液質(zhì)聯(lián)用儀測定血液中溴敵隆不確定度的評定

董銀利 顧宗珍 史巖

1.新疆恒正司法鑒定中心 新疆烏魯木齊 830000；2.新疆晶碩新材料有限公司 新疆烏魯木齊 830000

測量的目的是為了確定被測量的量值。測量結(jié)果的品質(zhì)是量度測量結(jié)果可信程度的重要的依據(jù)。測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于不確定的大小[1]。所以，測量結(jié)果表述必須同時包含賦予被測量的值及與該值相關(guān)的測量不確定度，才是完整并有意義的。早在七十年代初，國際上已有越來越多的計量學者認識到使用不確定度代替誤差更為科學，從此，不確定度這個術(shù)語逐漸在測量領(lǐng)域內(nèi)被廣泛應(yīng)用。1993年制定《測量不確定度表示指南》得到了BIPM 、OIML、ISO、IEC、IUPAC、IUPAP、IFCC七個國際組織批準，由ISO出版，是國際組織的重要權(quán)威文獻。中國已于1999年頒布了與之兼容的測量不確定評定與表示計量技術(shù)規(guī)范。至此，測量不確定的評定成為檢測和校準實驗室必不可少的工作之一。在質(zhì)量管理體系中，測量不確定都是重點管理范疇。在司法鑒定毒化分析、環(huán)境檢測分析過程中，不確定度的是分析工作者需要掌握的技能。

在司法鑒定、環(huán)境檢測中有很多檢測項目需要使用大型儀器分析，現(xiàn)就司法鑒定工作中，利用LC/MS/MS檢驗血液中溴敵隆含量的實例評定不確定。本文參考《血液中溴敵隆等13種抗凝血殺鼠藥的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗方法》（SF/Z JD0107018-2018）[2],將該方法引入到實驗室，測定血液中溴敵隆含量，分析了測定血液中溴敵隆含量的步驟和方法帶來的不確定度，并對測量溴敵隆含量不確定度進行評定。

1 不確定度評定基礎(chǔ)

1.1 不確定度評定的依據(jù)

《測量不確定度評定與表示》JJF 1059.1-2012

ISO/IEC GUIDE 98-3:2008 Uncertainty of measurement-Part3:《Guide to the expression of uncertainty in measurement》

1.2 導致不確定度的因素

產(chǎn)生不確定度的因素：被測量的定義不完整，測量方法不理想，取樣代表性不夠，對環(huán)境因素認識不當或測量、控制不完善，對模擬儀表的人為讀數(shù)偏差，測量儀表的計量性能存在局限性，測量標準、標準物質(zhì)具有不確定度，測量方法、程序的近似和假設(shè)，相同條件下被測量在重復(fù)觀測中的變化。

1.3 測量不確定度的主要來源

測量數(shù)據(jù)的分散性，計量器具不準，使用不準確的參數(shù)、系數(shù)，測量中環(huán)境條件的“顯著”變化，一些標準規(guī)定結(jié)果y必須取整，個別測量過程在數(shù)學模型中沒有體現(xiàn)等都是不確定度的來源，所以在評估不確定度前必須透徹的了解測量過程，否則會漏掉應(yīng)有的不確定度分量[3]。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國賽默飛TSQ Vantage；液相色譜柱:C18；溴敵敵隆標準溶液：證書編號為901010JJ的溴敵隆標準溶液，1mg/mL，U=2%，k=2。

2.2 測定方法

2.2.1 案件樣品

取血液1mL，加入乙酸乙酯3mL,渦旋混合，以2500r/min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入3mL乙酸乙酯，重復(fù)提取一次，合并有機相，于60℃水浴空氣流下吹干，殘留物用100μL甲醇復(fù)溶，供儀器分析[4]。

2.2.2 控制樣品

取空白血液1mL兩份，一份作為空白樣品，一份添加溴敵隆或其他可疑鼠藥標準工作溶液作為2ng/mL添加樣品，余下步驟同2.2.1，與案件樣品同時操作。測量流程如圖1所示。

圖1 測量流程圖

2.3 數(shù)學模型的建立

以外標-單點校正法進行定量，根據(jù)案件樣品和添加樣品中目標物的峰面積值，按公式計算出目標物的含量。

式中：C為待測樣品中毒（藥）物質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；A為待測樣品中毒（藥）物的峰面積；A為添加樣品中毒（藥）物的峰面積；C為添加樣品中毒（藥）物的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）。

2.4 不確定度來源分析

結(jié)合樣品的處理過程和儀器測定過程，分析測量不確定度主要有以下來源：樣品取樣隨機性和在移取樣品時用到移液器，其測量的隨機誤差構(gòu)成樣品取樣量的不確定度；用來校準位置濃度的添加樣品的不確定度；定容體積引入的不確定度；提取、濃縮、轉(zhuǎn)移過程的誤差；儀器精密度和重復(fù)性引入的不確定度[5]；標準溶液配制引入的不確定度；LC/MS/MS儀器測定及校準引入的不確定度。

3 不確定度評定

計算不確定度分量：

不確定度分量可分為A類和B類。A類不確定度是由統(tǒng)計確定的標準不確定度分量，以平均值的實驗標準偏差表征。B類不確定度分量是用非統(tǒng)計方法確定的標準不確定度分量[6]。

（1）前處理操作過程引入的不確定度：

依據(jù)所述方法，對加標樣品做6次前處理重復(fù)實驗，6次平行實驗結(jié)果為：10.15ng/mL、9.66ng/mL、9.95ng/mL、9.73ng/mL、10.02ng/mL、10.13ng/mL，測量結(jié)果的平均值9.94ng/mL，測定結(jié)果重復(fù)性的相對標準偏差為：srel=0.02058。標準中規(guī)定以平行雙樣均值作為測量結(jié)果[7]，則重復(fù)性相對不確定度等于平均值標準差，由前處理操作過程引入重復(fù)性不確定度：

（2）LC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀測量引入的不確定度：

液質(zhì)聯(lián)用儀測量引入的不確定度可根據(jù)液質(zhì)聯(lián)用儀校準證書提供：U=5%,k=2，液質(zhì)聯(lián)用儀測量引入的相對不確定度為：

（3）標準溶液配制引入的不確定度u3rel：

標準工作溶液配制過程使用1000μL移液器2次、10μL移液器1次、1μL移液器1次，1000μL移液器檢定重復(fù)誤差為2.0%，10μL移液器檢定重復(fù)誤差為8.0%，1μL移液器檢定重復(fù)誤差為12.0%，標準溶液配制引入的合成標準不確定度為[8]：

（4）標準溶液帶來的不確定度u4rel：

證書編號為901010JJ的溴敵隆標準溶液，1mg/mL，U=2%，k=2。

（5）樣品及校準溶液峰面積比產(chǎn)生的不確定度u5rel、u6rel：

樣品及校準品的峰面積自動積分，有效數(shù)字為9位數(shù)，由最后一位數(shù)字帶來的誤差極小，可以忽略不計。

（6）合成標準不確定度的計算：

表1 標準不確定度分量

（7）計算擴展不確定度：

擴展不確定度是確定測量結(jié)果區(qū)間的量，合理賦予被測量之值分布的大部分可望含于此區(qū)間。擴展不確定度Ur是在合成不確定度擴展了k倍得到的，即Ur=kuc，k為包含因子。k值一般取2或3，在大多數(shù)情況下取k=2（置信概率為95%），即U=2×0.33=0.66ng/mL[9]。

4 結(jié)果

用國家標準方法SF/Z JD0107018-2018，測定溴敵隆含量為2.35ng/mL時，該血液樣本中溴敵隆測定結(jié)果應(yīng)表述為C=（2.35±0.66）ng/mL，k=2[10]。

5 結(jié)語

對溴敵隆測量結(jié)果不確定度貢獻較大的分量有標準溶液配制過程、液質(zhì)聯(lián)用儀測量引入和前處理過程引入的不確定度。在不確定度評定過程按照找全分量、統(tǒng)一、轉(zhuǎn)換、合成和擴展五個步驟評定，會讓不確定度評定工作順利完成。