α-1抗胰蛋白酶對(duì)缺氧/復(fù)氧小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

黃達(dá) 劉燕 黃蘭松 岑團(tuán) 劉文靜 潘興壽 黃照河

【摘要】 目的 ?建立小鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，觀察α-1抗胰蛋白酶（α-1 antitrypsin，A1AT）對(duì)小鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

方法 ?體外采用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）4 mmol/L誘導(dǎo)的缺氧培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞，模擬缺氧/復(fù)氧模型，并篩選A1AT最佳干預(yù)濃度，篩選A1AT最佳干預(yù)濃度實(shí)驗(yàn)分為7個(gè)組：Blank組、Control組、H/R組、A1AT 10 μmol/L 組、A1AT 20 μmol/L 組、A1AT 40 μmol/L 組以及A1AT 80 μmol/L 組。篩選最佳干預(yù)時(shí)間實(shí)驗(yàn)分為8個(gè)組：Blank組、Control組、H/R組、A1AT 1 h組、A1AT 2 h組、A1AT 4 h組、A1AT 6 h組及A1AT 12 h組。之后A1AT干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：正常組（Control組）、缺氧/復(fù)氧組（H/R組）、α-1抗胰蛋白酶干預(yù)組（A1AT組）。利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞功能、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、免疫熒光及Western Blot 檢測(cè)caspase-3的表達(dá)。并用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

結(jié)果 ?A1AT最佳干預(yù)濃度為20 μmol/L，最佳干預(yù)時(shí)間為4小時(shí)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H/R組細(xì)胞凋亡率增加，A1AT組細(xì)胞凋亡率明顯下降，Control組、H/R組及A1AT組三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H/R組caspase-3分子表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，與Control組及A1AT組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)H/R組caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，與Control組及A1AT組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。

結(jié)論 ?α-1抗胰蛋白酶對(duì)小鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡具有改善作用。

【關(guān)鍵詞】 ?α-1抗胰蛋白酶;Na2S2O4;缺氧/復(fù)氧;凋亡;caspase-3

中圖分類號(hào)： R363?? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A?? ?DOI： 10.3969/j.issn.1003-1383.2021.08.003

Effects of α-1 antitrypsin on cardiomyocyte apoptosis in hypoxia/reoxygenation mice

HUANG Da， LIU Yan， HUANG Lansong， CEN Tuan， LIU Wenjing， PAN Xingshou， HUANG Zhaohe▲

（Department of Cardiovascular， Affiliated Hospital of ?Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective ?To establish a hypoxia/reoxygenation model of? cardiomyocytes in mice， and observe the effect of α-1 antitrypsin （A1AT） on cardiomyocyte apoptosis in mice.

Methods ?Mouse cardiomyocytes were cultured in vitro by hypoxia medium induced by （Na2S2O4） 4 mmol/L of sodium dithionite， hypoxia/reoxygenation model was simulated， and the best intervention concentration of A1AT was selected. The experiment of screening the best intervention concentration of A1AT was divided into 7 groups： blank group， control group， H/R group and A1AT 10 μmol/L group， A1AT 20 μmol/L group， A1AT 40 μmol/L group and A1AT 80 μmol/L group. The experiment of screening the best intervention time was divided into 8 groups： blank group， control group， H/R group， A1AT 1 h group， A1AT 2 h group， A1AT 4 h group， A1AT 6 h group and A1AT 12 h group. After that， A1AT intervention experiment was divided into normal group （control group）， hypoxia reoxygenation group （H/R group） and α-1 antitrypsin intervention group （A1AT group）. CCK-8 was used to detect cell function， flow cytometry was used to detect the expression of apoptosis， and immunofluorescence and Western Blot were used to detect the expression of caspase-3. In addition， SPSS 22.0 was used for data statistics.

Results ?The best intervention concentration for A1AT was 20 μmol/L， and the best intervention time was 4 hours. The results of flow cytometry showed that the apoptosis rate increased in the H/R group and decreased significantly in the A1AT group， and there was statistically significant difference among the control group， the H/R group and the A1AT group （ P ?< 0.05）. The Immunofluorescence detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was strong positive， and compared with the control group and the A1AT group， the difference was statistically significant （ P ?< 0.05）. Western Blot detection revealed that the expression of caspase-3 molecules in the H/R group was up-regulated， and compared with the control group and the A1AT group， the difference was statistically significant （ P ?< 0.05）.

Conclusion ?α-1 antitrypsin can improve the apoptosis of hypoxia/reoxygenation cardiomyocytes in mice.

【Key words】 ?A1AT; Na2S2O4; hypoxia/reoxygenation; apoptosis; caspase-3

目前，心血管病死亡占城鄉(xiāng)居民總死亡原因的首位，農(nóng)村占45.91%，城市占43.56%[1]?！吨袊?guó)心血管健康與疾病報(bào)告2019》推算心血管病現(xiàn)患人數(shù)3.30億，其中冠心病1100萬(wàn)，肺源性心臟病500萬(wàn)，心力衰竭890萬(wàn)，先天性心臟病200萬(wàn)，高血壓2.45億。心血管病死亡率的上升趨勢(shì)主要是由于缺血性心臟?。╥schemia heart disease，IHD）死亡上升所致。急性心肌梗死是IHD的主要類型，早期再灌注治療是恢復(fù)心肌血液供應(yīng)唯一有效的途徑，雖然及時(shí)恢復(fù)心肌血液灌注挽救了不少生命，但心臟血液供應(yīng)不足一段時(shí)間后，恢復(fù)血液灌注心肌損傷反而加重，從而出現(xiàn)心肌頓抑、心臟功能下降甚至致命性心律失常，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI）。再灌注后心肌壞死面積增加50%[2]。但MIRI的發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，可能與氧自由基、炎性細(xì)胞因子、蛋白酶等介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能受損及心肌受損有關(guān)[3～4]。其中，凋亡在MIRI中起到很關(guān)鍵的作用。然而，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)任何一種有效防止MIRI的方法。α-1抗胰蛋白酶（α-1 antitrypsin，A1AT）是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的一員，其主要作用是保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶的損傷，抑制感染和炎癥，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡[5]。近年來(lái)，A1AT在干預(yù)炎癥因子的治療研究中愈來(lái)愈得到廣大學(xué)者的青睞，目前已經(jīng)廣泛用于各種炎癥疾病的治療。本實(shí)驗(yàn)研究是在心肌缺血再灌注損傷學(xué)說的基礎(chǔ)上，總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，建立小鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，探索A1AT對(duì)小鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

導(dǎo)師組凍存小鼠心肌細(xì)胞（型號(hào)FMC84，來(lái)源：ATCC），caspase-3抗體購(gòu)自CST。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 CCK-8檢測(cè)法篩選A1AT最佳干預(yù)濃度及最佳干預(yù)時(shí)間

篩選A1AT最佳干預(yù)濃度實(shí)驗(yàn)分為 7個(gè)組：Blank組、Control組、H/R組、A1AT 10 ?μmol/L 組、A1AT 20 μmol/L 組、A1AT 40 μmol/L 組以及A1AT 80 μmol/L 組，按設(shè)定的濃度預(yù)先干預(yù)2小時(shí)，孔中換成4 mmol/L的Na2S2O4誘導(dǎo)缺氧1小時(shí)后，吸取Na2S2O4溶液棄掉，并予PBS清洗兩次，予含有10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L及80 μmol/L的α-1抗胰蛋白酶的完全培養(yǎng)基復(fù)氧24小時(shí)，用CCK8檢測(cè)它們的活力，篩選最佳α-1抗胰蛋白酶干預(yù)濃度。篩查A1AT最佳干預(yù)時(shí)間實(shí)驗(yàn)分為8個(gè)組：Blank組、Control組、H/R組、A1AT 1 h組、A1AT 2 h組、A1AT 4 h組、A1AT 6 h組及A1AT 12 h組，心肌細(xì)胞接種至96孔板中，以α-1抗胰蛋白酶最佳干預(yù)濃度干預(yù)，待細(xì)胞貼壁后，予20 μmol/L α-1抗胰蛋白酶分別干預(yù)1 h、2 h、4 h、6 h和12 h，到時(shí)間即去掉α-1抗胰蛋白酶藥液，并予PBS清洗兩次，予4 mmol/L Na2S2O4干預(yù)60 min建立小鼠心肌細(xì)胞缺氧模型，之后去掉Na2S2O4溶液，予完全培養(yǎng)基復(fù)氧24小時(shí)，進(jìn)行CCK8檢測(cè)。

1.2.2 利用流式細(xì)胞儀雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

我們利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法標(biāo)記小鼠心肌細(xì)胞FMC84，對(duì)Control組、H/R組、A1AT組進(jìn)行凋亡檢測(cè)，收集細(xì)胞后在1小時(shí)內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。設(shè)置四個(gè)象限，分別為1象限：此區(qū)域?yàn)闄C(jī)械損傷及壞死細(xì)胞;2象限：此區(qū)域?yàn)橥砥诘蛲黾?xì)胞;3象限：此區(qū)域?yàn)榇婊罴?xì)胞;4象限：其區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞。以4象限細(xì)胞數(shù)來(lái)判定各組細(xì)胞早期凋亡程度。

1.2.3 利用免疫熒光檢測(cè)caspase-3表達(dá)

按一定細(xì)胞濃度在24孔板種植細(xì)胞，待細(xì)胞爬片后以4%的聚甲醛固定，0.5% Triton 破膜，山羊血清封閉，之后以一抗4℃ 孵育過夜，加熒光二抗，滴加DAPI再染核，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)caspase-3表達(dá)

按一定的細(xì)胞濃度在6孔板中種植細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行造模及藥物干預(yù)，收取細(xì)胞，提取蛋白，按提取的蛋白濃度在電泳槽中上樣，跑電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育過夜，孵育二抗，利用凝膠系統(tǒng)成像儀進(jìn)行顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Graphprism 5.0進(jìn)行作圖。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ?±s ）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用 q 檢驗(yàn)（Newman-Keuls法），檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 A1AT干預(yù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的濃度梯度探索

與Blank組比較，不同濃度的A1AT均可不同程度地影響小鼠心肌細(xì)胞活力，其中A1AT 20 μmol/L 組的影響最明顯。提示α-1抗胰蛋白酶20 μmol/L是最佳干預(yù)濃度。見表1。

2.2 A1AT干預(yù)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的時(shí)間梯度探索

與Control組相比，α-1抗胰蛋白酶作用時(shí)間不同可對(duì)細(xì)胞活力造成不同的影響，其中A1AT 4 h組作用時(shí)間最佳，4小時(shí)后隨著α-1抗胰蛋白酶作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞活力逐漸下降。α-1抗胰蛋白酶4小時(shí)作用的OD值與對(duì)照組及A1AT 2 h組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與其他作用時(shí)間組及H/R組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。提示α-1抗胰蛋白酶干預(yù)的最佳時(shí)間為4小時(shí)。見表2。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡

與Control組比較，H/R組心肌細(xì)胞早期凋亡明顯增加，A1AT干預(yù)后心肌細(xì)胞凋亡減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。結(jié)果提示Na2S2O4誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧可以增加心肌細(xì)胞凋亡，A1AT預(yù)先干預(yù)后Na2S2O4誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞早期凋亡減少（圖1）。

2.4 免疫熒光檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞caspase-3分子表達(dá)

caspase-3免疫熒光陽(yáng)性為小鼠心肌細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光物質(zhì)。Control組、H/R組、A1AT組caspase-3的平均陽(yáng)性表達(dá)率分別為19.16%，68.47%，35.52%，染色強(qiáng)度為弱陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性，平均總積分分別為1分，5分，2.67分。Control組染色為陰性，H/R組及A1AT染色為陽(yáng)性，且H/R組較A1AT組更為明顯（圖2），三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <0.05）。提示A1AT對(duì)MIRI細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用。

2.5 Western Blot 檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞 caspase-3蛋白表達(dá)

我們利用Western Blot 技術(shù)對(duì)caspase-3蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與Control組比較，H/R組caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，A1AT干預(yù)后其表達(dá)明顯下調(diào)，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P <005）（圖3）。說明A1AT對(duì)MIRI心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

3 討? 論

MIRI后壞死心肌的面積增加了50%[2]，但發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，可能與氧化應(yīng)激、炎癥因子等介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)[3～4]。由于MIRI預(yù)后差，危害大，對(duì)MIRI的治療也成為當(dāng)前醫(yī)療界的研究熱點(diǎn)之一。

A1AT是急性反應(yīng)性蛋白質(zhì)，在炎癥性疾患時(shí)，A1AT可透過毛細(xì)血管進(jìn)入組織液，在炎癥局部往往濃度很高，對(duì)急性炎性疾病有一定限制作用[6]。A1AT具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和細(xì)胞保護(hù)特性，與降低IL-6和IL-8的表達(dá)和成熟有關(guān)[7]。冠狀動(dòng)脈硬化癥的發(fā)生與炎癥因子密切相關(guān)，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，血漿A1AT水平與心絞痛患者冠狀動(dòng)脈狹窄的存在和嚴(yán)重程度相關(guān)[8]，還有研究發(fā)現(xiàn)，A1AT可以抑制IL-1的產(chǎn)生從而影響急性冠脈綜合征的預(yù)后[9]。A1AT在干預(yù)炎癥因子的治療中愈來(lái)愈得到廣大學(xué)者的青睞，目前已經(jīng)廣泛用于各種炎癥疾病。因此，干預(yù)炎癥因子對(duì)防治MIRI尤為重要。

缺血性心肌病大多數(shù)是由急性冠脈綜合征演變而來(lái)，且其發(fā)生機(jī)制與氧自由基、炎癥因子有關(guān)[10]。氧化應(yīng)激是炎癥的特征之一， 氧化應(yīng)激不僅可以導(dǎo)致組織損傷， 還可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)[11]。氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的特征表現(xiàn)之一，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)爆發(fā)[12～13]。因此，阻斷炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激可以在一定程度上減輕缺血再灌注損傷。炎癥細(xì)胞因子的代表性家族為白介素家族，處于免疫反應(yīng)及凋亡的上游，可以調(diào)控凋亡的發(fā)生，從而加劇缺血再灌注損傷[14]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯減少，caspase-3表達(dá)明顯增加，提示凋亡參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，這與王娓娓團(tuán)隊(duì)及李奇的研究一致[15～16]。近年來(lái)，隨著臨床藥物的深入研究與應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，A1AT在控制炎癥和免疫過程中起關(guān)鍵作用[17～18]，我們的研究亦發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧予A1AT干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯下降，且caspase-3表達(dá)明顯下降，這可能與A1AT可以有效干預(yù)炎癥反應(yīng)[19]進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。說明A1AT具有干預(yù)凋亡的作用，但目前這方面的研究甚少。但有國(guó)外報(bào)道A1AT可減少缺血再灌注引起的急性炎癥損傷[20]，有學(xué)者使用內(nèi)皮細(xì)胞單層暴露于缺氧/復(fù)氧模型來(lái)研究A1AT在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) A1AT的過表達(dá)可抗氧化應(yīng)激從而降低了細(xì)胞凋亡并促進(jìn)了增殖[21]。

綜上所述，凋亡是MIRI的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，A1AT可以下調(diào)caspase-3，A1AT可能通過干預(yù)凋亡起到預(yù)防心肌缺血再灌注損傷的作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2021-04-13 修回日期：2021-07-23）

（編輯：梁明佩）