常溫小麥揮發(fā)物及其對銹赤扁谷盜引誘率和觸角電位影響的研究

肖惠惠，曾芳芳，王殿軒*，黃依林，白春啟，趙 超，唐培安

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，糧食儲藏與安全教育部工程研究中心，糧食儲運國家工程實驗室，河南 鄭州 450001 2.江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023

害蟲對物質(zhì)氣味的反應(yīng)及行為既關(guān)系到儲糧昆蟲化學(xué)生態(tài)行為表現(xiàn)，也關(guān)系到儲藏物料對害蟲易感染物質(zhì)和害蟲綜合治理中一些特性物質(zhì)的利用。碎小麥中二氯甲烷提取物對玉米象、鋸谷盜、赤擬谷盜、銹赤扁谷盜有引誘作用[1]，燕麥揮發(fā)物對鋸谷盜和大眼鋸谷盜有很強的引誘作用[2]，80 ℃時玉米、小麥和稻谷的揮發(fā)物2-乙基己醇、(+)-δ-蓽澄茄烯、胡椒酮和檸檬烯對米象和玉米象有不同程度的定向引誘作用[3]，但天堂椒揮發(fā)物對米象有驅(qū)避作用[4]。65 ℃時全麥粉、黃豆粉、玉米粉、蕎麥粉、小米粉和高粱粉的萃取揮發(fā)物可顯著引誘長頭谷盜雌、雄成蟲[5]。三七、當歸、天麻和前胡等中藥材的揮發(fā)物對藥材甲引誘作用明顯[6]。高溫下儲藏物糧食的揮發(fā)物對害蟲具有引誘作用，同種谷物對不同害蟲的引誘作用也存在差異。常溫下谷物中揮發(fā)物種類與數(shù)量顯著減少，對害蟲的引誘影響程度也不相同[7]。銹赤扁谷盜(Cryptolestesferrugineus(Stephens))是一種世界性發(fā)生的常見儲糧害蟲，其成蟲和幼蟲均可危害破碎谷物、豆類、油料等，當種群密度較大時易引起儲糧發(fā)熱霉變，甚至嚴重影響糧食安全儲藏，造成經(jīng)濟和糧食質(zhì)量損失[8-13]。當前通常采用化學(xué)方法防治此類害蟲，銹赤扁谷盜對常用熏蒸劑磷化氫的抗藥性普遍且嚴重[14-16]，采集于山西省呂梁地區(qū)的銹赤扁谷盜品系抗性系數(shù)為敏感品系的668倍[14]，采集于湖北省麻城地區(qū)銹赤扁谷盜品系的抗性比敏感品系高838倍[17]。銹赤扁谷盜的熏蒸難度遠高于其他害蟲[18]，由此導(dǎo)致熏蒸失敗的案例常有發(fā)生[19]。

昆蟲可通過其嗅覺感知食物從而做出行為反應(yīng)[2]，利用昆蟲選擇取食或產(chǎn)卵場所等習(xí)性，研究儲藏物糧食中的揮發(fā)性引誘物有望用于誘捕、防治害蟲來降低和控制害蟲種群密度，減少化學(xué)藥劑使用。有些儲藏物甲蟲對食物揮發(fā)物的趨向性反應(yīng)已有報道，但關(guān)于銹赤扁谷盜對食物揮發(fā)物的電生理反應(yīng)的研究缺乏。作者研究了常溫下不同破碎程度小麥的揮發(fā)性物質(zhì)成分與相對含量，并研究了銹赤扁谷盜對相對含量較高物質(zhì)的觸角電位反應(yīng)，以期為分析和明確該害蟲的有效引誘物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

試驗所用銹赤扁谷盜采自河南新鄉(xiāng)某糧庫中，在河南工業(yè)大學(xué)昆蟲培養(yǎng)室中培養(yǎng)數(shù)代，培養(yǎng)條件為(28±1) ℃，RH75%±5%，全黑暗，喂食全麥粉∶燕麥∶酵母∶碎麥質(zhì)量比為5∶3∶1∶1的飼料。以羽化2周銹赤扁谷盜成蟲為試蟲。

1.2 樣品

采用的小麥為當年收獲的新麥品種208，水分含量12.5%，以完整小麥、破碎小麥和全麥粉為試驗材料，碎小麥為粉碎后過直徑為2.0 cm和1.5 cm 篩的中間分離物，全麥粉采用錘式旋風磨將其粉碎成粉末狀態(tài)。備好的材料裝入干凈自封袋中放入-20 ℃冰箱1個月以消除其中可能的昆蟲感染，試驗前平衡至室溫。

1.3 主要試劑

石蠟油(標準品)、反式-2-癸烯醛(純度>93%)：北京百威靈科技有限公司；檸檬烯(純度≥97%)、正己醇(純度≥99%)、1-辛烯-3醇(純度≥98%)、壬醛(純度≥98%)、戊醛(純度≥97%)、辛醛(純度≥99%)、庚醛(純度≥99%)：Sigma-Aldrich。

1.4 儀器與設(shè)備

BLH-5601錘式旋風磨：浙江伯利恒儀器設(shè)備有限公司；QP2010氣相色譜儀：日本島津有限公司；DG8W顯微鏡：舜宇儀器有限公司；DGX-8243B電熱鼓風干燥箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；57348-U固相微萃取頭：美國Sigma-Aldrich集團有限公司；Y型嗅覺儀：鄭州晶林科技有限公司；FW135植物微型粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；ACO-318氣體循環(huán)氣泵：廣東海利集團有限公司；FCD-217SE冰箱：海爾電冰柜有限公司；SHP-350生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司。

1.5 揮發(fā)物成分測定

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)技術(shù)結(jié)合氣相-質(zhì)譜法(GC-MS)對樣品的揮發(fā)物成分進行測定。 稱取10.00 g樣品于60 mL的頂空萃取瓶中，加緊瓶蓋后于(28±1) ℃下平衡24 h，再將萃取頭插入頂空瓶中萃取30 min，于GC-MS進樣口250 ℃下解析2 min。分析中色譜柱為DB-5MS石英毛細管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm，Agilent)。進樣口溫度250 ℃，不分流，色譜柱起始溫度50 ℃，以4 ℃/min升溫至125 ℃，保持3 min，又以4 ℃/min升溫至165 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。載氣采用高純度氦氣，柱壓為87 kPa。不分流進樣2 min，柱流量1.5 mL/min。接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃；電離方式為EI，電離能量70 eV，掃描范圍m/z35～350 amu；采用全掃描采集模式。

1.6 選擇反應(yīng)測定

采用臂長8 cm，內(nèi)徑1 cm，兩臂夾角75°，柄長8 cm的Y型嗅覺儀。每個管臂各接一個特制200 mL的味源瓶，將20 g食料放入味源瓶作為處理，經(jīng)活性炭過濾的凈化空氣作為對照，通過流量計控制氣流速率為200 mL/min，管柄接真空泵。試驗環(huán)境為 (28±1) ℃、RH60%～70%和全暗光。

逐頭引進饑餓24 h的銹赤扁谷盜雌或雄成蟲于Y型嗅覺儀管柄處，觀測試蟲爬至超過Y型支臂長度的2/3且1 min內(nèi)不返回者記為有選擇反應(yīng)，5 min內(nèi)無選擇者視為不反應(yīng)。雌、雄成蟲各以20頭為1組，共進行3組平行。其中，每測5頭試蟲調(diào)換一次Y型管方向，每測10頭用無水乙醇擦洗管路內(nèi)外壁，完全干燥后再用。試蟲對不同物質(zhì)的選擇反應(yīng)參數(shù)按下式計算。

選擇系數(shù)=(處理臂管中蟲數(shù)-對照臂管中蟲數(shù))/反應(yīng)總蟲數(shù)；

引誘率=處理臂管中蟲數(shù)/總測試蟲數(shù)×100%；

反應(yīng)率=(處理臂管中蟲數(shù)+對照臂管中蟲數(shù))/總測試蟲數(shù)×100%。

%

1.7 銹赤扁谷盜對不同破碎度小麥及其中揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)測定

用解剖刀將銹赤扁谷盜雌或雄成蟲觸角從基部取下，切除末端一節(jié)，用導(dǎo)電膠將其兩端黏合到電極兩端，氣味管口與觸角間距為1 cm。將樣品管的末端連接在觸角電位儀氣體刺激控制裝置上，在測定銹赤扁谷盜對不同破碎度小麥的觸角電位時，以空氣為對照；在測定銹赤扁谷盜對小麥揮發(fā)物的觸角電位時，將檸檬烯、正己醇、壬醛、1-辛烯-3-醇、戊醛、辛醛、庚醛和反式-2-癸烯醛分別用液體石蠟配制成0.1、1.0、10.0 μg/μL 3種不同質(zhì)量濃度的溶液，將10 μL待測揮發(fā)性物質(zhì)滴在寬4 mm、長3 cm濾紙條上，并等待其被濾紙完全吸收，以10 μL石蠟油為對照。每次刺激0.5 s，間隔為60 s。待顯示器上基線穩(wěn)定后給予刺激，測試銹赤扁谷盜對每個樣品的觸角電位反應(yīng)，每個處理測試觸角15根，每個樣品平均刺激3次。將每一個樣品測定值的平均值減去前后2次對照測定值的平均值即得觸角電位反應(yīng)的絕對值。測試的樣品有完整小麥、破碎小麥、全麥粉，以及常溫下小麥中的主要揮發(fā)物。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行整理及χ2檢驗，并采用Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 常溫下小麥揮發(fā)物的種類與相對含量

采用固相微萃取法和氣質(zhì)聯(lián)用法對不同破碎度小麥揮發(fā)物的種類與相對含量進行分析，結(jié)果如表1所示。在常溫下當年收獲新麥品種208的完整小麥、破碎小麥和全麥粉的揮發(fā)物種類分別為17、20、20種，相應(yīng)屬于烷、烯、醛、醇、呋喃5類物質(zhì)，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麥中未檢出，說明小麥破碎或粉碎后其中的揮發(fā)物成分會有所增加，增加的原因應(yīng)為原有種皮封鎖的成分在破碎后得到了釋放，且其也有較高的相對含量。在相對含量變化上，完整小麥所檢測出的揮發(fā)物質(zhì)相對含量在破碎后變化各異。小麥破碎或粉碎后部分物質(zhì)(如壬醛、2, 4-二甲基-庚烷等)相對含量升高，其可能主要原因為籽粒破碎后空間開放更多，物質(zhì)揮發(fā)也更多所致。破碎后相對含量減小者則應(yīng)為其總體含量相對穩(wěn)定，破碎后總體物質(zhì)增加導(dǎo)致其相對含量減小。

表1 不同破碎度小麥揮發(fā)物成分及相對含量
Table 1 Relative content of volatile components in different degrees of broken wheat

2.2 銹赤扁谷盜對不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)

銹赤扁谷盜雌、雄成蟲對不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)如表2所示，在Y型嗅覺儀環(huán)境下，試蟲對不同破碎程度小麥表現(xiàn)出不同選擇行為，小麥破碎度大，相應(yīng)的選擇系數(shù)也大，說明小麥破碎程度增大會加大害蟲對其揮發(fā)物的選擇，雌蟲對不同破碎度小麥的選擇系數(shù)最大差值達0.20。同樣，小麥對害蟲的引誘率和反應(yīng)率也隨小麥破碎度增大而顯著增加，雌蟲對不同破碎度小麥的引誘率最大差值達0.12，反應(yīng)率最大差值達0.06。小麥破碎后揮發(fā)物種類的增加或某些揮發(fā)物含量的增加增大了對試蟲的引誘作用，相應(yīng)地反應(yīng)率也增大。比較雌、雄蟲對小麥選擇反應(yīng)可見，銹赤扁谷盜同樣破碎狀態(tài)引誘率和反應(yīng)率均為雌蟲略大于雄蟲，即銹赤扁谷盜雌蟲更易受到小麥揮發(fā)物引誘。

表2 銹赤扁谷盜雌、雄成蟲對不同破碎度小麥的選擇反應(yīng)Table 2 Selective responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.3 銹赤扁谷盜對不同破碎度小麥的觸角電位反應(yīng)值

圖1顯示，小麥從完整籽粒至全麥粉的破碎度變化使得銹赤扁谷盜雌蟲的觸角電位反應(yīng)值從0.131 mV增加至0.147 mV，雄蟲的(EAG)從0.091 mV增加至0.120 mV。小麥破碎度增大后，其揮發(fā)物質(zhì)種類和數(shù)量增多，相應(yīng)地加大了銹赤扁谷盜觸角電位反應(yīng)值的升高幅度，且同樣情況下雌蟲的觸角電位反應(yīng)值大于雄蟲的。

圖1 銹赤扁谷盜雌、雄成蟲對不同破碎度小麥的觸角電位反應(yīng)Fig.1 EAG responses of females and males of Cryptolestes ferrugineus to different degrees of broken wheat

2.4 銹赤扁谷盜對小麥中主要揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)

選取小麥中相對含量較高的8種主要揮發(fā)性物質(zhì)，檢測了銹赤扁谷盜雌、雄蟲對其不同濃度單品的觸角電位反應(yīng)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，不同小麥揮發(fā)物單品均可以引起銹赤扁谷盜雌、雄成蟲不同程度的觸角電位反應(yīng)，且同一物質(zhì)不同質(zhì)量濃度間的觸角電位反應(yīng)值也不同。在測試的3個質(zhì)量濃度中，銹赤扁谷盜雌蟲對其中檸檬烯、1-辛烯-3-醇，己醛和戊醛的觸角電位反應(yīng)值隨揮發(fā)物質(zhì)量濃度升高沒有相應(yīng)顯著增加；對于正己醇、壬醛、反式-2-癸烯醛和辛醛，隨著揮發(fā)物質(zhì)量濃度的變化，銹赤扁谷盜雌蟲的觸角電位反應(yīng)值也發(fā)生相應(yīng)的變化，當質(zhì)量濃度增加到10.0 μg/μL時銹赤扁谷盜雌蟲對觸角電位反應(yīng)值不再顯著增加。銹赤扁谷盜雄蟲對質(zhì)量濃度為0.1 μg/μL的檸檬烯、己醛和反式-2-癸烯醛觸角電位反應(yīng)值較大，觸角電位反應(yīng)值隨揮發(fā)物質(zhì)量濃度升高沒有相應(yīng)顯著增加；

壬醛和辛醛質(zhì)量濃度為1.0 μg/μL時觸角電位反應(yīng)值顯著高于0.1 μg/μL的，揮發(fā)物質(zhì)量濃度持續(xù)增大到10.0 μg/μL后其觸角電位反應(yīng)值無顯著增加；隨著正己醇和1-辛烯-3醇揮發(fā)物質(zhì)量濃度增加,雄蟲對其觸角電位反應(yīng)值持續(xù)增加，在10.0 μg/μL時顯著高于0.1 μg/μL的。從整體上看，雌蟲對待測物質(zhì)觸角電位反應(yīng)值顯著高于雄蟲。

3 討論

目前關(guān)于小麥揮發(fā)物的研究多有報道，高筋小麥和低筋小麥在75 ℃下采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用檢出揮發(fā)性成分107種[20]，在80 ℃下小麥揮發(fā)物檢測出46種[3]，在75 ℃下從5種小麥粉中測出揮發(fā)物共54種[21]，這些研究在樣品處理上均為高溫下頂空萃取揮發(fā)物質(zhì)，高溫下所得揮發(fā)物種類結(jié)果偏高。谷物的揮發(fā)物與樣品處理溫度有一定關(guān)系[22]，常溫28 ℃下小麥揮發(fā)物只有11種[7]，本研究在常溫28 ℃條件下檢測出完整小麥、破碎小麥和全麥粉的揮發(fā)物種類分別為17、20、20種，進一步說明常溫下小麥的揮發(fā)物種類數(shù)量為10～20種，且小麥破碎程度越高，其揮發(fā)物種類也會有所增加。常溫條件下樣品的揮發(fā)物較少，但常溫更接近實際害蟲發(fā)生的環(huán)境溫度，此條件下利用頂空微萃取法進行取樣和成分分析，結(jié)果對分析引誘害蟲的谷物揮發(fā)物成分更有意義。

結(jié)合銹赤扁谷盜對儲藏谷物感染的習(xí)性，破碎谷物較易于吸引其感染，不同破碎程度對害蟲的引誘作用存在差異[23]。破碎的谷物對米象有較強吸引力，且不同程度的脫殼和破碎度對米象的吸引效果也不同[24]。本研究表明，小麥破碎度增加后不僅對害蟲的引誘作用增強，而且相應(yīng)的觸角電位值也發(fā)生顯著性變化，即破碎程度越高，對害蟲的引誘效果越顯著，觸角電位反應(yīng)也更明顯，可能與其揮發(fā)物關(guān)系更密切。鑒于小麥破碎度高時更易于引誘害蟲，小麥儲藏中應(yīng)盡量減少破碎粒率和不完善粒率。研究表明壬醛、戊醛、庚醛、己酸、1-辛烯-3-醇、異辛醇、3-辛酮等化合物對銹赤扁谷盜具有吸引作用[25-27]，不同破碎度小麥對銹赤扁谷盜表現(xiàn)出不同的引誘效果，可能與其中含有的特有成分有關(guān)，其中2, 4-二甲基-庚烷、3, 3-二甲基-己烷和反式-2-癸烯醛在完整小麥中未檢出。不同谷物的揮發(fā)物在組成和含量上有所不同，從而形成其特定的氣味，這些特定氣味在昆蟲選擇寄主時具有重要行為導(dǎo)向作用。銹赤扁谷盜雌、雄成蟲均對小麥中8種不同濃度揮發(fā)物產(chǎn)生不同程度的電生理反應(yīng)，雌、雄成蟲對待測揮發(fā)物的觸角電位反應(yīng)也存在差異，說明同一揮發(fā)物在不同性別害蟲中可能行使的生理功能也各不相同。銹赤扁谷盜在取食選擇過程中，其行為可能與這些揮發(fā)物有關(guān)，也可能與其協(xié)同效應(yīng)有關(guān)，此類問題有待做進一步的研究。