蒸發(fā)石油醚后的瓶子質(zhì)量，g。

(3) 椰子油包封率的計(jì)算：

E=[(W總-W游)/W總]×100%，

(3)

式中：

E——椰子油包封率，%；

W游——游離椰子油含量，g；

W總——總油量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽對(duì)包封率的影響：控制其他變量分別為磷酸緩沖鹽溶液25 mL、無水乙醇5 mL、椰子油1 mL、超聲分散時(shí)間10 min，水化溫度55 ℃、水化時(shí)間30 min，考察m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽(2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1)對(duì)包封率的影響。

(2)V磷酸緩沖鹽溶液∶V無水乙醇對(duì)包封率的影響?？刂破渌兞糠謩e為大豆卵磷脂與膽鹽比列4∶1，椰子油1 mL、超聲分散時(shí)間10 min、水化溫度55 ℃、水化時(shí)間30 min，考察V磷酸緩沖鹽溶液∶V無水乙醇(5∶5，5∶4，5∶3，5∶2，5∶1)對(duì)包封率的影響。

(3) 超聲時(shí)間對(duì)包封率的影響：控制其他變量分別為磷酸緩沖鹽溶液25 mL、大豆卵磷脂與膽鹽比列4∶1、無水乙醇5 mL、椰子油1 mL、水化溫度55 ℃、水化時(shí)間30 min，考察超聲分散時(shí)間(10，15，20，25，30 min)對(duì)包封率的影響。

(4) 水化溫度對(duì)包封率的影響：控制其他變量分別為磷酸緩沖鹽溶液25 mL、大豆卵磷脂與膽鹽比列4∶1、無水乙醇5 ml、超聲分散時(shí)間15 min、椰子油1 mL、水化時(shí)間30 min，考察水化溫度(45，50，55，60，65，70 ℃)對(duì)包封率的影響。

(5)m大豆卵磷脂∶m椰子油對(duì)包封率的影響：控制其他變量分別為磷酸緩沖鹽溶液25 mL、大豆卵磷脂與椰子油比列4∶1、無水乙醇5 mL、超聲分散時(shí)間15 min、水化時(shí)間30 min，考察m大豆卵磷脂∶m椰子油(0.50，0.75，1.00，1.25，1.50)對(duì)包封率的影響。

(6) 水化時(shí)間對(duì)包封率的影響：控制其他變量分別為磷酸緩沖鹽溶液25 mL、大豆卵磷脂與膽鹽比列1∶4、無水乙醇5 mL、椰子油1 mL、超聲分散時(shí)間15 min，考察水化時(shí)間(10，20，30，40，50 min)對(duì)包封率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽、m大豆卵磷脂∶m椰子油和水化溫度三因素對(duì)脂質(zhì)體包封率影響較大，而V磷酸緩沖鹽溶液∶V無水乙醇、超聲時(shí)間和水化時(shí)間影響相對(duì)較小，因此選取影響較大的進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。利用三因素三水平Box-Behnken設(shè)計(jì)，以椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率為響應(yīng)值，優(yōu)化椰子油膽鹽脂質(zhì)體的制備工藝條件[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行試驗(yàn)，測(cè)試結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPASS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的建立及模型方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼如表1所示，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得出二次多項(xiàng)回歸方程為:

Y=-0.021 735+0.561 41A-6.471 10×10-3B-0.418 59C-9.091 00×10-3AB+0.381 82AC-0.025 452BC-0.060 613A2+4.844 80×10-4B2+0.242 59C2。

(4)

表3 方差分析

一次項(xiàng)A、C的P值<0.01，說明因素A、C對(duì)包封率影響極顯著。交互項(xiàng)AC的P值=0.005 2<0.01，說明因素AC對(duì)包封率影響極顯著。二次項(xiàng)A2的P<0.05，表明其對(duì)脂質(zhì)體包封率影響顯著。根據(jù)F值可以看出影響脂質(zhì)體包封率的主次因素為m大豆卵磷脂∶m椰子油(C)>m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽(A)>水化溫度(B)。各個(gè)交互因子的響應(yīng)曲面及其等高線見圖2。

圖2 兩因素交互作用對(duì)椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2 響應(yīng)面圖分析

由圖2可知，m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽和m大豆卵磷脂∶m椰子油交互作用的等高線呈橢圓形，分布密集，說明交互作用顯著，響應(yīng)曲面的走勢(shì)相對(duì)其他交互作用更為陡峭，說明對(duì)響應(yīng)值的影響更為顯著。當(dāng)m大豆卵磷脂∶m椰子油或m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽固定時(shí)，椰子油膽鹽脂質(zhì)體的包封率隨著m大豆卵磷脂∶m椰子油的增加而明顯降低，當(dāng)m大豆卵磷脂∶m椰子油一定時(shí)，椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率隨m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽與水化溫度變化相對(duì)較小。水化溫度固定時(shí)的曲面和超聲時(shí)間固定時(shí)的相比更為陡峭，說明水化溫度對(duì)椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率的影響更大。

2.3 回歸模型優(yōu)化及驗(yàn)證

通過Design-Expert 8.0軟件優(yōu)化得出的制備椰子油膽鹽脂質(zhì)體最佳工藝條件為：m大豆卵磷脂∶m脫氧膽酸鹽=2.23、m大豆卵磷脂∶m椰子油=0.56、水化溫度64.7 ℃，預(yù)測(cè)該模型下制備得到的椰子油膽鹽脂質(zhì)體的包封率為59.22%。為了驗(yàn)證該響應(yīng)面模型優(yōu)化得到的工藝條件的可靠性，在此工藝條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率58.09%，與模型預(yù)測(cè)值椰子油膽鹽脂質(zhì)體的包封率相對(duì)誤差為1.91%，說明實(shí)際驗(yàn)證值與響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)值吻合良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以卵磷脂和膽鹽為壁材，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了椰子油膽鹽脂質(zhì)體的制備工藝，其最優(yōu)制備工藝為大豆卵磷脂與脫氧膽酸鹽比例2.53、樣脂比0.56、水化溫度64.70 ℃，椰子油膽鹽脂質(zhì)體的包封率為58.09%。試驗(yàn)中椰子油膽鹽脂質(zhì)體包封率的測(cè)定方法還有不足之處，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化椰子油膽鹽脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法。