子癇前期患者胎盤(pán)組織中骨保護(hù)素和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及其與疾病發(fā)展的相關(guān)性

周向東，黃苗苗，朱凱恒，張英

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽合肥230022

子癇前期（preeclampsia，PE）發(fā)生在妊娠20周后，發(fā)病機(jī)制為全身性小血管痙攣和血管內(nèi)皮損傷，該病可呈持續(xù)發(fā)展，臨床表現(xiàn)多樣化，主要表現(xiàn)為高血壓、蛋白尿、組織水腫、頭痛頭暈、視物模糊，進(jìn)一步發(fā)展可能出現(xiàn)抽搐、內(nèi)臟出血及多器官功能損害甚至衰竭等，因病情進(jìn)展迅速，并發(fā)癥多，嚴(yán)重危害母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡率增加的主要原因，對(duì)于PE的早期識(shí)別與干預(yù)治療尤為重要，目前針對(duì)此妊娠期特殊疾病的檢驗(yàn)及檢查指標(biāo)十分有限，為此，開(kāi)展該方面相關(guān)研究對(duì)尋找該病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義［1］。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）最早是在人體骨組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，是人體內(nèi)功能蛋白的一種，因其具有抑制骨分化、參與骨細(xì)胞代謝等功能，在骨組織修復(fù)與骨再生等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究表明，OPG不僅在骨組織中發(fā)揮功能作用，在其他人體組織中也起重要作用，如廣泛參與機(jī)體代謝、組織細(xì)胞修復(fù)、腫瘤及免疫反應(yīng)等；OPG廣泛分布于心、骨骼、血管、肝臟、平滑肌等組織細(xì)胞中，有研究發(fā)現(xiàn)，OPG參與調(diào)控血管內(nèi)皮損傷、血管鈣化及微血栓形成等［2］，但在產(chǎn)科領(lǐng)域目前研究較少，特別是PE的血管病理研究方面鮮有報(bào)道。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是人體重要的炎癥因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮和組織損傷、組織細(xì)胞凋亡等［3］。該炎癥因子雖然在病理產(chǎn)科方面有研究報(bào)道，但在PE病理機(jī)制研究方面報(bào)道較少。而PE的重要病理生理變化之一就是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起臨床病癥，造成不良妊娠，嚴(yán)重者甚至危害母胎安危，因此，對(duì)PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α的表達(dá)水平進(jìn)行研究，將有助于PE發(fā)病與預(yù)后的檢測(cè)。本研究旨在探討PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α的表達(dá)及其與疾病發(fā)展的相關(guān)性，為闡明PE的發(fā)病機(jī)制及探討診斷和預(yù)后指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 胎盤(pán)組織 選取2019年1月—2020年12月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科確診為PE的單胎妊娠患者60例作為試驗(yàn)組［診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》（第9版）］，選擇胎盤(pán)母體面的無(wú)鈣化區(qū)，剪取全層胎盤(pán)組織，迅速用無(wú)菌生理鹽水清洗干凈血塊和血液，干紗布凈除水分，分割成大小約1 cm×1 cm×1 cm的塊狀，一部分制作蠟塊用于免疫組化檢測(cè)，另一部分放入凍存管，于-80℃冰箱保存，用于mRNA及蛋白的提取。同時(shí)選取36例正常足月妊娠、瘢痕子宮單胎妊娠、經(jīng)剖宮產(chǎn)分娩患者的胎盤(pán)組織作為對(duì)照組，標(biāo)本留取方法同前。

1.2 主要試劑 兔抗OPG多克隆抗體和兔抗TNF-α多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；鼠抗β-actin抗體單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L）試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物科技發(fā)展有限公司；Trizol試劑和預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑購(gòu)自上海星漢生物科技有限公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑、BCA試劑盒、化學(xué)發(fā)光液和蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；預(yù)制膠購(gòu)自南京金斯瑞生物公司；PVDF膜購(gòu)自德國(guó)Millipore公司；通用型組化二抗（Universal Anti-Mouse／Rabbit-HRP）購(gòu)自上海長(zhǎng)島生物公司；DAB染色液購(gòu)自基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α基因mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。用RNA提取試劑盒提取各組織樣本中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。RNA經(jīng)預(yù)變性后，按照逆轉(zhuǎn)錄體系配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為：37℃15 min，98℃5 min，-20℃保存。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃1 min，55℃1 min，95℃30 s。采用2ΔΔCt法分析基因的相對(duì)表達(dá)。使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，OPG基因（NCBI ID：4982）上游引物序列為：5′-GCGCTCGTGTTTCTGGACA-3′，下游引物序列為：5′-AGTATAGACACTCGTCACTGGTG-3′；TNF-α基因（NCBI ID：7124）上游引物序列為：5′-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3′，下游引物序列為：5′-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3′；β-actin基因（NCBI ID：60）上游引物序列為：5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，下游引物序列為：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

1.4.1 Western blot法 取直徑約1 cm大小的組織，加入1 mL蛋白裂解液，使用組織勻漿器研磨組織，離心取上清，通過(guò)BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取25 μg蛋白樣品，經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉90 min；加入兔抗OPG、TNF-α多克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5 000稀釋?zhuān)覝胤跤?0 min；用TBST溶液洗膜3次，每次10 min；配制化學(xué)發(fā)光液，使用Tanon全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)蛋白表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參。

1.4.2 免疫組化法 組織石蠟包埋，切片（厚度3 μm），脫蠟、水化、抗原修復(fù)2 min，加入3%H2O2，孵育20 min；PBS洗滌3次，切片甩干，加入OPG（1∶200稀釋?zhuān)┖蚑NF-α（1∶200稀釋?zhuān)┛贵w，37℃孵育60 min；PBS洗滌3次，加入通用性組化二抗，37℃孵育20 min；PBS洗滌3次，甩干，加入DAB顯色劑，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)陽(yáng)性指標(biāo)終止顯色，蒸餾水沖洗后襯染，蘇木素染色1 min后水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，水洗，碳酸鋰藍(lán)化1 min后水洗，最后脫水、透明、封片。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：通過(guò)不同染色識(shí)別胎盤(pán)中OPG與TNF-α蛋白的表達(dá)，主要分為淡黃色、深黃色或棕黃色、棕褐色，隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：染色強(qiáng)度（陽(yáng)性染色指標(biāo)分類(lèi)：1分為淡黃色，2分為深黃色或棕黃色，3分為棕褐色）；陽(yáng)性細(xì)胞百分比（陽(yáng)性百分比指標(biāo)分類(lèi)：0分為＜5%，1分為5%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%）。上述兩者相加之和判定結(jié)果為：0～2分為陰性，3～5分為弱陽(yáng)性，6～8分為中度陽(yáng)性，9～12分以上為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象一般生理指標(biāo)的比較 與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組孕產(chǎn)婦血壓顯著升高（χ2分別為4.18和3.25，P＜0.05），新生兒出生體重顯著降低（χ2=6.53，P＜0.05）；但孕產(chǎn)婦的年齡、體重、體重指數(shù)（body mass index，BMI）及孕周差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為4.21、4.35、2.16和0.36，P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般生理指標(biāo)的比較（±s）Tab.1 General physiological indexes of pregnant women in two groups（±s）

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般生理指標(biāo)的比較（±s）Tab.1 General physiological indexes of pregnant women in two groups（±s）

注：a表示與試驗(yàn)組比較，P＜0.05。

?

2.2 PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α基因mRNA表達(dá)水平qRT-PCR結(jié)果表明，試驗(yàn)組胎盤(pán)組織中OPG基因mRNA表達(dá)水平（0.34±0.02）顯著低于對(duì)照組（0.69±0.04）（P＜0.000 1），而TNF-α基因mRNA表達(dá)水平（0.39±0.10）則顯著高于對(duì)照組（0.16±0.05）（P=0.000 1）。

2.3 PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α蛋白表達(dá)水平

2.3.1 Western blot法 試驗(yàn)組胎盤(pán)組織中OPG蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，而TNF-α蛋白表達(dá)水平則顯著高于對(duì)照組，見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot分析兩組胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α蛋白的表達(dá)情況Fig.1 Western blotting of OPG and TNF-α expressions in placenta tissues in two groups

2.3.2 免疫組化法 對(duì)照組胎盤(pán)組織中OPG蛋白免疫組化染色多為陽(yáng)性表達(dá)，呈彌漫性分布，有時(shí)成團(tuán)或塊狀聚集；而試驗(yàn)組胎盤(pán)組織中則呈低表達(dá)或不表達(dá)。對(duì)照組和試驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.6%（29／36）和35.0%（21／60），兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.71，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組胎盤(pán)組織中TNF-α蛋白免疫組化染色多為弱陽(yáng)性或無(wú)表達(dá)，而試驗(yàn)組胎盤(pán)組織中則呈中度或高表達(dá)。試驗(yàn)組和對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)率分別為71.7%（43／60）和27.8%（10／36），兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.53，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫組化法分析兩組胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α蛋白的表達(dá)情況（×400）Fig.2 Immunohistochemical assay of OPG and TNF-α expressions in placenta tissue of two groups（×400）

2.3.3 PE患者胎盤(pán)組織中OPG與TNF-α蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman分析顯示，6例PE患者胎盤(pán)組織中OPG和TNF-α蛋白表達(dá)均陽(yáng)性，2例均陰性，OPG與TNF-α蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.702，P＜0.001）。見(jiàn)表2。

表2 PE患者胎盤(pán)組織中OPG與TNF-α蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation of OPG and TNF-α expressions in placenta tissue of patients with PE

3 討論

PE是妊娠期特有疾病，發(fā)病機(jī)制主要與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不足、炎癥免疫激活與亢進(jìn)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂等密切相關(guān)［4］，其病因和發(fā)病機(jī)制可能是多種易感因素促進(jìn)、多信號(hào)通路激活、多觸發(fā)機(jī)制致病相互作用的結(jié)果［5］。病理生理學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，PE結(jié)局為血管痙攣及內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致多臟器多系統(tǒng)功能損害。

本實(shí)驗(yàn)正常妊娠胎盤(pán)組織中的OPG無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于PE組，提示OPG可能對(duì)PE患者血管炎癥刺激起抑制作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)和修復(fù)作用，反之，其在胎盤(pán)組織中表達(dá)量下降可能會(huì)加重血管炎性病變，促進(jìn)PE疾病進(jìn)展，這是由于OPG不僅具有骨保護(hù)功能，其在保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血管功能方面也起重要作用，機(jī)制可能與OPG配體、NF-κB配體受體激活劑（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）和TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）的相互作用以及炎癥與凋亡的雙向調(diào)節(jié)密切相關(guān)。有研究證實(shí)，OPG表達(dá)水平與血管內(nèi)皮損傷及鈣化相關(guān)，進(jìn)而與血管和重要器官的損害密切相關(guān)［6-7］。OPG可通過(guò)抑制炎癥因子釋放，從而減少對(duì)血管內(nèi)皮的損傷；還可通過(guò)加快內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)，起到保護(hù)血管及避免血管內(nèi)皮損害的作用，其發(fā)生機(jī)制可能是通過(guò)抑制TRAIL與其受體結(jié)合發(fā)揮上述作用［8］。OPG還可通過(guò)調(diào)節(jié)血管活性，促進(jìn)有益血管活性因子釋放，從而減少血管鈣質(zhì)沉積，減輕炎癥反應(yīng)，從而起到保護(hù)血管的作用［9-10］。但OPG對(duì)PE患者血管炎癥的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步闡明。

TNF-α作為炎性細(xì)胞因子，由多種細(xì)胞合成分泌，其在炎細(xì)胞激活與級(jí)聯(lián)釋放、細(xì)胞免疫應(yīng)答、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、腫瘤血管發(fā)生及炎癥感染等方面起重要作用［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，在PE患者胎盤(pán)組織中，TNF-α在mRNA及蛋白水平的表達(dá)均顯著增高，提示其可能引起胎盤(pán)血管炎性反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損害，最終導(dǎo)致PE疾病進(jìn)展。這是由于TNF-α可參與炎癥細(xì)胞代謝及細(xì)胞增殖、分化與凋亡等，TNF-α在PE胎盤(pán)組織中的表達(dá)明顯增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷增加，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路在其中發(fā)揮重要作用，該通路被激活后，可促進(jìn)炎癥相關(guān)靶基因的表達(dá)及TNF-α表達(dá)上調(diào)，造成血管內(nèi)皮損傷、血流動(dòng)力學(xué)改變、新生血管形成等一系列病理變化［12-13］。此外，TNF-α還可通過(guò)正反饋進(jìn)一步激活NF-κB通路，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和損傷，促進(jìn)疾病發(fā)展［14］。

由于OPG與TNF-a在PE發(fā)病機(jī)制中的作用鮮有報(bào)道，本研究探討了兩者是否存在相關(guān)性，結(jié)果表明，OPG與TNF-a在PE病程中呈負(fù)相關(guān)，這是由于OPG可通過(guò)抑制RANKL的分泌進(jìn)而抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)下游炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，并誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡，顯示了抗炎活性［15-16］；TNF-α可通過(guò)激活NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)多種炎癥因子激活與活化，引起細(xì)胞損害［17-19］，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，OPG與TNF-a在PE發(fā)病中呈負(fù)相關(guān)，可能與PE疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為PE臨床早期診斷和疾病監(jiān)測(cè)的輔助參考指標(biāo)之一。