小麥醇溶蛋白沸石分離工藝優(yōu)化及其組分分析

王丹麗 劉 璐 張逸凡 連喜軍

(1. 天津商業(yè)大學(xué)理學(xué)院，天津 300134；2. 天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；3. 天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134)

小麥醇溶蛋白為單體蛋白，分為α、β、γ、ω4種不同類(lèi)型，是面筋蛋白的重要組分[1-2]。麥醇溶蛋白缺乏彈性，使面筋黏稠并具有延展性和流通性，因其能促進(jìn)小麥淀粉回生，因此可作為食品添加劑用于制備高品質(zhì)的回生淀粉[3-7]。利用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇水溶液浸泡谷朊粉提取醇溶蛋白是制備醇溶蛋白的常用方法[8-9]，但關(guān)于從提取液中分離出醇溶蛋白固體及將不同性質(zhì)醇溶蛋白組分分離的研究較少。利用高效液相色譜層析方法可鑒定和分離醇溶蛋白，該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，但試驗(yàn)成本高，而且分離時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)物少[10-11]。

柱層析法是利用混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中溶解度的差異，經(jīng)多次分配將各組分分離而達(dá)到純化的目的[12]。柱層析試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，且分離產(chǎn)物純度比較高[13]。該法被廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化工等領(lǐng)域[14-16]。沸石是天然存在且分布廣泛的離子交換材料，具有選擇性吸附和篩分能力，可用于柱層析的固定相中[17-18]。與高效液相色譜層析方法相比，采用改性沸石柱層析制備不同分子量醇溶蛋白組分，不需要昂貴設(shè)備，過(guò)程簡(jiǎn)單，可高效分離出不同分子量的醇溶蛋白組分。

試驗(yàn)擬研究堿液處理沸石分離不同性質(zhì)醇溶蛋白組分工藝，以期為乙醇浸提谷朊粉制備醇溶蛋白提供可借鑒的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉：思象粉業(yè)有限公司；

無(wú)水乙醇、氫氧化鉀：分析純，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；

堿性蛋白酶：2 000 U/g，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；

天然沸石(黑火山土)：市售；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DH-101-3BS型，天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；

低速離心機(jī)：L535-1型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：Lambda25型，美國(guó)PerkinElmer公司；

臺(tái)式電熱恒溫培育箱：WP25A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

掃描式電子顯微鏡：KH-8700型，浩視中國(guó)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；

增力電動(dòng)攪拌器：JJ-1型，天津市華儀鑫達(dá)儀器儀表有限公司；

電子天平：YD202N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

液相色譜儀：安捷倫1260 Infinity Ⅱ型，安捷倫科技公司；

多角度激光光散射儀：DAWN HELEOS Ⅱ型，美國(guó)懷雅特公司；

動(dòng)態(tài)激光光散射儀：DynaPro NanoStar型，美國(guó)懷雅特公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 醇溶蛋白粗提物制備 將市售谷朊粉200 g按液料比(V乙醇∶m谷朊粉)30∶1 (mL/g)溶于體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇，置于30 ℃水浴中并攪拌2 h，3次離心(3 500 r/min，3 min)，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸出乙醇后，所得濃縮液為醇溶蛋白組分1；將提取的上清液冷藏，分別于4，10，20，30 ℃下靜置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，所得沉淀為醇溶蛋白組分2，該醇溶蛋白干重與谷朊粉干重(每200 g谷朊粉的干重為48 g)的比值為凝沉率；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將冷藏后的上清液濃縮凍融后離心，所得上清液為醇溶蛋白組分3，沉淀為醇溶蛋白組分4。測(cè)量沉淀的質(zhì)量并通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察樣品形貌。

1.2.2 沸石堿處理 向玻璃瓶中加入500 g沸石，然后加入KOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%，50%，80%)直至沒(méi)過(guò)沸石1～2 cm。將裝有沸石的玻璃瓶放入水浴鍋中，分別設(shè)定4個(gè)不同加熱溫度(30，50，70，90 ℃)和3個(gè)不同加熱時(shí)間(30，60，120 min)；將KOH溶液處理過(guò)后的沸石加蒸餾水洗至中性，自然風(fēng)干。

1.2.3 沸石吸附醇溶蛋白 將4 ℃下靜置凝沉12 h制備的醇溶蛋白溶解于體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇中，向其中加入經(jīng)KOH處理并干燥的沸石，沸石量沒(méi)過(guò)溶液即可，吸附3 h后將溶液倒出。

1.2.4 醇溶蛋白組分分離 采用層析法。將乙醇作為柱層析中的流動(dòng)相，以經(jīng)堿處理的沸石為固定相，向?qū)游鲋屑尤胍呀?jīng)KOH處理并吸附過(guò)醇溶蛋白的沸石，量取適量的無(wú)水乙醇倒入層析柱中，乙醇溶液沒(méi)過(guò)沸石1～2 cm(約為300 mL)，待沸石吸附10 min后，打開(kāi)開(kāi)關(guān)將層析出的醇溶蛋白溶液放出，每個(gè)樣品層析出的液體按照順序平均分為三等份接出，每個(gè)組分為100 mL，分別標(biāo)記為A、B、C。

1.2.5 醇溶蛋白紫外最大吸收波長(zhǎng)的確定 將每個(gè)樣品的3個(gè)組分在4 ℃下冷藏12 h后，取出樣品，將上清液收集在一起后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，剩余液體冷藏所得沉淀即為醇溶蛋白，將樣品去皮后稱(chēng)其重量，分析堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)、堿處理時(shí)間、堿處理溫度對(duì)沸石分離醇溶蛋白組分的重量的影響。取出若干試管，向其內(nèi)加入4～5 mL的體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇，用鉤針鉤取每個(gè)樣品的每個(gè)組分的沉淀，放入乙醇液中充分溶解后采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其紫外最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.6 醇溶蛋白分子量測(cè)定 按照文獻(xiàn)[19]的測(cè)定方法，以沸石柱層析分離所得三組分作為流動(dòng)相，利用高效凝膠滲透色譜聯(lián)用多角度激光散射和示差折光儀(HPSEC-MALLS-RID)進(jìn)行分析，采用Astra6 軟件收集和處理數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)數(shù)據(jù)均取自3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的均值，采用F檢驗(yàn)，利用SPSS軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇溶蛋白凝沉率與靜置凝沉溫度及時(shí)間關(guān)系

將谷朊粉醇提溶液分別在4，10，20，30 ℃下靜置凝沉1，2，4，8，10，20，40 h，測(cè)定凝沉出的醇溶蛋白凝沉率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 醇溶蛋白凝沉率與靜置凝沉溫度及時(shí)間的關(guān)系

由圖1可知，靜置凝沉前1 h，4，10 ℃兩組樣品醇溶蛋白凝沉速率迅速增長(zhǎng)且遠(yuǎn)多于另外兩組，另外兩組幾乎未凝沉出醇溶蛋白；1～4 h時(shí)，20，30 ℃兩組樣品凝沉速率開(kāi)始緩慢增長(zhǎng)，而4，10 ℃兩組醇溶蛋白增長(zhǎng)趨緩；4～20 h時(shí)，20，30 ℃兩組樣品凝沉速率小幅增長(zhǎng)，20 h時(shí)兩溫度下沉淀量接近，4 ℃下的凝沉率比其他各組都快，沉淀量超過(guò)了10 ℃的樣品，成為沉淀量最多的組分，而10 ℃下的樣品凝沉較為緩慢。凝沉20～40 h時(shí)，20，30 ℃兩組樣品凝沉速度加快。靜置40 h后，4，10，20，30 ℃下醇溶蛋白的凝沉率分別為16.6%，20.6%，24.0%，18.9%，經(jīng)40 h靜置凝沉之后，30 ℃和10 ℃下最終提取的醇溶蛋白質(zhì)量相近，而20 ℃下的樣品提取量最大，4 ℃下能更快地凝沉出接近最大沉淀量的醇溶蛋白。

2.2 不同溫度和時(shí)間沉淀出醇溶蛋白光學(xué)顯微圖像特征差異比較

圖2為不同溫度和時(shí)間醇溶蛋白提取液及凍融沉淀的光學(xué)圖像特征差異比較。將第1組分和第3組分進(jìn)行對(duì)比，可以看出第1組分的醇溶蛋白聚集程度相對(duì)較低，可見(jiàn)通過(guò)凍融之后，醇溶蛋白的聚集程度獲得了提升，說(shuō)明樣品經(jīng)凍融處理更加容易提取。將第2組分和第4組分進(jìn)行對(duì)比，可以看出醇溶蛋白形狀上有明顯變化，第2組分的醇溶蛋白以小體型聚集為主，而且形狀扁平，第4組分的醇溶蛋白則是體型偏大的聚集為主。說(shuō)明經(jīng)過(guò)冷凍之后，樣品中醇溶蛋白的聚集性比僅經(jīng)過(guò)冷藏的樣品強(qiáng)，更容易凝聚沉淀。因此，要想得到更多的醇溶蛋白提取物，宜將谷朊粉醇提液濃縮后先進(jìn)行冷藏，再進(jìn)行凍融處理。

圖2 不同溫度和時(shí)間醇溶蛋白提取液及沉淀的光學(xué)顯微圖像特征差異比較

圖3為不同溫度和時(shí)間下，靜置凝沉醇溶蛋白的光學(xué)圖像特征差異比較。由圖3可以看出，在第1 h冷藏凝沉醇溶蛋白的圖像中，4個(gè)溫度下的醇溶蛋白分布都比較散亂，大小各不相同且無(wú)規(guī)律。第2 h的與第1 h時(shí)相似，但球狀醇溶蛋白(α-、β-、γ-醇溶蛋白[20-21])逐漸匯聚。第4 h的圖像中，在4，10 ℃下靜置凝沉的醇溶蛋白都接近圓形，且聚集程度更高，而另外兩組的醇溶蛋白形狀無(wú)規(guī)律，且分布較分散。第10 h的圖像中，4 ℃的出現(xiàn)了蟲(chóng)狀醇溶蛋白(ω-醇溶蛋白[22])，10 ℃的醇溶蛋白出現(xiàn)了程度較輕的變扁，20 ℃的醇溶蛋白呈橢圓狀，這3個(gè)溫度下凝沉的醇溶蛋白分布均較為集中，且4 ℃的醇溶蛋白最為集中；40 ℃樣品顯微圖像中醇溶蛋白形狀依舊無(wú)規(guī)律且分布較為散亂。在20 h時(shí)，4，10，20 ℃的樣品均以蟲(chóng)形ω-醇溶蛋白為主，夾雜部分橢圓形醇溶蛋白，密集程度都較高，30 ℃的樣品依舊是以圓形的α-、β-、γ-醇溶蛋白為主，且密集程度則稍微稀疏一些。在40 h的樣品圖像中，不同溫度下的醇溶蛋白皆以圓形為主，僅含有少量蟲(chóng)狀ω-醇溶蛋白，可能在此階段球狀α-、β-、γ-醇溶蛋白聚集到蟲(chóng)狀ω-醇溶蛋白表面，相互融合形成了大的球狀結(jié)構(gòu)。綜上所述，為了高效制備醇溶蛋白，4 ℃靜置冷藏效果最佳。

圖3 不同溫度和時(shí)間沉淀出醇溶蛋白光學(xué)顯微圖像特征差異比較

2.3 預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)沸石分離醇溶蛋白組分的影響

圖4和圖5為經(jīng)不同工藝預(yù)處理沸石對(duì)分離醇溶蛋白提取量及其組分紫外吸收光譜的影響。由圖4可知，在不同處理溫度和不同處理時(shí)間情況下均表現(xiàn)出KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，分離出醇溶蛋白的量越多的規(guī)律。即，所分離的醇溶蛋白的量與KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈反比。結(jié)合圖5(a)可知，在溫度為30 ℃、處理時(shí)間為30 min的條件下，KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，50%，80%時(shí)，組分A的最大吸收波長(zhǎng)分別為288.4，288.6，288.6 nm，吸光度分別為0.471，0.291，0.219，KOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)的吸光度最大且峰形窄。因此，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)分離出醇溶蛋白最純。

同樣，由圖4可見(jiàn)，沸石處理時(shí)間越長(zhǎng)，所分離出來(lái)的醇溶蛋白量也越多，結(jié)合圖5(b)可以得到，沸石處理時(shí)間為30，60，120 min的最大吸收波長(zhǎng)分別為288.4，288.0，289.6 nm，吸光度分別為0.351，0.368，0.605，時(shí)間為120 min時(shí)吸光度最大且峰形窄。因此，處理沸石時(shí)間為120 min時(shí)分離出的醇溶蛋白最純。

圖4 不同工藝預(yù)處理沸石對(duì)分離醇溶

由圖4還可以看出，在沸石改性中，隨溫度上升，沉淀重量先上升后減少，然后再上升，即大多條件下，溫度在50 ℃時(shí)所分離出的蛋白量最多，結(jié)合圖5(c)可得出，在50，70，90 ℃下，組分A的最大吸收波長(zhǎng)為288.0，288.4，289.6 nm，吸光度分別為0.364，0.308，0.164，溫度為50 ℃時(shí)的吸光度最大且峰形窄。因此，處理沸石溫度為50 ℃時(shí)分離出醇溶蛋白最純。

由單因素結(jié)果可知，沸石處理溫度為50 ℃、KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、處理時(shí)間為120 min時(shí)醇溶蛋白分離量最大。按照最佳工藝參數(shù)醇溶蛋白最大分離量為10.336 g/kg沸石，同組未經(jīng)堿液處理沸石所分離出的醇溶蛋白為4.730 g/kg沸石，分離最大量相較于空白試驗(yàn)分離量多出5.606 g/kg沸石。進(jìn)而觀(guān)察同一組樣品分離出的3個(gè)組分的蛋白是否一樣。由圖5(d)可知，分離出的醇溶蛋白不同組分的最大吸收波長(zhǎng)基本相同，通過(guò)紫外最大吸收波長(zhǎng)無(wú)法判斷醇溶蛋白中α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白各組分的比例。

圖5 不同方式預(yù)處理沸石后所分離醇溶蛋白組分的紫外吸收光譜圖

2.4 沸石分離醇溶蛋白組分中醇溶蛋白各組分比例

表1為沸石柱層析分離所得三組分中醇溶蛋白組分分子量及含量。由表1可知，柱層析A組分主要成分是低分子量醇溶谷蛋白，B組分主要成分是高低分子醇溶谷蛋白和α-、β-、γ-、ω-醇溶蛋白，C組分主要成分為低分子量醇溶谷蛋白。但C組分中的高分子量醇溶谷蛋白分子量比A、B組分中的大很多，進(jìn)而使該組分的平均分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于A、B組分。大分子量醇溶谷蛋白對(duì)于面筋延展性具有重要作用，因而制備該類(lèi)蛋白添加劑用于面條等食品中可大大減小面條煮熟過(guò)程的斷條率。

表1 沸石柱層析分離所得三組分中醇溶蛋白組分分子量及含量?

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同條件下的醇溶蛋白的提取情況以及其提取物的顯微圖像進(jìn)行分析，探究醇溶蛋白的最佳提取條件，并以最佳條件下制備的醇溶蛋白為原料，通過(guò)對(duì)分離情況及紫外波長(zhǎng)、蛋白組分分子量等分析研究堿液處理沸石分離醇溶蛋白組分工藝。結(jié)果表明，溫度對(duì)醇溶蛋白凝沉速率影響很大，貯存在4 ℃環(huán)境下谷朊粉中提取醇溶蛋白的效果最好，提取率可達(dá)24%；KOH改性沸石后所分離醇溶蛋白量與KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈反比，與改性時(shí)間呈正比，溫度為50 ℃、KOH溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、處理時(shí)間為120 min時(shí)預(yù)處理沸石醇溶蛋白分離量最大，分離量為10.336 g/kg沸石，相較于空白試驗(yàn)分離量多出5.606 g/kg沸石。根據(jù)紫外波長(zhǎng)分析，醇溶蛋白及其組分的最大紫外吸收波長(zhǎng)在288.4 nm附近。靜置凝沉過(guò)程中醇溶蛋白中α-、β-、γ-醇溶蛋白組分先沉淀析出，ω-醇溶蛋白組分最后凝沉析出。高分子量醇溶谷蛋白對(duì)于面筋延展性具有重要作用，因此對(duì)于分子量范圍分布更窄的高分子量醇溶谷蛋白組分分離及應(yīng)用是未來(lái)的研究和發(fā)展方向。