巨型艾美耳球蟲裂殖子的分離和純化

張榕珍，王黎霞，郭許情，張 健，張?zhí)煊?，張建軍，?健*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧醫(yī)系，北京102442)

巨型艾美耳球蟲(Eimeriamaxima)是集約化雞場(chǎng)常見的球蟲之一，也是7種禽類艾美耳球蟲中田間檢出率較高的蟲種[1-2]。由于該蟲種免疫原性較高，近年來成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。裂殖子是球蟲無性生殖階段的蟲體。分離和純化出大量蟲體是研究球蟲免疫學(xué)、生物化學(xué)、抗藥性以及細(xì)胞共培養(yǎng)的基礎(chǔ)。然而，目前關(guān)于裂殖子分離和純化的報(bào)道十分有限，且主要集中在柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)，毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)和堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)，缺乏巨型艾美耳球蟲裂殖子分離和純化的相關(guān)報(bào)道。

巨型艾美耳球蟲第1代裂殖子出現(xiàn)的最早時(shí)間是在感染后48 h，最短潛隱期為121 h[3-4]，但分離裂殖子的時(shí)間未被確定。此外，巨型艾美耳球蟲被公認(rèn)為寄生于小腸中段，但是能分離較多裂殖子的具體腸段未被細(xì)化。此前，有研究人員在不同接種時(shí)間分腸段對(duì)巨型艾美耳球蟲的內(nèi)生性發(fā)育進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)隨感染時(shí)間的變化，裂殖子不同發(fā)育階段的寄生部位有所改變[5]。

據(jù)報(bào)道，裂殖子可通過密度梯度離心法、酶消化法、過濾法和層析法進(jìn)行純化。有研究者將酶消化法與密度梯度離心法相結(jié)合，獲得純度較高的柔嫩艾美耳球蟲2代裂殖子[6-7]。此外，通過DEAE-52纖維素柱層析法結(jié)合過濾法和差速離心法能獲得純凈裂殖子[8-9]。該方法較好的避免了密度梯度制備過程中由于操作失誤造成材料浪費(fèi)的可能性，雖然過程復(fù)雜，但操作易于進(jìn)行，獲得裂殖子純化程度較高，試驗(yàn)效果較為理想。

本研究收集感染后48～124 h的巨型艾美耳球蟲裂殖子，篩選能夠分離較多裂殖子的時(shí)間和位置；經(jīng)粗純化后，通過DEAE-52纖維素柱層析法對(duì)裂殖子進(jìn)一步純化，并確定收集純凈裂殖子的最佳時(shí)間，為在合適的時(shí)間及腸段分離并純化巨型艾美耳球蟲裂殖子提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及蟲株

1日齡健康白羽肉雞購(gòu)買于北京農(nóng)效禽業(yè)有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)在無球蟲環(huán)境下，飼喂無球蟲、無藥物添加的飼料及自來水，自由飲食；巨型艾美耳球蟲蟲株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲試驗(yàn)室惠贈(zèng)。該試驗(yàn)已通過北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查，編號(hào)為BUA2020093。

1.2 試劑和儀器

DEAE-52纖維素：Biotopped試劑公司；洗脫液(pH8.0 Glycine-NaCl緩沖液)，2.5%重鉻酸鉀溶液，飽和食鹽水，HCl、NaOH等(化學(xué)試劑購(gòu)自北京試劑公司)。

組織勻漿機(jī)，離心機(jī)，0.074 mm標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩，層析柱(直徑1.5 cm，柱高25.0 cm)，血球計(jì)數(shù)板。

1.3 巨型艾美耳球蟲卵囊的制備

為保證蟲株活力，將北京農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的巨型艾美耳球蟲進(jìn)行復(fù)壯。分別對(duì)20只14日齡無球蟲肉雞感染孢子化卵囊，每只雞感染15×104個(gè)。收取感染后5～9 d的糞便，用飽和食鹽水漂浮法[10]分離純化卵囊，置于2.5%重鉻酸鉀溶液中，在28 ℃下通風(fēng)孢子化24 h，保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4 分離巨型艾美耳球蟲裂殖子最佳時(shí)間的探索

對(duì)57只25日齡肉雞進(jìn)行攻蟲，每只感染3×105個(gè)卵囊。肉雞感染后，分別在感染后48、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120和124 h撲殺3只感染肉雞，收取十二指腸末端到卵黃蒂后5 cm處的腸段，洗去腸段內(nèi)容物，置于0 ℃洗脫液中，用載玻片刮取腸黏膜。組織勻漿器處理3～5 min，使裂殖子充分游離在緩沖液中，用0.074 mm標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)篩過濾除去大塊組織和部分雜質(zhì)。濾液經(jīng)1 500 r/min離心10 min，棄上清，重懸沉淀后加洗脫液定容至60 mL。洗脫液600 r/min離心8 min，除去體積和密度較大的紅細(xì)胞和雜質(zhì)，收集上清。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)粗純化的裂殖子進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定最佳分離時(shí)間。

1.5 確定分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的最佳腸段

對(duì)5(n=3)只肉雞口服接種3×105個(gè)孢子化卵囊，在分離裂殖子的最佳時(shí)間撲殺。取十二指腸末端到卵黃蒂后5 cm處小腸并均分為5段，并依次編號(hào)。具體分段方法及位置如表1所示。

表1 腸段的分段方法及位置Tab.1 Segmentation method and location of intestinal segments

依照“1.4”中所述方法對(duì)每個(gè)腸段中的裂殖子進(jìn)行分離和粗純化，并通過血球計(jì)數(shù)板鏡下計(jì)數(shù)。使用Graphpad Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的最佳腸段。

1.6 DEAE-52纖維素柱層析純化裂殖子

1.6.1 DEAE-52纖維柱的制備 于試驗(yàn)前2 d對(duì)DEAE-52纖維素進(jìn)行預(yù)處理。取適量DEAE-52纖維素，加入去離子水溶脹24 h，每8 h更換1次去離子水。然后棄掉上清，用0.1 mol/L NaOH溶液處理1 h，去離子水洗滌至pH=7；0.1 mol/L的HCl溶液處理1 h并洗滌至pH=7，自然沉淀。隨后棄上清并加入洗脫液，將纖維素平衡至pH=8后裝柱，柱高5 cm，備用。

1.6.2 巨型艾美耳球蟲裂殖子的純化 將粗純化的60 mL含裂殖子的洗脫液緩慢倒入層析柱中，用玻璃棒引流，注意不要破壞纖維柱平面。準(zhǔn)備收集管并編號(hào)為1號(hào)到30號(hào)，從第1管開始收集層析液，依次收集至第30管。層析液流速為2 mL/min，每個(gè)收集管收集2 mL。用血球計(jì)數(shù)板對(duì)每管中的裂殖子進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用Graphpad Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 巨型艾美耳球蟲裂殖子最佳分離時(shí)間

感染后48 h，雞腸道上皮中有巨型艾美耳球蟲裂殖子產(chǎn)生；感染后60 h裂殖子增加趨勢(shì)開始明顯，于感染后84 h達(dá)到峰值；88～92 h裂殖子顯著下降，92 h后緩慢下降至較低水平。感染后84 h為收集巨型艾美耳球蟲裂殖子的最佳時(shí)間(圖1)。

2.2 分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的最佳腸段

對(duì)5個(gè)不同腸段中的裂殖子數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，空腸中后段、空腸后段及空回腸交界處裂殖子數(shù)顯著增加(P<0.05)，占整個(gè)腸段裂殖子總數(shù)的62%(圖2)。這表明在感染后84 h，較多的裂殖子寄生在空腸后段。

2.3 DEAE-52纖維素柱層析純化過程中巨型艾美耳球蟲裂殖子數(shù)變化

從第1管開始依次收集到第30管，收集到的裂殖子先增后減(圖3)。從第3管開始，收集的裂殖子數(shù)呈明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，第15管收集液中裂殖子數(shù)達(dá)到最高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。第22管后裂殖子數(shù)明顯降低，到第24管下降至較低水平。60 mL含裂殖子的洗脫液經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析純化后，共收集到約4.48×108個(gè)裂殖子，收集率為69%。1管到22管中收集的裂殖子數(shù)達(dá)到收集總數(shù)的92%。最終獲得44 mL純凈的裂殖子。

3 討 論

此前，研究者多選擇柔嫩艾美耳球蟲和毒害艾美耳球蟲的第2代裂殖子進(jìn)行分離純化。然而，目前關(guān)于巨型艾美耳球蟲裂殖生殖代數(shù)和發(fā)生時(shí)間仍然存在爭(zhēng)議。TYZZER[11]、LONG[12]、BHATIA和PANDE[13]早先對(duì)巨型艾美耳球蟲裂殖子內(nèi)生性發(fā)育進(jìn)行研究，認(rèn)為只有1代裂殖子。同時(shí)，有學(xué)者認(rèn)為發(fā)生2代裂殖生殖[3]；CHALLEY和JOHNSON[14]觀察到第1代裂殖體于感染后48 h產(chǎn)生，72 h后出現(xiàn)第2代裂殖體。MILLARD等[15]認(rèn)為有3代裂殖生殖，第1代發(fā)生在感染后24～48 h，第2代于感染后48～72 h進(jìn)行，第3代裂殖子產(chǎn)生于感染后72～96 h。MCDONALD[16]認(rèn)為至少有4代裂殖子，而DUBEY和JENKINS[5]甚至觀察到5代裂殖生殖。吳力力等[17]對(duì)2株巨型艾美耳球蟲蟲株進(jìn)行內(nèi)生發(fā)育比較，觀察到上海株和揚(yáng)州株都有3代裂殖生殖，并且第3代裂殖體出現(xiàn)在感染后88～104 h，但內(nèi)生發(fā)育階段所出現(xiàn)的具體時(shí)間有差異。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染后84 h收集的裂殖子最多，顯示84～88 h為裂殖子產(chǎn)生的高峰(圖1)。根據(jù)文獻(xiàn)，推斷該時(shí)間所收集的裂殖子可能為第3代裂殖子。在感染后96～120 h能觀察到形狀較大，更為成熟的裂殖子，這可能是第3代裂殖子進(jìn)一步發(fā)育。此外，感染后92 h裂殖子數(shù)明顯下降，考慮是由于內(nèi)生發(fā)育的無性生殖階段結(jié)束，不再進(jìn)行裂殖生殖，開始進(jìn)入有性生殖階段。

較多文獻(xiàn)記載巨型艾美耳球蟲寄生于小腸中段，但不同文獻(xiàn)對(duì)具體寄生位置的描述略有差異。SCHWARZ等[18]于十二指腸尾端到卵黃蒂的腸段中分離裂殖子。吳力力等[17]觀察到第1代和第2代裂殖子寄生于十二指腸1/2回折處到卵黃蒂前10 cm處，第3代裂殖子寄生于十二指腸到卵黃蒂后5 cm處。這表明巨型艾美耳球蟲在內(nèi)生發(fā)育過程中有向小腸后段移動(dòng)的趨勢(shì)。本試驗(yàn)于空腸后端收集到數(shù)量較多的裂殖子，這與DUBEY和JENKINS[5]研究結(jié)論一致，即巨型艾美耳球蟲在空腸內(nèi)的寄生率最高。由于分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的腸段較長(zhǎng)，所刮取腸黏膜的組織和雜質(zhì)較多，為減少分離和純化過程中的雜質(zhì)總量，推薦收集卵黃蒂前后5～8 cm處的裂殖子。

DEAE-52纖維素純化裂殖子的原理是在特定pH條件下，通過離子吸附作用吸附洗脫液中的組織細(xì)胞和雜質(zhì)，而蟲體由于其運(yùn)動(dòng)性將從纖維素篩網(wǎng)孔中掙脫并游離出來[9]。隨著層析的時(shí)間增加，一方面，層析柱中的雜質(zhì)增多將影響蟲體向下游動(dòng)；另一方面，較多的雜質(zhì)包裹在層析劑外將降低層析柱吸附能力，導(dǎo)致雜質(zhì)和蟲體一起隨洗脫液流出，影響裂殖子的純度。本試驗(yàn)純化過程中收集的裂殖子數(shù)量會(huì)受到洗脫液中雜質(zhì)濃度、層析劑吸附力和蟲體活力的影響，這反應(yīng)在洗脫曲線的變化和波動(dòng)中(圖3)。從第23管開始，鏡下觀察到收集液中的雜質(zhì)增多?；?管到22管收集了92%的裂殖子，建議在收集44 mL洗脫液以后停止收集，以免雜質(zhì)隨洗脫液流出。若出現(xiàn)紅細(xì)胞和雜質(zhì)，可回收并清洗DEAE-52纖維素并進(jìn)行第2次層析過濾[9]。

球蟲的分子生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)等研究都對(duì)裂殖子純度要求較高，如建立2代裂殖子cDNA文庫(kù)、mRNA差異顯示；通過裂殖子提取相關(guān)蛋白并篩選抗原，研制抗球蟲疫苗；以及利用裂殖子入侵細(xì)胞以研究對(duì)球蟲與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。本研究確定分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的時(shí)間和部位，并基于已有文獻(xiàn)和方法通過DEAE-52纖維素柱層析對(duì)裂殖子進(jìn)行純化，確定收集較高純度巨型艾美耳球蟲裂殖子洗脫液的最佳時(shí)間，為分離和純化巨型艾美耳球蟲裂殖子提供參考。文獻(xiàn)表明，不同巨型艾美耳球蟲蟲株的潛隱期、裂殖子代數(shù)及內(nèi)生發(fā)育具有一定的差異，因此，分離巨型艾美耳球蟲裂殖子的時(shí)間和部位需要根據(jù)試驗(yàn)所用的具體蟲株確定。