天蠶素抗菌肽的生物信息學(xué)分析

楊紅艷，盧 奎,2*，杜 蘅，劉廣斌

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001 2.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044 3.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

近年來，隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展，微生物污染引起的食品安全問題和耐藥菌導(dǎo)致的環(huán)境安全問題逐漸成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)。食品在加工、貯藏、運(yùn)輸及消費(fèi)過程中，微生物污染是引起食品腐敗變質(zhì)的主要原因之一[1]。在世界范圍內(nèi)，每年由于微生物污染引發(fā)的食品安全事件頻頻發(fā)生，造成難以估計(jì)的損失。因此，食品防腐劑的使用在食品安全中扮演著重要角色，目前常見的食品防腐劑有山梨酸、苯甲酸及其鹽類等化學(xué)防腐劑[2]，雖然化學(xué)防腐劑的防腐效果穩(wěn)定且價(jià)格低廉，但近年來由于其大規(guī)模使用甚至濫用，消費(fèi)者對(duì)其安全性日益擔(dān)憂。有研究發(fā)現(xiàn)長期過量食用化學(xué)防腐劑會(huì)對(duì)人體造成積累性慢性傷害，甚至帶來致畸、致癌等危害[3-4]。因此，尋找新型安全高效的食品防腐劑已成為食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。

抗菌肽(antimicrobial peptides)，又稱抗微生物肽或宿主防御肽，是自然界生物體內(nèi)廣泛存在的一類分子多肽，是生物先天免疫的重要防御物質(zhì)，普遍具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗寄生蟲及免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5-6]。由于其安全、高效、抑菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、殺菌速度快、無免疫原性、作用機(jī)理獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)，預(yù)示著抗菌肽在食品安全領(lǐng)域有著巨大應(yīng)用潛力[7]?？咕膩碓磸V泛，包括細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物和兩棲類動(dòng)物等[8-9]。昆蟲作為世界上種類最為繁多的生物物種之一，其生活環(huán)境復(fù)雜，遍布于除深海和極地外的每一個(gè)角落，具備較完善的自我防御系統(tǒng)，自身能夠分泌抗菌物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)[10]。迄今為止，在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽達(dá)200余種，占已知抗菌肽總數(shù)的10%左右。天蠶素抗菌肽是最早被發(fā)現(xiàn)的一類抗菌肽，主要是由昆蟲等分泌產(chǎn)生的具有抑菌性能的小分子肽類物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗寄生蟲等生物活性[11-12]。自1972年瑞典科學(xué)家Boman等[13]首先從惜古比天蠶血淋巴中分離得到天蠶素抗菌肽以來，科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)多種天蠶素抗菌肽，其結(jié)構(gòu)特征和基因序列也先后得到確定[14-15]。

生物信息學(xué)是以計(jì)算機(jī)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)，目前已廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)、臨床醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[16]。近年來諸多學(xué)者嘗試將生物信息學(xué)應(yīng)用于抗菌肽的篩選和預(yù)測(cè)，并取得一定的成果。劉悅等[17]利用生物信息學(xué)工具對(duì)東北林蛙抗菌肽dybowskin-1ST的理化參數(shù)、親/疏水性、剪切位點(diǎn)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)及分析，進(jìn)而通過小鼠傷口愈合試驗(yàn)及體外抑菌試驗(yàn)進(jìn)行活性驗(yàn)證。Taniguchi等[18]利用生物信息學(xué)方法從低蛋白大米副產(chǎn)品中鑒定出陽離子抗菌肽，并通過試驗(yàn)驗(yàn)證其抗菌活性。Wang等[19]借助生物信息學(xué)工具對(duì)天蠶素抗菌肽Cecropin-A進(jìn)行改造，獲得抗菌活性更高的抗菌肽PEW300，并對(duì)其抗菌機(jī)制進(jìn)行研究。作者基于抗菌肽數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)9種天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)、氨基酸組成、疏水性、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、磷酸化和糖基化位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以期為深入研究天蠶素抗菌肽的構(gòu)效關(guān)系、抗菌活性和作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為新型抗菌肽的設(shè)計(jì)改造提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取抗菌肽數(shù)據(jù)庫DRAMP(http://dramp.cpu-bioinfor.org/)中的9種天蠶素抗菌肽(Cecropin)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其來源及氨基酸序列如表1所示。

表1 天蠶素抗菌肽的來源及氨基酸序列Table 1 Sources and amino acid sequences of cecropin antimicrobial peptides

1.2 生物信息學(xué)分析方法

所用的生物信息學(xué)分析工具如表2所示。

表2 抗菌肽生物信息學(xué)分析工具Table 2 Bioinformatics analysis tools for the analysis of antimicrobial peptides

2 結(jié)果與分析

2.1 天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)分析

利用SIB維護(hù)的專業(yè)蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)下的蛋白質(zhì)分析工具ProtParam tool對(duì)天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見表3。

從表3可看出，9種天蠶素抗菌肽由31～37個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量較小，大約為3 500 Da，免疫原性較低。9種天蠶素抗菌肽均為陽離子型多肽，理論等電點(diǎn)(pI)在9.52～11.17之間，pH為7時(shí)帶2～7個(gè)正電荷，說明多肽在中性條件下溶解性較好，不易出現(xiàn)凝集和沉淀析出的現(xiàn)象，有利于抗菌肽的分離純化和應(yīng)用。Cecropin-B、Cecropin XJ、Cecropin-P4的不穩(wěn)定指數(shù)大于40，推測(cè)為不穩(wěn)定多肽，其余多肽的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，推測(cè)為穩(wěn)定性多肽。9種抗菌肽的脂肪族指數(shù)均較高，在85.16～114.29之間，推測(cè)其熱穩(wěn)定性較好?？偲骄H水性值(GRAVY)可用來預(yù)測(cè)多肽的親水性強(qiáng)弱，范圍在-2～+2之間，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，負(fù)值越大表示親水性越好。除Cecropin-C外，其余抗菌肽的GRAVY為負(fù)值，表明該抗菌肽呈親水性，這一特性有利于其在以水為溶劑的食品體系中發(fā)揮抗菌活性[20]。

表3 天蠶素抗菌肽的理化性質(zhì)分析Table 3 Physicochemical properties of cecropin antimicrobial peptides

抗菌肽的抗菌活性往往與其理化特性有關(guān)，比如氨基酸組成、肽鏈長度、電荷數(shù)目與分布、空間結(jié)構(gòu)、疏水性和兩親性等[21-23]。一般認(rèn)為，陽離子型抗菌肽具有較好的抗菌活性，抗菌肽首先通過靜電作用吸附聚集在細(xì)菌表面，之后通過桶板模型、覆毯模型或者環(huán)孔模型等方式發(fā)揮抗菌作用[24]。本文中研究的9種天蠶素抗菌肽中含有多個(gè)精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸，使整個(gè)分子帶正電荷，這是天蠶素抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的重要基礎(chǔ)之一。

穩(wěn)定性是抗菌肽應(yīng)用的重要前提條件之一，經(jīng)預(yù)測(cè)，9種天蠶素抗菌肽的熱穩(wěn)定性較好。伍小松等[25]研究表明天蠶素抗菌肽在100 ℃加熱5～15 min仍具有較好的抗菌活性。Kim等[26]從燕尾蝶中分離得到的類天蠶素抗菌肽Papiliocin在100 ℃下加熱10～15 min仍可保持一定的活性，且對(duì)較高離子強(qiáng)度和酸堿具有一定的抗性。以上試驗(yàn)結(jié)果和本文中預(yù)測(cè)的熱穩(wěn)定性結(jié)果基本相符，預(yù)示著天蠶素抗菌肽在食品防腐保鮮方面具有較大的應(yīng)用空間。

2.2 天蠶素抗菌肽的氨基酸組成分析

利用Pepstats工具分析了天蠶素抗菌肽的氨基酸殘基組成，分析結(jié)果見圖1。

極微氨基酸Tiny：(A+C+G+S+T);小側(cè)鏈氨基酸Small：(A+B+C+D+G+N+P+S+T+V);脂肪族氨基酸Aliphatic：(A+I+L+V);芳香族氨基酸Aromatic：(F+H+W+Y);非極性氨基酸Non-polar：(A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y);極性氨基酸Polar：(D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z);帶電荷氨基酸Charged：(B+D+E+H+K+R+Z);堿性氨基酸Basic：(H+K+R);酸性氨基酸Acidic：(B+D+E+Z)圖1 天蠶素抗菌肽的氨基酸組成分析Fig.1 Composition analysis of amino acids of cecropin antimicrobial peptides

從圖1可看出，9種天蠶素抗菌肽中非極性氨基酸殘基物質(zhì)的量占比最高，在45%～68%之間；極性氨基酸殘基的物質(zhì)的量占比在31%～55%之間，其中堿性氨基酸殘基(24%)約是酸性氨基酸殘基(9.7%)的3倍。以細(xì)菌細(xì)胞膜為靶標(biāo)的抗菌肽，其疏水性須保持在一定范圍內(nèi)，通常疏水殘基占50%，疏水性過高則會(huì)導(dǎo)致抗菌肽聚集進(jìn)而形成沉淀，使得抗菌活性降低，同時(shí)溶血活性增強(qiáng)；疏水性過低則會(huì)造成抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的插入能力減弱，導(dǎo)致抗菌活性降低[27]。9種天蠶素抗菌肽的疏水性殘基占45%～68%，推測(cè)天蠶素抗菌肽有較高的抗菌活性和較低的溶血活性。

有研究表明，抗菌肽的凈電荷數(shù)與抗菌活性之間存在一定相關(guān)性，帶正電荷的多肽與帶負(fù)電荷的磷脂之間的靜電作用是抗菌肽破壞細(xì)菌的第一步，并且這種靜電作用可增強(qiáng)抗菌肽的選擇性[28]。9種抗菌肽的堿性氨基酸殘基物質(zhì)的量占比均大于酸性氨基酸，使抗菌肽帶正電荷，有利于天蠶素抗菌肽與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜通過靜電作用結(jié)合在一起。

2.3 天蠶素抗菌肽的疏水性/親水性分析

利用ProtScale工具對(duì)天蠶素抗菌肽的親水性/疏水性進(jìn)一步分析，滑窗大小為9，用線性加權(quán)模型。結(jié)果如圖2所示。

圖2 天蠶素抗菌肽的疏水性/親水性分析Fig.2 Hydrophobicity and hydrophilicity analysis of cecropin antimicrobial peptides

從圖2可看出，9種抗菌肽的N-端均在負(fù)值區(qū)域，為親水區(qū)，C-端均在正值區(qū)域，為疏水區(qū)。Gregory等[29]報(bào)道抗菌肽Cecropin-A的N-端含多個(gè)堿性氨基酸，具有親水性，中間存在一個(gè)鉸鏈區(qū)，C-端為疏水區(qū)，與本文中預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，說明ProtScale工具對(duì)抗菌肽的疏水性預(yù)測(cè)具有較高的準(zhǔn)確性。

2.4 天蠶素抗菌肽的兩親性和疏水力矩分析

抗菌肽的兩親性結(jié)構(gòu)在多肽與細(xì)菌相互作用過程中發(fā)揮重要作用，幾乎所有的抗菌肽與細(xì)胞膜作用時(shí)都會(huì)形成兩親性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增強(qiáng)其破膜能力[30]。兩親性使得氨基酸在螺旋的側(cè)面上形成疏水力矩，因此多肽的疏水力矩可用來反映其兩親性[31]。利用HeliQuest軟件預(yù)測(cè)天蠶素抗菌肽的疏水力矩(μH)，結(jié)果如表4所示。

從表4可看出，Cecropin-P4的疏水力矩最小，為0.157，Cecropin-C的疏水力矩最大，為0.334，其余7種肽的疏水力矩在0.25左右，因此推測(cè)Cecropin-C的破膜能力最強(qiáng)。

表4 天蠶素抗菌肽的疏水力矩Table 4 Hydrophobic moment (μH) of cecropin antimicrobial peptides

螺旋輪是研究多肽α-螺旋結(jié)構(gòu)的有效工具，可直觀地反映多肽極性面和非極性面的氨基酸分布，有利于更好地分析多肽的兩親性[32]。利用NetWheels工具繪制了天蠶素抗菌肽的螺旋輪圖，如圖3所示。從圖3可看出，天蠶素抗菌肽的疏水性氨基酸和親水性氨基酸分別相對(duì)集中地分布在疏水區(qū)和親水區(qū)，使整個(gè)分子呈現(xiàn)兩親性α-螺旋的結(jié)構(gòu)。Nielsen等[33]研究表明天蠶素抗菌肽具有兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，通過膜損機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗菌目的，和本文中預(yù)測(cè)結(jié)果基本相符。

2.5 天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)在抗菌肽發(fā)揮抗菌作用過程中起重要作用。Lv等[34]對(duì)豬源抗菌肽PMAP-36的結(jié)構(gòu)、抗菌活性及作用機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明PMAP-3的α-螺旋區(qū)為與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用的區(qū)域。利用HNN預(yù)測(cè)工具對(duì)天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，表5為抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)中各成分的含量，圖4為抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布圖。

表5 天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成Table 5 Predicted secondary structures of cecropin antimicrobial peptides %

注：h代表α-螺旋；c代表無規(guī)卷曲；e代表延伸鏈。圖4 天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)分布圖Fig.4 Secondary structure distribution diagrams of cecropin antimicrobial peptides

從表5可看出，9種天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)均以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主，含量在42.86%～67.74%之間，無規(guī)卷曲含量在22.22%～40.00%之間。Cecropin-C、Cecropin-D無延伸鏈，其他抗菌肽延伸鏈含量較低。推測(cè)天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)卷曲為主。從圖4可看出，Cecropin-A、Cecropin-B、Cecropin-P1、Cecropin-P2、Cecropin-P3的α-螺旋結(jié)構(gòu)主要位于N-端；Cecropin-C、Cecropin-D、CecropinXJ、Cecropin-P4的N-端和C-端均含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，且中間位置存在α-螺旋的中斷者，構(gòu)成螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)。Boman等[15]采用圓二色和二維核磁共振對(duì)天蠶素抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明天蠶素抗菌肽分子結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)α-螺旋，中間由丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸(Ala-Gly-Pro)組成的鉸鏈區(qū)連接，形成螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)。Giacometti等[35]同樣報(bào)道了天蠶素抗菌肽具有螺旋-卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)，并通過試驗(yàn)表明該結(jié)構(gòu)對(duì)抗菌肽的穩(wěn)定性或抗菌活性具有重要作用。本文中利用HNN工具預(yù)測(cè)的天蠶素抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)[15，35]報(bào)道的相符。

2.6 天蠶素抗菌肽的信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽是分泌性蛋白上的一段富含疏水性氨基酸的肽段, 用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。為了在各系統(tǒng)中表達(dá)天蠶素抗菌肽，本文中使用SignalP-5.0工具預(yù)測(cè)抗菌肽是否存在信號(hào)肽，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示9種天蠶素抗菌肽不存在信號(hào)肽，推測(cè)其屬于非分泌蛋白。

跨膜區(qū)即蛋白質(zhì)序列中能跨越細(xì)胞膜的區(qū)域，通常為α-螺旋結(jié)構(gòu)，含有20～25個(gè)氨基酸殘基，在細(xì)胞中起信號(hào)傳導(dǎo)或轉(zhuǎn)運(yùn)通道等功能。通過對(duì)抗菌肽的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)，能夠?qū)ζ洚愒幢磉_(dá)提供指導(dǎo)。使用在線軟件TMHMM、TMpred 預(yù)測(cè)天蠶素抗菌肽的跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，天蠶素抗菌肽沒有跨膜區(qū)，推測(cè)其可能屬于膜外蛋白，通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用而發(fā)揮殺菌作用。Peng等[36]研究表明，天蠶素抗菌肽通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，使細(xì)胞膜的滲透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌死亡，與本文中預(yù)測(cè)的抗菌機(jī)制相符。

2.7 天蠶素抗菌肽的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位即某種蛋白或某個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的存在部位，有助于蛋白質(zhì)功能的初步判斷。利用TargetP-2.0 Service在線軟件對(duì)天蠶素抗菌肽進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅Cecropin-A、Cecropin-P4定位于線粒體，其他抗菌肽可能定位于細(xì)胞外。因此，推斷Cecropin-A、Cecropin-P4主要在線粒體中發(fā)揮生物學(xué)作用，其他7種抗菌肽在細(xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.8 天蠶素抗菌肽的糖基化和磷酸化位點(diǎn)

蛋白質(zhì)糖基化對(duì)其功能具有重要影響，不僅影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、活性、運(yùn)輸和定位，而且在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子識(shí)別、免疫等過程中發(fā)揮重要作用[37]。經(jīng)預(yù)測(cè)，9種天蠶素抗菌肽糖基化位點(diǎn)的最高評(píng)分均低于0.5，推測(cè)天蠶素抗菌肽不存在糖基化位點(diǎn)。

蛋白質(zhì)磷酸化是生物界最普遍、研究最為深入的一種蛋白翻譯后修飾，在生物的整個(gè)生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[38]。利用NetPhos 3.1 Server對(duì)天蠶素抗菌肽的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果見表6。

從表6可看出，除Cecropin-A、Cecropin-C不存在磷酸化位點(diǎn)外，其他7種抗菌肽均存在磷酸化位點(diǎn)，且有的位點(diǎn)可被多種激酶磷酸化，如Cecropin-P4 第19位的絲氨酸可被unsp、PKA、cdc2激酶磷酸化，表明該抗菌肽在該位點(diǎn)被激酶磷酸化后，實(shí)現(xiàn)其生物功能。

3 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法對(duì)9種天蠶素抗菌肽進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，預(yù)測(cè)結(jié)果表明天蠶素抗菌肽為陽離子兩親性多肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較高。推測(cè)天蠶素抗菌肽在與細(xì)菌作用過程中，抗菌肽首先通過靜電作用吸附聚集在細(xì)菌表面，然后抗菌肽的疏水端通過疏水作用插入磷脂雙分子層中，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)菌死亡。經(jīng)預(yù)測(cè)，天蠶素抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性，預(yù)示著在食品防腐保鮮方面具有較大的應(yīng)用空間。天蠶素抗菌肽沒有信號(hào)肽、跨膜區(qū)和糖基化位點(diǎn)；除Cecropin-A和Cecropin-C無磷酸化位點(diǎn)外，其余抗菌肽存在1～6個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這對(duì)天蠶素抗菌肽的生物學(xué)功能具有重要作用。雖然利用生物信息學(xué)方法可大大降低抗菌肽的篩選或預(yù)測(cè)成本，且能得到較為滿意的結(jié)果，但仍需進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)來驗(yàn)證。本研究為深入研究天蠶素類抗菌肽的功能、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為新型抗菌肽的設(shè)計(jì)改造提供了思路。