貴州狐臭柴不同部位提取物及其抗氧化活性

楊寧線 陽(yáng) 嬌 王艷秋 張明生

(1. 貴陽(yáng)護(hù)理職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，貴州 貴陽(yáng) 550081; 2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

過(guò)量自由基的產(chǎn)生是人體疾病發(fā)生的重要原因，抗氧化性物質(zhì)可通過(guò)抑制氧自由基反應(yīng)的發(fā)生來(lái)保護(hù)生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA[1-2]等，從而防止許多疾病的發(fā)生。雖然有許多人工合成的抗氧化物質(zhì)，但因安全性和潛在的毒性等不足，合成的抗氧化劑使用范圍受到了較多限制[3]。因此，近年來(lái)從植物中尋找安全性更高的天然抗氧化物質(zhì)，引起了許多研究者的關(guān)注[4-5]。研究[6-8]表明，一些藥用植物中的多酚、黃酮等化合物具有顯著的抗菌、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化和抗病毒等生物活性。

狐臭柴(PremnapuberulaPamb.)系馬鞭草科豆腐柴屬植物，其葉片含蛋白質(zhì)、果膠、過(guò)氧化物酶等多種營(yíng)養(yǎng)成分，可用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)[9-11]。目前關(guān)于該植物的研究多集中在植株的生長(zhǎng)發(fā)育，神仙豆腐的制作及營(yíng)養(yǎng)保健功能，果膠提取工藝的優(yōu)化及不同干燥方式對(duì)結(jié)構(gòu)的影響等方面[12-15]。僅有李永琴[16]報(bào)道過(guò)狐臭柴的總酚和總黃酮含量，然而對(duì)黃酮類成分的種類、各成分含量及抗氧化活性等的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。文章擬研究貴州地區(qū)狐臭柴總酚和總黃酮成分、含量及抗氧化活性，分析各成分與抗氧化能力的相關(guān)性，以期為食品天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

狐臭柴：貴州大學(xué)農(nóng)旅研學(xué)實(shí)驗(yàn)示范基地；

柚皮素、芹菜素、蘆丁、槲皮素標(biāo)品：北京索萊寶科技有限公司；

沒(méi)食子酸、維生素C標(biāo)品：上海源葉生物科技有限公司；

DPPH、ABTS：分析醇，生工生物工程股份有限公司；

甲醇、磷酸等：色譜純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent 1260型，美國(guó)安捷倫科技有限公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax Versamax型，美國(guó)美谷分子儀器有限公司；

紫外分光光度計(jì)：UV-6000SE型，上海元析儀器有限公司；

超聲波細(xì)胞破碎儀：1030HT型，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101-3A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：H4-20KR型，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；

粉碎機(jī)：JY-100型，浙江省永康市象珠松青五金廠；

分析天平：BSM-220.4型，上海電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 樣品采集于2020年7月28日，隨機(jī)選取5株植物，選取生長(zhǎng)狀況良好的根(主根)、莖(主枝條的莖段)、葉(頂端向下第3枝的前3對(duì)葉片)3個(gè)部位，清洗后分別于50 ℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，密封，4 ℃貯藏備用。

1.2.2 總酚提取

(1) 提取工藝：參照文獻(xiàn)[16]并修改。料液比(m樣品∶V提取劑)1∶25 (g/mL)、超聲時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃，4 200 r/min離心10 min，上清液定容至50 mL，測(cè)定720 nm處吸光度。

(2) 總酚含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[17]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.009 1x+0.003 2，R2=0.999 1。

1.2.3 總黃酮的提取

(1) 提取工藝：參照文獻(xiàn)[18]。

(2) 總黃酮含量測(cè)定：參照文獻(xiàn)[19]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 9x-0.001 3，R2=0.999 0。

1.2.4 黃酮類化學(xué)成分及含量測(cè)定

(1) 對(duì)照品溶液的制備：參照文獻(xiàn)[19]并修改。用甲醇溶液配制質(zhì)量濃度分別為1 080 μg/mL的蘆丁、1 120 μg/mL的柚皮素、1 550 μg/mL的槲皮素、1 030 μg/mL的芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，等比稀釋為梯度質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。

(2) 供試品溶液的制備：參照文獻(xiàn)[17]，充分搖勻后微孔濾膜過(guò)濾。

(3) 色譜條件：參照文獻(xiàn)[9]并修改。色譜柱為capcell pak C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇溶液為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫：0～23 min，50% A；23～28 min，100% A；28～50 min，100% A；體積流量0.9 mL/min，槲皮素檢測(cè)波長(zhǎng)為256，372 nm，蘆丁檢測(cè)波長(zhǎng)為256，356 nm，芹菜素檢測(cè)波長(zhǎng)為268，340 nm，柚皮素檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照文獻(xiàn)[16]并修改。芹菜素的線性方程為y=89.041x-4.762，r=0.999 0，蘆丁的線性方程為y=15.236x+39.302，r=0.999 1，未檢測(cè)出柚皮素和槲皮素兩種黃酮類成分。

1.2.5 抗氧化試驗(yàn)

(1) DPPH自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[20]。

(2) ABTS+自由基清除能力：參照文獻(xiàn)[21]。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Origin 2018軟件作圖，SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量分析

2.1.1 總酚及總黃酮含量 由表1可知，狐臭柴根、莖、葉中總酚及總黃酮含量差異顯著(P<0.05)，其中葉片總酚含量最高為30.05 mg/g，約為莖、根中的3倍和9倍；總黃酮和總酚含量的變化趨勢(shì)相同，依次為葉>莖>根，其中葉中總黃酮含量為(6.54±0.17) mg/g，約為莖中的10倍，這是因?yàn)辄S酮類是植物的次生代謝產(chǎn)物，常作為主要成分在高等植物的根、莖、葉普遍存在[22]。這與李永琴等[18]的報(bào)道基本一致，說(shuō)明狐臭柴總酚和總黃酮含量較高，且葉中的總酚和總黃酮含量顯著高于莖的。

表1 狐臭柴不同部位總酚及總黃酮含量?

2.1.2 黃酮類成分 狐臭柴根、莖、葉不同部位中黃酮成分的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1，各成分含量見(jiàn)表2。由表2可知，狐臭柴中蘆丁和芹菜素含量分布依次為莖>根>葉，根、莖、葉中蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(25.68±0.21)%、(74.42±0.32)%，(2.28±0.03)%，芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為(0.24±0.02)%，(0.35±0.02)%，(0.14±0.01)%，各組織器官間均有顯著性差異(P<0.05)，可能與植物根、莖中次生代謝產(chǎn)物豐富有關(guān)[22]，但是未檢測(cè)出槲皮素和柚皮素，可能是這兩種成分含量太低引起的，與范超敏等[23]的研究結(jié)果一致。

圖1 狐臭柴根、莖、葉黃酮成分的高效液相圖譜

表2 狐臭柴不同部位黃酮類化學(xué)成分含量?

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 OH自由基清除能力 由圖2可知，狐臭柴中總黃酮的抗氧化能力依次為葉>莖>根，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，狐臭柴葉的DPPH自由基清除率為82.5%。這是因?yàn)镈PPH自由基在517 nm處有比較穩(wěn)定的特征吸收峰，常用于評(píng)價(jià)抗氧化成分的自由基清除能力[24]。

圖2 狐臭柴不同部位對(duì)DPPH自由基的清除率

總黃酮的IC50值與抗氧化活性呈反比，IC50值越小，樣品的抗氧化能力越強(qiáng)[25]。由圖3可知，維生素C與根、莖、葉的IC50值相比具有顯著性差異，狐臭柴根、莖、葉的IC50值分別為(23.38±0.14)，(8.21±0.09)，(1.13±0.06) mg/mL，維生素C的IC50為(0.16±0.04) mg/mL，是因?yàn)榭寡趸钚耘c黃酮類成分有較大關(guān)系，而狐臭柴具有強(qiáng)的抗氧化活性。謝娟平等[26]研究發(fā)現(xiàn)豆腐柴葉的抗氧化能力約為商陸葉的16倍，且同種植物的葉比根的抗氧化性能力強(qiáng)。綜上，狐臭柴葉的抗氧化能力最強(qiáng)，且其半數(shù)清除率高于大蒜乙酸乙酯萃取物的[27]。

圖3 狐臭柴不同部位與陽(yáng)性對(duì)照維生素C的IC50值

2.2.2 清除ABTS+自由基能力 由圖4可知，狐臭柴對(duì)ABTS+自由基的清除能力為葉>莖>根。黃酮類成分結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，能提供大量電子，可以將多種自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步中斷反應(yīng)，從而起到抗氧化作用[4]。因此，狐臭柴葉的抗氧化活性最強(qiáng)，且該部位總酚及總黃酮的含量最高，推測(cè)狐臭柴的抗氧化活性可能與總酚及總黃酮的含量有關(guān)。

圖4 狐臭柴不同部位對(duì)ABTS+自由基的清除作用

2.3 主成分分析

運(yùn)用SPSS 23.0軟件以總酚、總黃酮、蘆丁、芹菜素含量、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力6個(gè)指標(biāo)為變量，對(duì)狐臭柴不同組織進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見(jiàn)表 3。由表3可知，主成分1個(gè)的特征值>1，且其方差貢獻(xiàn)率為86.46%，基本涵蓋了6個(gè)指標(biāo)的86%以上的數(shù)據(jù)信息。

表3 各成分的特征值、方差及累計(jì)貢獻(xiàn)率

由表4可知，第1主成分為總黃酮含量，ABTS+自由基清除能力與總酚含量有較大的得分系數(shù)，這與抗氧化活性結(jié)果一致，因此可以將總黃酮含量、ABTS+自由基清除能力和總酚含量作為評(píng)價(jià)狐臭柴根、莖、葉抗氧化活性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。

表4 第1主成分因子得分系數(shù)

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，藥食兼用植物狐臭柴根、莖、葉總酚含量分別為3.26，9.58，30.05 mg/g，總黃酮含量分別為0.22，0.58，6.54 mg/g，蘆丁和芹菜素含量依次為莖>根>葉。各組織的抗氧化活性均隨樣品質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，且與總酚、總黃酮含量呈正相關(guān)，其中葉的抗氧化活性最強(qiáng)，且葉片產(chǎn)量大，加工方便。綜上，狐臭柴具有良好的抗氧化活性。試驗(yàn)僅對(duì)該植物根、莖、葉的總酚和總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行了初步探究，尚未比較各成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性，后續(xù)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注其他黃酮類成分及含量，并測(cè)定黃酮類成分的體內(nèi)抗氧化活性，為狐臭柴天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)提供更充分的理論依據(jù)。