布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法的建立

巫秀紅，劉慶斌，張永紅，郭俊林，張 瑋*，崔德鳳*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206； 2.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102609)

布魯氏菌病，簡稱布病或馬耳他熱，是中國的二類動(dòng)物疫病之一，是由布魯氏菌(Brucella)引起的人獸共患病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為B類動(dòng)物疫病。布魯氏菌主要分為6個(gè)種屬：羊種布魯氏菌、牛流產(chǎn)布魯氏菌、豬種布魯氏菌、犬種布魯氏菌、綿羊附睪布魯氏菌和沙林鼠布魯氏菌[1-2]，其中以羊種布魯氏菌病最為常見。臨床主要特征是波狀熱、不育不孕、慢性感染、公畜睪丸炎和母畜流產(chǎn)等[3]。近年來，中國多地報(bào)道布魯氏菌病呈反彈趨勢(shì)，根據(jù)《國家布魯氏菌中長期規(guī)劃(2016—2020年)》要求，本研究致力于建立一種靈敏、特異、準(zhǔn)確的布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，為布魯氏菌病臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

該試驗(yàn)已通過北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心福利與倫理審查，編號(hào)為ACDC2019052001。所有操作均在北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 牛種布魯氏菌2308株核酸、羊種布魯氏菌16M株核酸、豬種布魯氏菌S2株核酸、犬種布魯氏菌6166株核酸、致病性大腸桿菌、志賀氏菌、金葡萄球菌、豬鏈球菌由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室留存；莫氏耶爾森菌16197、豬霍亂沙門氏菌186354購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；腸炎沙門氏菌3949、鼠傷寒沙門氏菌14028、單增李斯特菌1599、奇異變形菌1969購買于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 儀器設(shè)備 賽默飛世爾科技有限公司的熒光定量PCR儀Quant Studio7 Flex；天根生化科技(北京)有限公司的TGuide S32全自動(dòng)核酸提取儀；Quawell Q9000超微量核酸測定儀。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 通過GenBank搜索布魯氏菌6個(gè)種屬外膜蛋白(outer membrane protein, Omp) 25基因片段并通過BLAST進(jìn)行比對(duì)，最終確立登錄號(hào)為NO. U33003的Omp 25基因序列。利用Primer Express v 3.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增片段大小為90 bp的引物和探針。引物序列Omp 25-F為5′-GAAGTCAAGCAGGGCTTTGAAG-3′，Omp 25-R為5′-ACGGCATAACCGGGTTCAG-3′；探針序列為5′-(FAM)CTCGCTGCGTGCCCGCGT(BHQ1)-3′。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50 μL：2×Taq Master Mix為25 μL、模板5 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL，雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min，94 ℃ 40 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 通過比對(duì)外膜蛋白(outer membrane protein, Omp)基因保守序列，設(shè)計(jì)合成一段3 272 bp的Omp 25質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用超微量核酸測定儀測得質(zhì)粒為4 ng/μL，并通過公式計(jì)算得出Omp 25質(zhì)?？截悢?shù)約為1.12×109copies/μL。

1.2.3 樣本DNA提取與制備 對(duì)腸炎沙門氏菌3949、鼠傷寒沙門氏菌14028、單增李斯特菌1599、志賀氏菌、金葡萄球菌、豬鏈球菌、奇異變形菌1969、莫氏耶爾森菌16197、豬霍亂沙門氏菌186354、致病性大腸桿菌進(jìn)行菌株培養(yǎng)，獲得菌落并制成菌懸液，按照天根生化科技(北京)有限公司的DNA磁珠快速提取試劑盒推薦步驟進(jìn)行提取，提取產(chǎn)物-20 ℃冰箱保存。

1.2.4 引物濃度的優(yōu)化 上游引物和下游引物濃度為80、120、160、200、240、280、320、360和400 nmol/L，9個(gè)濃度梯度。探針濃度保持在250 nmol/L，每個(gè)濃度梯度5個(gè)平行。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。對(duì)所得的每個(gè)濃度循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)的平均值進(jìn)行比較，以產(chǎn)生Ct值的平均值最小和Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviations，SD)綜合指數(shù)最小為依據(jù)對(duì)引物濃度進(jìn)行選擇。

1.2.5 探針濃度的優(yōu)化 探針濃度為100、150、200、250、300、350、400、450和500 nmol/L，9個(gè)濃度梯度。引物濃度保持在280 nmol/L，每個(gè)濃度梯度5個(gè)平行。反應(yīng)參數(shù)和最佳濃度選擇同“1.2.4”引物濃度優(yōu)化選擇條件。

1.2.6 退火溫度的優(yōu)化 選擇優(yōu)化后的引物濃度和探針濃度，選取55、56、57、58、59、60、61、62 ℃退火溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)溫度3個(gè)平行。反應(yīng)參數(shù)和最佳退火溫度同“1.2.4”引物濃度優(yōu)化選擇條件。

1.2.7 熒光定量PCR反應(yīng)條件 布魯氏菌熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：2×real-time PCR Mix 10 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL、探針0.5 μL、模板2 μL、ddH2O為5.9 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，61 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。退火溫度61 ℃時(shí)檢測熒光信號(hào)，選用FAM通道。

1.2.8 特異性驗(yàn)證試驗(yàn) 以豬種布魯氏菌S2株核酸為試驗(yàn)組，無菌去離子水為對(duì)照組，對(duì)腸炎沙門氏菌3949、鼠傷寒沙門氏菌14028、單增李斯特菌1599、志賀氏菌、金葡萄球菌、豬鏈球菌、奇異變形菌1969、莫氏耶爾森菌16197、豬霍亂沙門氏菌186354、致病性大腸桿菌進(jìn)行特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.9 靈敏度試驗(yàn)評(píng)價(jià) 對(duì)Omp 25質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，制得10個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)稀釋度5個(gè)平行，進(jìn)行靈敏度驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.10 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以質(zhì)粒為模板，5個(gè)質(zhì)粒稀釋度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，進(jìn)行熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備，每個(gè)稀釋度5個(gè)平行，取各個(gè)稀釋度的質(zhì)粒模板2 μL。動(dòng)力學(xué)曲線由每個(gè)質(zhì)粒稀釋度對(duì)數(shù)值與其對(duì)應(yīng)的Ct值的平均值繪制得到，通過計(jì)算得出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.11 重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià) 以10-2、10-3、10-4的質(zhì)粒溶液進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度3個(gè)平行，根據(jù)3個(gè)稀釋度的Ct值進(jìn)行變異系數(shù)計(jì)算，確定重復(fù)性。

1.3 臨床樣品的檢測

取已知臨床背景的34份牛全血樣品，樣品來自北京市某牛場，經(jīng)滅活處理后保存在北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，所有操作均在北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。用所建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測，同時(shí)與常規(guī)PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較，對(duì)檢出率進(jìn)行差異分析。

2 結(jié) 果

2.1 引物驗(yàn)證

以O(shè)mp 25質(zhì)粒和豬種布魯氏菌S2株核酸為模板，用引物Omp 25-F與Omp 25-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果與預(yù)期大小一致，目的片段90 bp，無雜帶(圖1)。說明設(shè)計(jì)的引物可作為檢測布魯氏菌的特異性引物。

2.2 引物濃度優(yōu)化

引物濃度優(yōu)化結(jié)果見圖2。通過比較Ct值的平均值和Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小的綜合指數(shù)，發(fā)現(xiàn)280 nmol/L試驗(yàn)組的擴(kuò)增曲線要優(yōu)于其他試驗(yàn)組的擴(kuò)增曲線，所以選擇最佳引物濃度為280 nmol/L。

2.3 探針濃度優(yōu)化

探針濃度優(yōu)化結(jié)果見圖3。250 nmol/L的Ct值和Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差綜合指數(shù)最小，擴(kuò)增曲線要優(yōu)于其他試驗(yàn)組的擴(kuò)增曲線，因此選擇最佳探針濃度為250 nmol/L。

2.4 退火溫度優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化結(jié)果見表1，依據(jù)Ct值和Ct標(biāo)準(zhǔn)偏差值，退火溫度61 ℃時(shí)綜合指數(shù)最高，所以最佳退火溫度為61 ℃。

表1 退火溫度優(yōu)化數(shù)據(jù)Tab.1 Annealing temperature optimization data

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。相關(guān)系數(shù)R2=0.994，擴(kuò)增效率99.73%，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，循環(huán)閾值與質(zhì)?？截悢?shù)的常用對(duì)數(shù)關(guān)系為Y=-3.481x+41.319。

2.6 特異性試驗(yàn)

除豬種布魯氏菌S2株核酸有較好的熒光擴(kuò)增曲線外，腸炎沙門氏菌3949、鼠傷寒沙門氏菌14028、單增李斯特菌1599、志賀氏菌、金葡萄球菌、豬鏈球菌、奇異變形菌1969、莫氏耶爾森菌16197、豬霍亂沙門氏菌186354、致病性大腸桿菌均無熒光擴(kuò)增曲線(圖5)，說明該方法具有良好的特異性。

2.7 靈敏度試驗(yàn)

對(duì)Omp 25質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10，結(jié)果見圖6。質(zhì)粒稀釋度為10-7時(shí)仍有熒光信號(hào)，即檢測方法的最低檢測限約為100 copies/μL。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

對(duì)Omp 25質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，質(zhì)粒在10-2、10-3、10-4下進(jìn)行3次試驗(yàn)，結(jié)果見表2。3次試驗(yàn)的變異系數(shù)分別為0.72%、0.53%、0.14%，變異系數(shù)均小于1%，即建立的熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Analysis of repeatability test results

2.9 臨床樣品檢測

用所建立的熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法對(duì)已知臨床背景的34份牛全血樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR檢測出陽性17份，陰性17份，陽性率50%；常規(guī)PCR檢測出陽性15份，陽性率44%，兩者之間差異不顯著。

3 討 論

布魯氏菌病是一種呈世界性流行的傳染病，該病給畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，超過170個(gè)國家有布魯氏菌病報(bào)道，主要流行地區(qū)在歐洲東部及南部地區(qū)、中南美洲地區(qū)、亞洲及非洲部分地區(qū)[4]。在中國布魯氏菌病呈地方性流行，治療難度較高，目前臨床上對(duì)布魯氏菌病仍沒有特效的治療措施，對(duì)于這種傳染性疾病主要采取以預(yù)防為主的防治措施[5-6]。通過2016年全國家畜布魯氏菌病監(jiān)測數(shù)據(jù)分析，中國家畜布魯氏菌病群陽性率高地區(qū)主要在北方，流行面廣；群內(nèi)陽性率高地區(qū)主要在南方，呈爆發(fā)流行；已免疫的地區(qū)(如內(nèi)蒙古)，群內(nèi)陽性率較低，呈免疫抑制感染傳播。建立一種快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高的布魯氏菌檢測方法對(duì)于病原的流行病學(xué)、防控及風(fēng)險(xiǎn)分析具有重要意義[7]。

目前中國常用檢測布魯氏菌的方法主要有三類：一是細(xì)菌分離鑒定，被認(rèn)為是檢測布魯氏菌病最可靠的方法，但需要進(jìn)行布魯氏菌的分離培養(yǎng)，細(xì)菌分離培養(yǎng)耗時(shí)長，技術(shù)較復(fù)雜，檢出率低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測條件要求較高，存在相應(yīng)的生物安全隱患。二是血清學(xué)檢測，主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等。凝集試驗(yàn)存在敏感性差、特異性不強(qiáng)、操作繁多等缺點(diǎn)，易受人為判斷主觀意識(shí)的影響，需要通過其他方法輔助才能確診[8]；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)對(duì)檢測人員能力要求高并且需要在體內(nèi)產(chǎn)生抗體后才能檢測出來，不能排除潛伏期的帶菌動(dòng)物；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主要用于布魯氏菌病的監(jiān)測，不能有效區(qū)分免疫抗體與野毒感染抗體，存在假陽性、在確診布魯氏菌病方面存在嚴(yán)重不足[9-10]。三是分子生物學(xué)檢測，如熒光定量PCR檢測方法以其特異、靈敏、省時(shí)省力、安全等優(yōu)點(diǎn)，在布魯氏菌鑒定方面逐漸被廣泛應(yīng)用[11]。

本研究根據(jù)布魯氏菌保守基因Omp 25片段，設(shè)計(jì)引物、合成探針，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立一套布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法，與腸炎沙門氏菌3949、鼠傷寒沙門氏菌14028、致病性大腸桿菌、莫氏耶爾森菌16197、單增李斯特菌1599、志賀氏菌、奇異變形菌1969、金葡萄球菌、豬鏈球菌、豬霍亂沙門氏菌186354等高同源性菌株均無交叉，特異性良好。

本檢測方法采用Taqman水解探針技術(shù)，相對(duì)于SYBR Green Ⅰ熒光染料特異度更好，與張愛萍等[12]建立的熒光定量PCR檢測方法相比較，SYBR Green Ⅰ熒光染料特異性95.4%低于本試驗(yàn)的特異性100%。

本檢測方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線3個(gè)參數(shù)均符合標(biāo)準(zhǔn)：擴(kuò)增效率99.73%，決定系數(shù)R2=0.994以及ΔCt值變異系數(shù)均小于1%，最低檢測限約為100 copies/μL微量樣品級(jí)別并且重復(fù)3次試驗(yàn)變異系數(shù)均小于1%，說明本試驗(yàn)建立的方法具有較好的檢測靈敏度和重復(fù)性。相對(duì)于常規(guī)PCR，如HUBER等[13]，徐軍等[14]建立的PCR檢測方法，其靈敏度均低于本試驗(yàn)的靈敏度，同時(shí)常規(guī)PCR檢測耗時(shí)、染料毒性、易有氣溶膠污染等問題。本檢測方法不受其他理化因素的影響，相對(duì)普通PCR操作簡單，耗時(shí)少，減少操作中病原體的接觸，有效降低生物安全風(fēng)險(xiǎn)，且可同時(shí)進(jìn)行大批量檢測。對(duì)于布魯氏菌病早期診斷、疫病篩查、疫情監(jiān)測、探索和研究其流行規(guī)律和流行特點(diǎn)以及根據(jù)檢測數(shù)據(jù)制定合理有效的防治對(duì)策具有重要意義。同時(shí)，為實(shí)驗(yàn)室檢測、診斷提供相對(duì)安全、快速、便捷的技術(shù)支持，為臨床檢測提供新興檢測手段，具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。